薄層クロマトグラフィーによるマイコバクテリアの脂質組成の解析

Summary

広範囲のマイコバクテリアの細胞壁の総脂質含有量を抽出するプロトコルが提示される。さらに、異なる種類のマイコール酸の抽出および分析プロトコルが示されている。これらのマイコバクテリア化合物をモニタリングする薄層クロマトグラフィープロトコルも提供される。

Abstract

マイコバクテリア種は、成長速度、色素沈着の存在、固体培地に表示されるコロニー形態、ならびに他の表現型特性において互いに異なることができます。しかし、それらはすべてマイコバクテリアの最も関連性の高い特徴である、そのユニークで疎水性の高い細胞壁を共通しています。マイコバクテリア種には、アラビノガラクタン、ペプチドグリカン、マイコバクテリア種によって異なるタイプのマイコリン酸の長鎖を含む膜共有結合複合体が含まれています。さらに、マイコバクテリアは、フチオセロールジミコセローサイト(PDIM)、フェノール系糖脂質(PGL)、グリコペプチド脂質(GPL)、アシルトレハロース(AT)、またはホスファトリジルイノシトールマンノシド(PIM)などの細胞表面に位置する、非共有結合の脂質を産生することもできる。それらのいくつかは、病原性抗酸菌の病原性因子、または宿主-マイコバクテリア相互作用における重要な抗原脂質と考えられている。これらの理由から、マイコバクテリア感染症の病原性における役割を理解することから、感染症や癌などの他の病理の治療に免疫調節剤として可能な意味まで、いくつかの分野での適用によるマイコバクテリア脂質の研究に大きな関心があります。ここでは、有機溶媒の混合物を用いて固体培地で増殖したマイコバクテリア細胞の総脂質含量およびマイコリン酸組成を抽出して分析する簡単なアプローチが提示される。脂質抽出物が得られると、薄層クロマトグラフィー(TLC)が行われ、抽出された化合物をモニタリングします。実験例は、4つの異なる抗酸菌で行われます:環境の急速に成長している 抗酸菌ブルマエマと抗腸菌、 減衰して成長し遅い マイコバクテリウム・ボビス ・バチルス・カルメット・ゲリン(BCG)と日和見病原体の急速に成長する マイコバクテリウム膿瘍を、 本プロトコルに示す方法が広範囲のマイコバクテリアに使用できることを実証した。

Introduction

Mycobacterium 病原性および非病原性種を含む属であり、その特異な脂質によって形成される疎水性の高い不透過性の細胞壁を有することを特徴とする。具体的には、マイコバクテリア細胞壁には、αアルキルおよびβヒドロキシ脂肪酸であるマイコール酸が含まれており、α枝はすべてのミコール酸(長さを除く)で一定であり、メロミルコレート鎖と呼ばれるβ鎖は、文献と共に記述された異なる機能性化学基を含む可能性のある長い脂肪族鎖である(α、α、meoxyth κ-、エポキシ-、カルボキシ-およびω-1-メトキシ-マイコレート、従って7種類のマイコール酸(I-VII)を生産する¹.また、他の脂質は、重要でない他の脂質も、マイコバクテリア種の細胞壁に存在する。病原種など Mycobacterium tuberculosis, 結核の原因物質² フチオセロール・ジミコセローサイト(PDIMs)、フェノール糖脂質(PGL)、ジ、トリ、ペンタ・アシルトロース(DAT、TAT、PAT)、またはスルフォ脂質などの特異的脂質ベースの病原性因子を産生する。³.抗酸菌表面での彼らの存在は、宿主の免疫応答を修飾する能力と関連しており、したがって、宿主内の抗酸菌の進化および持続性⁴.例えば、トリアシルグリセロール(TAG)の存在は、2-北京のリネ....

Protocol

1. マイコバクテリアからの非共有結合脂質の全量の抽出 (図1)

1. 固体培地から0.2gのマイコバクテリアをスクラッチし、ポリテトラフルオロエトレン(PTFE)ライナースクリューキャップを備えたガラスチューブに追加します。5 mLのクロロホルムと10 mLのメタノール(クロロホルム:メタノール、1:2)からなる溶液を加えます。
   注:有機溶剤を使用する場合は、ガラスの受け手のみを使用してください。プラスチック製の容器は使用できません。また、ボトル用のPTFEライナースクリューキャップが必要です。
   注意:クロロホルムは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
   注意:メタノールは潜在的に有毒で非常に危険な物質です。適切な個人用保護具(実験室用コート、保護眼鏡、ニトリル手袋)を着用したラミナーフローフードに使用する必要があります。
2. マイコバクテリア細胞表面から非共有結合脂質を抽出するために一晩一定の攪拌でチューブを残します。
   注:軌道揺れプラットフォームが利用できない場合、一定の攪拌は、できるだけ頻繁に定期的な手動攪拌によって交換することができます。
3. ガラス漏斗をフィルターペーパーで覆い、有機溶剤をろ過し、ガラス管に入れて集めます。
4. 窒素ガスフラックスを使用して、チュー....

Results

異なるマイコバクテリア種に存在する広範な脂質を示すことを目的として 、M.ボビス BCGは、荒くて成長が遅いマイコバクテリアとして選択された。荒くて急速に成長している M.フォルチュイタム と M.ブルマエ を手順に追加し、最後に 、M.膿瘍 の滑らかな形態も含まれていた。これらの4種は、アシルトレハロース(AT)、G百属、PDIM、PGL、PIM、TDM、TMMなどのマイコバクテリア由来脂質の広いスペクトルを可視化することを可能にします。さらに、4種すべてが異なるマイコチル酸パターンを有する。

マイコール酸抽出プロトコルを実行した後、脂質抽出物を、2つの異なる、等しく有効な溶出系を用いて1D-TLC分析を通して分析した(図3A、B)。第1移動相(図3A)は、n-ヘキサンとジエチルエーテル(85:15)で構成され、プレートを3回実行した。第2移動相はジクロロメ.......

Discussion

マイコバクテリア細胞壁から非共有結合脂質化合物を抽出するためのゴールドスタンダード法として考えられる簡単なプロトコルが提示される。さらに、4つの異なるマイコバクテリアの抽出脂質から1次元および2次元TlCsによる可視化が示されている。

マイコバクテリア細胞の脂質含量を回収するクロロホルムとメタノールの2つの連続した混合物は、最も広く使用されている溶媒混合物23、24、25、26、27、28、29である。この混合物は細胞からの広範囲の極性および極性脂質の回復を可能にする。それにもかかわらず、いくつかの他の方法は、最近Hame.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酢酸	メルク	100063	注意。分析用無水物 EMSURE®ACS、ISO、Reag。Ph Eur
アセトン	カルロエルバ	400971N	注意。ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
Anthrone	Merck	8014610010	Anthrone(合成用)
ベンゼン	カルロエルバ	426113	注意。ベンゼンRPE - 分析用 - ACS 2.5 l
キャピラリーガラス管	Merck	BR708709	BRAND® 使い捨てのBLAUBRAND® マイクロピペット、intraMark
Chloroform	Carlo Erba	412653	CAUTION.クロロホルムRS - HPLC用 - アイソクラティックグレード - エタノール2.5Lで安定化
ドライブブロックヒーター	J.P. Selecta	7471200
ジクロロメタン	カルロ・エルバ	412622	注意。ジクロロメタンRS - HPLC用 - アイソクラティックグレード - アミレン2.5L
ジエチルエーテル	カルロエルバ	412672	注意。ジエチルエーテルRS - HPLC用 - アイソクラティックグレード - 安定化されていない 2.5L
酸エチル	Panreac	1313181211	注意。酢酸エチル(Reag.USP、Ph. Eur。分析用、ACS、ISO
エチルアルコールアブソリュートカル	ロエルバ	4146072	注意。エタノール無水RPE - 分析用 - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
ガラス漏斗	VidraFOC	DURA.2133148 1217/1
ガラス管	VidraFOC	VFOC.45066A-16125	PTFE回収キャップ付きガラス管
メタノール	カルロ・エルバ	412722	注意。メタノールRS - HPLC用 - 金 - 超グラジエントグレード 2.5 L
モリブダトリン酸水和物	メルク	51429-74-4	注意。
モリブデンブルースプレー試薬、1.3%	シグマ	M1942-100ML	注意。
n-ヘキサン	カルロ・エルバ	446903	注意 n-ヘキサン 99% RS - アトラソル - 微量分析用 2.5 L
n-ニトロソ-n-メチル尿素	シグマ	N4766	注意
軌道振とう台	DDBiolab	995018	NB-205L 卓上振とうインキュベーター
石油エーテル (60-80ºC)	カルロ・エルバ	427003	注意。石油エーテル60-80°C;C RPE - 分析用 2.5 L
噴霧器	VidraFOC	712/1
無水	メルク	238597
硫酸 95-97%	メルク	1007311000	注意。硫酸95-97%
TLCチャンバー	メルク	Z204226-1EA	長方形TLC現像タンク、完全なL ×H ×W 22 cm ×22 cm以上;10 cm
TLCプレート	メルク	1057210001	TLC シリカゲル 60- 20x20 cm x 25 u
TLC プレートヒーター	CAMAG	223306	CAMAG TLC プラットヒーター III
トルエン	カルロ エルバ	488551	注意。トルエンRPE - 分析用 - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur.- Reag.USP 1 L
ボルテックス	フィッシャー サイエンティフィック	10132562	IKA Agitador IKA vórtex 3
1-ナフトール	Sigma-Aldrich	102269427	注意。