ex vivo器官形成における一次繊毛形成を研究するためのオルガノイドの三次元イメージング

サマリー

幹細胞由来オルガノイドは、哺乳類組織における器官形成中の幹細胞の自己複製と分化を調節する分子および細胞プロセスの解析を容易にします。ここでは、マウス乳腺オルガノイドにおける一次繊毛の生物学の解析のためのプロトコールを紹介します。

要約

オルガノイドは、幹細胞由来の三次元構造であり、臓器の複雑な構造と生理機能を 生体外で 再現します。したがって、オルガノイドは、一次繊毛形成や繊毛シグナル伝達など、哺乳類の幹細胞の自己複製と分化を制御するメカニズムを研究するための有用なモデルを表しています。一次繊毛形成は、さまざまな組織における幹細胞の自己複製および/または分化を制御する重要な細胞シグナル伝達センターである一次繊毛を組み立てるダイナミックなプロセスです。ここでは、ライトシート顕微鏡用の全マウントマウス乳腺オルガノイドにおける細胞系譜および初代繊毛マーカーの免疫蛍光染色のための包括的なプロトコールを紹介します。本稿では、オルガノイドにおける一次繊毛の集合体と長さを定量的に解析するための顕微鏡イメージング法と画像処理技術について述べる。このプロトコルにより、複雑な三次元構造における一次繊毛の精密な解析が可能となります。この方法は、正常組織および遺伝子組み換え幹細胞、健康な組織および病理組織に由来する乳腺オルガノイドの一次繊毛および繊毛シグナル伝達の免疫蛍光染色およびイメージングに適用でき、健康および疾患における一次繊毛の生物学を研究することができます。

概要

多細胞生物の発生と成体組織における恒常性の維持は、幹細胞の自己複製と分化との間の微調整された制御に存在し、幹細胞は時間と空間で正常組織の発達と再生を指揮します¹。この規制の破壊は、発達異常と癌を引き起こします²。したがって、幹細胞の自己複製と分化を指揮する分子および細胞メカニズムを理解することは、発生生物学およびがん生物学において重要な関心事です。

近年、組織幹細胞が三次元オルガノイドを作製するex vivo器官形成法の開発により、哺乳類の器官形成における幹細胞の動態や、シャーレ内での組織恒常性の維持を研究する能力が一変しました³。オルガノイドは、これらのプロセスを研究するための面倒な遺伝子改変動物モデルに代わる優れた選択肢です。多くの臓器の組織幹細胞からのオルガノイドの開発のためのプロトコルが^{現在開発されており}3、これには小腸および結腸、胃、肝臓、膵臓、前立腺、および乳腺³が含まれる。さらに、オルガノイド形成幹細胞における体細胞ゲノム編集技術の開発により、オルガノイド形成幹細胞の生物学的メカニズムを制御する分子的および細胞的メカニズムを迅速に解明することが可能になりました^4,5。

一次繊毛は、さまざまな組織の幹細胞および/または分化細胞の表面に組み立てられる微小管ベースの構造^です6。これは一般に非運動性であり、セル⁷ごとに単一の構造として組み立てられる。一次繊毛形成は、一次繊毛⁷を組み立てるダイナミックなプロセスです。細胞表面では、繊毛は細胞シグナル伝達プラットフォーム⁸として作用する。したがって、一次繊毛は、脳^9,10、^乳腺^4,11、脂肪組織¹²、および嗅上皮¹³を含む多くの組織において、幹細胞の自己複製および/または分化の主要な調節因子として作用すると考えられている。一次繊毛形成および/または繊毛シグナル伝達は、異なる細胞系統および異なる発生段階で動的に調節されています^4,13,14が、その根底にあるメカニズムは依然として大部分が決定されていません。

生体外臓器生成は、一次繊毛形成や繊毛シグナル伝達など、幹細胞生物学を制御する分子および細胞メカニズムに関する基礎知識の発展に有望であることを示しています。しかし、それは、シングルセルレベルおよび細胞内スケールでホールマウントオルガノイドを適切にイメージングする能力に依存しています。私たちは最近、マウス乳腺幹細胞由来オルガノイドモデルを用いて、一次繊毛がマウス乳腺幹細胞オルガノイド形成能を正に制御していることを示しました⁴。ここでは、ex vivo organogenesis中のライトシート顕微鏡による一次繊毛の3次元解析を可能にする、全マウントマウス乳腺オルガノイド(図1A、B)の免疫蛍光染色のための包括的なプロトコールを紹介します。共焦点顕微鏡法によるオルガノイドの免疫蛍光染色およびイメージングのための代替方法が最近発表されました^15,16。このプロトコールでは、ライトシート顕微鏡によるオルガノイドの調製とイメージングに焦点を当てています。

プロトコル

注:以下のプロトコールは、96ウェルプレートの5ウェルで増殖し、一緒にプールしたオルガノイド(> 100オルガノイド)の染色に推奨されます。オルガノイドはマウスの乳腺幹細胞に由来しました。ドナーマウスは、レンヌ大学(フランス)の動物管理委員会によって承認されたプロトコルに従って飼育され、取り扱われました。

1. 試薬

1. 固定液を調製するには、125 μL の 16% パラホルムアルデヒド (PFA) 市販の水溶液を 375 μL のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で希釈して、4% PFA 溶液を生成します。
   注意: 化学物質のフードの下で有毒物質であるPFAを操作してください。
2. 透過化バッファーを調製するには、1.5 μL の Triton X100 を 500 μL の PBS で希釈し、0.3% Triton X100 溶液を調製します。
3. ブロッキングバッファーを調製するには、1.5 μL の Tween-20 と 75 μL の正常ヤギ血清を PBS で希釈し、5% ヤギ血清-0.1% Tween 20 溶液を生成します。
4. ライトシート封入剤を調製するには、1 gの超高純度低融点アガロースを100 mLのdH20またはPBSに65°Cで溶解します。 1 mLのアリコートを調製し、室温で保存します。

2. オルガノイドの回収

1. 培養ウェルからオルガノイドを低結合ポリマー1.7 mLチューブに移し、ウェル内で3回ピペッティングした後、端をカットしたFBSコーティングチップ(先端の最小直径1.5 mm)を使用します。
   注:コーティングにより、オルガノイドが先端に付着するのを防ぎます。低結合ポリマー材料により、染色手順全体を通じてチューブの側面へのオルガノイドの付着を減らすことができます。
2. チューブにPBSを充填し、350 x g で3分間スピンダウンします。上清を取り除きます。

3. 固定、透過化、ブロッキング

1. オルガノイドを4% PFAの500 μLに再懸濁します。室温で30分間インキュベートします。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。
   注:このステップ以降は、オルガノイドのペレットに触れずに、オルガノイドのペレットにバッファーを追加するだけで、オルガノイドをさまざまなバッファーに再懸濁します。すべての洗浄ステップを室温で行ってください。
2. オルガノイドをPBS1 mLで3分間洗浄します。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。
   一時停止:固定オルガノイドは、PBSで4°Cに少なくとも1週間保存できます。
3. オルガノイドを500 μLのPBS-Triton X100 0.3%に再懸濁してオルガノイドを透過処理し、室温で30分間インキュベートします。オルガノイドを350 gで30秒間スピンダウンします。
4. オルガノイドを1 mLのPBSで再懸濁して洗浄し、3分間インキュベートします。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。一度繰り返します。
5. オプション:オルガノイドを氷冷メタノール500μLに再懸濁します。-20°Cで10分間インキュベートします。このステップは、特定のセントロソームマーカーの染色に必要になる場合があります。
6. オプション(ステップ5を実施した場合):オルガノイドを1 mLのPBSで3分間洗浄します。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。一度繰り返します。
7. オルガノイドの非特異的抗体結合部位を500 μLのブロッキングバッファー(PBS、5%ヤギ血清、0.1%Tween 20)で再懸濁することにより、オルガノイドをブロックします。室温で1時間30分インキュベートします。350 gで30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。
8. オルガノイドを1 mLのPBSで再懸濁して洗浄し、3分間インキュベートします。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。

4. ラベリング

1. オルガノイドを希釈した一次抗体を含む200 μLのブロッキングバッファーで再懸濁し、穏やかな振とう(水平シェーカーで60 rpm)しながら4°Cで一晩インキュベートします。シェーカーの水平平面に対して45°の角度でチューブを配置します。オルガノイドを染色バッファー内のチューブの底に保持します。
2. オルガノイドを1 mLのPBSで再懸濁して洗浄し、5分間インキュベートします。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。2回繰り返します。
   注:最後のステップで一部のオルガノイドがチューブの側面にくっつくと、遠心分離後の上清の吸引中にオルガノイドが失われることがあります。洗浄ステップでPBSに0.2%(w / v)のウシ血清アルブミン(BSA)を追加すると、オルガノイドの損失が減少する可能性があります。
3. オルガノイドを200 μLのブロッキングバッファーと二次抗体で再懸濁し、穏やかな振とう(水平シェーカーで60 rpm)しながら1時間および30分間インキュベートします。シェーカーの水平平面に対して45°の角度でチューブを配置します。オルガノイドを染色バッファー内のチューブの底に保持します。
   注:Hoechst(またはDAPIやDRAQ5などの他の核色素)は、二次抗体とともにバッファーに添加できます。
4. オルガノイドを1 mLのPBSで再懸濁して洗浄し、5分間インキュベートします。350 x g で30秒間スピンダウンします。上清を取り除きます。2回繰り返します。
   注:最後のステップで一部のオルガノイドがチューブの側面に付着し、遠心分離後の上清の吸引中にオルガノイドが失われる可能性があります。洗浄ステップでPBSに0.2%(w / v)BSAを追加すると、オルガノイドの損失が減少する可能性があります。

5. イメージング用アガロースサンプルの調製

1. 軽いシート封入剤を65°Cでインキュベートして溶かします。 培地が溶けたら、37°Cで5分間インキュベートします。
2. オルガノイドを200 μLのチップを使用して100 μLの封入剤に再懸濁し、チップの先端を切断し(先端の最小サイズ:1.5 mm)、ピペッティングを2回行い、オルガノイドを静置剤に戻します。
3. ガラスキャピラリー(緑色キャピラリー、内径1.5mm)にプランジャーで封入剤を吸い込みます。キャピラリーを室温で5分間インキュベートし、封入剤を固化させます。
   一時停止:キャピラリーは、イメージング前に4°CのPBSに1週間保存できます。

6. イメージング

1. ライトシート顕微鏡(ZEISS Lightsheet Z.1など)を使用して、20倍または40倍の水浸対物レンズでオルガノイドをイメージングします。
   1. ガラスキャピラリーを観察室に置きます。フロントカメラでキャピラリーの位置を特定し、ガラスキャピラリーの先端を検出対物レンズの上限に配置します。
   2. サンプルを選択し、明視野照明でガラスキャピラリーの先端を使用して最適な焦点を設定します。アガロースサンプルをキャピラリーからゆっくりと押し出し、固化したアガロース内にオルガノイドを見つけます。
   3. イメージングするオルガノイドをキャピラリーの先端に近づけて、PBS内のアガロースサンプルの動きを減らします。キャピラリーを回転させて最適なサンプルの向きを設定し、目的のズームを定義します。
   4. 取得モードを選択します。画像化するチャンネルを定義し、ライトシートの適切な向きを設定し、各チャンネルのレーザー出力を設定します(光退色を減らすため、低レーザー出力を使用します)、画像のサイズと目的の照明面を設定します。イメージングパラメータの例:画像サイズ1920 x 1920、照明:両面。
   5. Zスタックモジュールを使用してスタックのZ端を設定し、Zステップサイズを最適に設定することで、イメージするZスタックを定義します。
2. 顕微鏡ソフトウェアの画像処理モジュールを使用して出力ファイルを処理してサンプル内をナビゲートし、Z投影と3D表現を取得します。
3. サンプルを裏返して、別の角度から新しい画像を取得するか、他のオルガノイドを画像化します。
4. インタラクティブな顕微鏡画像解析ソフトウェア(Imarisなど)を使用して画像を解析し、(i)サンプルの3Dでの視覚化、(ii)オブジェクトのセグメンテーション、(iii)オブジェクトの識別と定量分析を可能にします。

結果

生体外 臓器生成法は、哺乳類の組織発生と皿内の組織恒常性の維持を研究する能力を変革しています。一次繊毛形成や繊毛シグナル伝達など、これらのプロセスを調節する分子および細胞メカニズムの解析は、オルガノイドを3次元でイメージングする能力に依存しています。

上記のプロトコルにより、ホールマウント乳房オルガノイドの染色が可能になります。それらは、成体雌マウスからFACS精製された乳腺幹細胞が豊富な基底細胞から生じます(図1A)⁴。この染色手順により、オルガノイドの細胞系譜、中心体、および一次繊毛マーカーを24時間未満で可視化できます(図1B)。オルガノイドの三次元構造の可視化のために説明する免疫蛍光染色およびイメージング手順の強度は、ここではインテグリンα6(CD49fとしても知られる)の染色および可視化を通じて実証されています(図1C)。さらに、...

ディスカッション

ここで紹介する詳細なプロトコルにより、半固体培地で増殖するマウス乳腺オルガノイドの染色とイメージングが可能になります。このプロトコールは、半固体および固体培地で増殖する種々の組織の構造を模倣したオルガノイドの染色におそらく適用可能です。100%マトリゲルで増殖し、上部に培地が加わったオルガノイドの場合、回復と固定のステップはわずかに異なります。培地は培養物から取り除かなければなりません。PBSのクイック洗浄後、固定液(4% PFA)をマトリゲル含有オルガノイドの培養ウェルに直接添加することができます。マトリゲルのオルガノイドは、固定液と室温で30〜60分間インキュベートできます。固定オルガノイドは、固定液に再懸濁した後、染色チューブに移されます。固定液と残留マトリゲルは、遠心分離後、透過化ステップの前に完全に除去する必要があります。オルガノイドの透過化は、プロトコールの重要なステップです。一次繊毛マーカーと中心体マーカーの共染色には、通常、Triton X-100とメタノールのインキュベーションステップが必要です。細胞間接合マーカーや他の細胞骨格タンパク質などの他のマー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗マウスIgG1 647	サーモフィ	ッシャーA21240
抗マウスIgG2A 488	サーモフィ	ッシャーA21131
抗ウサギ 546	サーモフィ	ッシャーA11035
Arl13b	NeuroMab	73-287
EMS 16%パラホルムアルデヒド水溶液、EMグレード	電子顕微鏡科学	15710
FBS	サーモフィッシャー	10270106
gtubulin	Sigma-Aldrich	T5326
Hoechst 33342	サーモフィッシャー	62249
インテグリン a6	バイオレジェンド	313616
ライトシート キャピラリー	ツァイス	701908
ライトシート プランジャー	ツァイス	701998
低結合マイクロ遠心チューブ	バイオサイエンス	27210
ノーマル ヤギ 血清 ブロッキング ソリューション	ベクター ラボ	S-1000
PBS	シグマ-アルドリッチ	p3587
スラッグ	細胞シグナル伝達技術	9585
トリトン-X100	シグマ-アルドリッチ	T9284
トゥイーン-20	ユーロメデックス	9005-64-5
UltraPure 低融点アガロー	サーモフィッシャー	16520050