ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、発達と病気を研究するための強力な脊椎動物モデル生物として登場しています。ゼブラフィッシュは、高度に保存された遺伝(70%の遺伝的相同性および〜84%の疾患関連遺伝子)および基本的な器官形態学的特徴をヒト^1,2と共有する。この保存により、ゼブラフィッシュを使用して、がん^3、4を含むいくつかのヒト疾患をモデル化することができます。

ゼブラフィッシュの取り扱いとメンテナンスは、その小さなサイズ、一年中高い胎児性、および外受精^3、5のためにマウスよりもはるかに簡単で費用対効果が高いです。ゼブラフィッシュ胚は、生後5〜7日間の生き物を必要とせず、発達、感染、および癌^{1、4、6、7}の有効モデルとして使用されてきた。ゼブラフィッシュ胚は、受精後48時間(hpf)で孵化し、すべての器官が形成された自由遊泳動物であり、鼓動心臓および機能的循環系、肝臓、脳、腎臓骨髄^{、1、3などである}。また、現段階では先天性免疫のみが遊びで、適応免疫が未だに発達しており、免疫不全変異体^7,8を使用する必要のないヒト細胞の一般的な効率的な生着が可能^となる。それにもかかわらず、すべてのヒト細胞が等しく⁹を生着するわけではないことに注意することが重要であり、例えば白血病細胞については、貪食細胞(好中球およびマクロファージ)が効率的な生着¹⁰のために枯渇する必要が示された。

ゼブラフィッシュの遺伝的難解性とその初期胚段階の光学的透明性は、単一細胞の生体内イメージングを高解像度で可能にし、したがって、生物学の多様な分野における最先端のイメージング技術の確立を可能にする。さらに、癌の文脈において、これらの特徴は、血管新生および転移性の可能性を研究する、ならびに自然免疫系^{8、9、11、12、13}との相互作用のような宿主と腫瘍相互作用の初期段階のリアルタイム研究に有用である。

短い異種移植片アッセイでは転移性の「進化」の時間はないが、腫瘍細胞の転移能を分析することが可能である(すなわち、その効率は、浸潤、内膜、循環中の生存、飛び出し、および植民地化のような転移的なステップを経て、したがって、生体内^{およびリアルタイム8、11、13、14}でこれらのプロセスを研究する)。

そのライフサイクルの特徴は、癌の個別化医療のためのユニークなモデルとしてゼブラフィッシュを置きます。アッセイは、より短い期間で実行することができ、数週間で得られた結果^7,8,9,9^{,11,12,15,16.}これらのアッセイのセレリティと実現可能性は、医師や研究者に、時間が不可欠なニーズであるがん患者に有用な翻訳結果を得る可能性を提供します。

ゼブラフィッシュ胚異種移植片の生成に成功する試みが増えているにもかかわらず、注射手順の標準化と、注射後の細胞生存率および腫瘍挙動の評価が依然として必要である。

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚におけるヒトがん細胞株の注入とその後の固定、免疫染色、イメージング、腫瘍細胞挙動の定量化に関する明確で詳細なステップバイステップガイドを研究者に提供します。

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)モデルは、欧州動物福祉法、指令2010/63/EU(欧州委員会、2016)およびシャンパリモー魚プラットフォームの標準プロトコルに従って処理され、維持されました。すべての議定書は、シャンパリモー動物倫理委員会とポルトガルの機関組織ORBEA(オルガン・デ・ベム・エティカ動物/動物福祉倫理団体)とDGAV(ディレサン・ジェラル・デ・アリメンタサン・エ・ヴェテリナリア/食品獣医総局)によって承認されました。

注:主な実験を開始する前に、ヒト大腸癌(CRC)細胞株HCT116を練習してください。この細胞株は、(高度に増殖)、非常に効率的に(約95〜100%)を注入し、生着することが容易な(高度な増殖)調製が容易である。過剰な細胞(約12x10⁶ 個の細胞、T-75フラスコ)と余分な魚(400匹の魚)から、訓練中に多くの細胞や魚が失われるため、この技術に堪能になるまで始めます。実験者は、HCT116異種移植片で〜95%の生着が達成されると準備ができています。完全なプロトコルの概略については、 図 1 を参照してください。

1. 注射用のセットアップ

1. 注射の2週間前に、培養中の細胞を拡大する(いくつかの細胞株の注入のための最適なインビトロ合流の詳細なガイドについては表1を参照)。
2. 注射の3日前に、所望の背景のゼブラフィッシュを横切る。

2. 24 時間前に注射

1. ゼブラフィッシュの胚プレート(死んだ胚と未開発の胚をすべて捨てる)をきれいにし、E3培地をリフレッシュします。
2. 細胞培養室では、注入予定のフラスコから細胞培養培地を捨て、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、死んだ細胞を除去し、新鮮な培地を添加する。
3. マイクロインジェクション針、アガロースプレート、ヘアピンなどの注射手順のツールを準備して、注射用の胚を整列させます(図2A-D、下記を詳述)。
   1. マイクロインジェクション針(図2A)
      1. ホウケイ酸ガラス毛細血管(4インチ、OD 1.0 mm、マイクロピペットプーラーにフィラメントなし(熱:≈500;フィル:10;vel:50;12月:60;プル:100)。。
   2. プレートの準備 (図 2B)
      1. _H2 Oで2%アガロースを準備し、加熱し、きれいなペトリ皿の蓋に溶解アガロースの1層を注ぎます。それを重合させ、定規の助けを借りて、胚の整列のために3〜4本のまっすぐなアガロースラインを作ります。
   3. ヘアピンアセンブリ (図2C-D)
      1. ガラスの毛管の中に1本の毛を入れて、約1センチの毛をチューブの外に残します。
      2. 約0.5mmの長さのループを形成するガラスキャピラリーチューブに鉗子の助けを借りて髪の外側の先端をカール。
      3. 毛細管の端をマニキュアの滴で密封します。これは、ループを所定の位置に固定するのにも役立ちます。乾かします。チューブの他の端で手順を繰り返します。
      4. 電気テープを切る(通常の粘着テープよりも抵抗力があり、不浸透性で、硬い)。
      5. テープをキャピラリーの周りに密封して、破損しないようにします。

3. 注射日

1. 孵化した胚を孵化していない卵から分離する。この段階で1xプロナーゼ(0.6mg/mL、 表3)を胚培地に添加すると、孵化を促進することができる。インキュベーターに胚を入れ(28°C)注射するまで入れる。
   注:酵素は孵化した胚に作用し、死亡リスクを高めるので、胚をプロナーゼ溶液に1時間以上放置しないでください。胚の発達段階が、浮腫および死亡率のリスクを回避するために、48 hpf(図3A、A')に対応するものであることを確認してください。
2. 1xトリケーヌ(25x株から)を準備します。
   注:詳細なレシピは 、表3 とゼブラフィッシュ情報ネットワーク - ZFINウェブページ¹⁷で見つけることができます。

4. 注射用の細胞ラベリング

注:細胞のラベリングは、フラスコ内または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心チューブのいずれかで直接行うことができます。詳細については 、「ディスカッション」 を参照してください。

1. 細胞培養培地を取り出し、フラスコを1XPBSで2回洗浄します。
2. フラスコ(2 mL溶液/T75フラスコ)で直接、または酵素剥離後の1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに好ましい脂溶性色素で細胞にラベルを付けます。光への暴露を避け、37°Cで細胞をインキュベートします(条件/解決策については 表1 および 表2 を参照)。
3. フラスコでラベリングする場合
   1. 染料を取り出し、1x PBSで洗浄し、EDTAとセルスクレーパーで細胞を取り外します。
   2. 細胞を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。遠心分離機は300 x g で5分間、ステップ4.5に進みます。
4. 1.5 mLマイクロ遠心分離チューブでラベリングする場合:
   1. 遠心分離機を300xgで5分間、染料を除去し、上清を捨てる。1x PBSで再び洗ってください。
   2. 遠心分離機は300 x g で5分、ステップ4.5に進みます。
5. 上清を捨て、細胞培養培地でペレットを再懸濁します(50μLペレット添加~培地150~200μL)。
6. トリパンブルー排除または他の選択方法を用いてノイバウアーチャンバーを使用して細胞生存率を定量化する。
7. 遠心分離機を300xgで4分間、上清を捨てる。注射媒体の細胞を再中断します。
   注:推奨される細胞濃度(一般的に0.25-0.5x10⁶ セル/μL)および培地は 表1にあります。
8. この時点から、細胞を氷の上に置いておきます。

5. 注入手順

1. 1x Tricaineで5分間胚を麻酔します。
2. プラスチック製のパスツールピペットを使用して、少量(〜50)の麻酔下の胚をアガロースプレートに移し、ヘアピンループの助けを借りて慎重に整列させます。胚の間の距離、特に1個の黄身と次の卵黄の頭部との間の距離を維持するようにしてください(図4A)。
   注:整列する胚の数は、注射を行う研究者の専門知識のレベルによって異なります。いくつかの(〜10-20)から始めます。寒天/アガロースプレートにおける胚の正しい位置の概略については 、図4Aを参照してください。
3. 1-3滴のトリケーヌ溶液をプレートに慎重に加えることによって、アガロースプレートで整列した胚が乾燥しないようにして、死亡率を防ぎます。
4. マイクロ遠心チューブを軽くタップして細胞を再懸濁します。彼らは胚の完全性を損なうことができるので、気泡を避けるマイクロローダーチップを使用して細胞懸濁液で注射針をバックロードします。
5. 空気圧弁(40 psi)を開き、マイクロインジェクターを設置し、マイクロインジェクションニードルをホルダーに慎重に設置します。
   注:次の推奨マイクロインジェクタ設定を使用してください:圧力を保持する - ベント(3 psi)。圧力を排出する - 通気孔。範囲 - 100ミリ秒。
6. 顕微鏡下で#5または類似のDumont鉗子で先端近くのマイクロインジェクション針を切ります。
   注:先端は、細胞が詰まることなく通過し、胚を損傷して細胞を失うことを避けるために十分に鈍く、薄くなければなりません。太いマイクロ注射針の先端は、胚を傷つけると浮腫やゼブラフィッシュの死の形成を促進します.経緯線は針の校正には使用されません。詳細な 説明については、「ディスカッション 」を参照してください。
7. 胚を注入する前に、マイクロインジェクター圧を、ゼブラフィッシュ胚の目の大きさと同様の体積を〜1〜3パルスパルスするまで、最も低い排出圧力で始まるかどうかを試験する。
   注:トレーニングの開始時に可能な限り蛍光体顕微鏡を使用することをお勧めします。これにより、蛍光標識された細胞の同定が容易になります。
8. 胚の黄身の真ん中に慎重に突き刺し、針の角度を下げ、針の先端がペリビテリン空間(PVS)に達するまで慎重に押す(図4B-D)。
9. マイクロインジェクタペダルを押して、PVSに細胞を注入します。胚の目をガイドとして使用してください。心臓浮腫を防ぐために、胚の目の大きさに似た細胞の量と心臓から可能な限り遠くに細胞を注入してみてください。
10. 慎重に針を取り出し、次の胚に移動します。
11. 必要に応じてマイクロインジェクターの圧力を調整します。
    注:セルは詰まりを開始する傾向があるため、圧力が高くなる可能性があります。必要に応じて、圧力を下げながら毛細管を切断(直径を大きくする)することが可能です。
12. 注入した胚を1x Tricaine溶液できれいなペトリ皿(表4)に移し、5〜10分間休ませます。これは傷が閉じる時間を与えるでしょう。
    注:寒天プレートからペトリ皿に胚を移すために、胚の上に1x Tricaine溶液を数滴加え、プラスチック製のパスツールピペットで慎重に収集します。採取した胚を1xトリケーヌ溶液で新しいペトリ皿に落とします。
13. 1x Tricaine溶液を取り外し、新鮮なE3培地を追加します。
14. 34°Cで異種移植片をインキュベートする(ヒト細胞株生存とゼブラフィッシュの発達⁸との間の温度が損なわれる)。

6. 転移アッセイ

1. 約1時間の注入後(hpi)で、注入された胚を蛍光体顕微鏡でスクリーニングし、異種移植片を2つのグループに分類します(図5A)または循環中の細胞の存在(図5B)。。
   注:心臓または循環で1つの癌細胞しか検出されない場合でも、循環中の細胞を持つ異種移植片のグループにこれらの異種移植片が含まれる。あるいは、細胞を循環に直接注入して、この群の異種移植片の数を増やすことができる。

7. 1日ポストインジェクション

1. 蛍光体型顕微鏡では各胚を注意深く分析し、適切に注射された腫瘍を持つものを選択する(図6)。
   注:必要に応じて、スクリーニング前にトリケーヌ1X溶液で注入された胚を麻酔してください。
2. 次の胚/異種移植片を捨てる(図6A-A'):
   • 腫瘍/異常形態/死なず、
   • 心臓および/または黄身浮腫
   • 卵黄の腫瘍細胞のみで、
   •非常に少数の癌細胞を有する。
3. 腫瘍のサイズに応じて選択した異種移植片を並べ替えます。比較のために目のサイズを使用します(図6B-B'、6C)。
   • 眼の大きさよりも小さい腫瘍(+)
   • 眼と同じ大きさの腫瘍(++)
   • 眼の大きさよりも大きい腫瘍 (+++).
4. 所望の実験レイアウトに従って異種移植片を配布し、薬物アッセイ(対照対薬物等)を開始する。薬物およびE3培地を毎日交換する(表4)。
5. アッセイの終わりまで34°Cの温度を維持する異種移植片をインキュベートする。

8. 4日投与後注射

1. アッセイの最終日に、1x Tricaine溶液で異種移植片を麻酔し、寒天プレートに慎重に位置合わせします。
   注:死んだ、または腫れた異種移植片を捨てよ。薬物治療およびいくつかの腫瘍細胞は、毒性を誘発し、最終的に異種移植片の死亡率を引き起こす可能性がある。これらの異種移植片は、生着定量のために考慮されていません。
2. 生着の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各生きた異種移植片を分析し、PVSにおける腫瘍の存在(図6D)/存在(図6E)を評価する。
   
3. 転移の割合を決定するには:蛍光体顕微鏡上で各異種移植片を分析し、以前に定義された2つのグループの尾状造血組織(CHT)における微小転移の有無を評価する(CIRCおよびNO CIRC、図6F)
   
4. 実験のセットアップによると、目的の異種移植片を選択し、25倍トリケーヌでそれらを安楽死させる(表3)。
5. 室温(RT)または4°Cで一晩で少なくとも4時間4%ホルムアルデヒド(FA)でそれらを固定します。
   
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抗がん療法を研究するためのツールとしてのゼブラフィッシュ異種移植片。
HCT116大腸癌細胞株をCM-DiIで標識し、受精後2日のPVS(dpf)胚に注射した。注射後、ゼノグラフトを34°Cでインキュベートし、ゼブラフィッシュの発生を損なうことなく腫瘍細胞の増殖を可能にする温度である。翌日、異種移植片をPVS内の腫瘍塊の有無に応じてスクリーニングした(適切に注入されなかったゼブラフィッシュは廃棄され、安楽死させた)(図6A-A')異種移植片は腫瘍サイズ(図6B-B')に従ってグループ化され、非治療コントロールおよびFOLFIRI化学療法(0.18 mMフォリニン酸、0.08 mMイリノチンカンおよび4.2 mMフルオロウラシル(5-FU)で無作為に分布した(6ウェルプレート:ウェルあたり12個の異種移植片)。

コントロールE3と薬物は毎日交換され、死んだゼブラフィッシュは廃棄された。4dpi、及び3日後の治療(dpt)と、プロトコルのステップ8.2のように生着を定量した。生着は、4dpiでPVSに腫瘍塊を提示する異種移植片の頻度と考えられる。例えば、実験の最後に40頭の生きた幼虫があり、40頭のうち35頭がPVSに腫瘍を存在させる場合、生着率は87.5%である。異種移植片は安楽死させ、免疫蛍光と共焦点顕微鏡による腫瘍サイズとアポトーシスを評価するために固定した。

免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ3抗体(Asp175)(ウサギ、1:100、#CST 9661)およびDAPI(50μg/mL)を用いて核に対抗する。図のスタック データセット (5um ごと) は、ステップ 12で説明したように、フィジー/ImageJ ソフトウェアを使用して実行される LSM710 共焦点顕微鏡とデータ解析で取得されました。有糸分裂指数の定量化、 アポトーシス(活性化カスパーゼ3の%)および腫瘍サイズは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少(マンホイットニー試験、P<0.0001)およびアポトーシスの有意な誘導(マンホイットニー試験、P<0.0001)を誘発することを明らかにした<腫瘍サイズの54%の減少を伴う(P0.001) 図(P0.001)図(8-9)

これらの特徴は、高スループット表現型薬物スクリーンにおいて有用であるとともに、短時間で複数の癌治療の細胞固有および生理学的効果をテストする。

ヒト特異的抗体によるヒトゼブラフィッシュ異種移植片の特徴
すべての異種移植片モデルと同様に、細胞を誤って同定する危険性がある。例えば、マクロファージはヒト癌細胞を食食細胞に食作用させ、親油性色素で標識し、ゼブラフィッシュ宿主体に沿って移動し、したがって、これらの細胞は腫瘍微小転移と間違えることができる。したがって、ヒトHLA、ki-67またはヒトミトコンドリア(hMITO)などの特定のヒト抗体を用いて異種移植片を標識することは、初期特性評価のために重要であり、また腫瘍細胞の形態を知るにも重要である(図9F-I)。

ゼブラフィッシュ異種移植細胞間相互作用を研究する。
ゼブラフィッシュ異種移植モデルのもう一つの大きな利点は、異なる腫瘍細胞の相互作用を研究し、各タイプの細胞が他の細胞の挙動にどのように影響するかを分析することができるということです。異なるヒト癌細胞(同じ腫瘍または異なる腫瘍からの異なるクローン)を共注射することができる。この例では、同じ患者に由来する2つのCRC細胞株を異なる親油性色素で標識し、注射に対して1:1の比率で混合した(図9J-K')。

同じ移植片上でヒト細胞株を混合する(ポリクローナル腫瘍を発生させる)場合、この結果としてDiO色素を使用して非特異的な二重染色を行うことを避ける(表2)。代わりに、例えば、CM-DiI(セルライン#1)を緑色のCMFDA(セルライン#2)、CM-DiI(セルライン#1)、深い赤(セルライン#2)(表2、 図9J-K')を使用して、実験の終わりに集団を容易に識別します。腫瘍内の各クローンの頻度を定量化するには、フィジーで2種類の異なるカウンタータイプを使用して各クローンを識別し、その後、全細胞数(全クローンの合計)で除算し、各クローンの相対分率(%)を得る。

図 1.ゼブラフィッシュ異種移植プロトコルのフローチャート概要この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.ゼブラフィッシュ胚注射用材料:A. ホウケイ酸針 B. 2%アガロースプレート。 C ヘアピンループ D. ヘアピンループを作る手順 :1.ガラス毛管の中に1本の毛を置き、チューブの外に約1センチメートルの毛を残します。 2-3. 長さ0.5mmのループを形成するガラスキャピラリーチューブに鉗子の助けを借りて髪の外側の先端をカールします。 4.マニキュアの滴で毛細管の端をシールします。 5-6.キャピラリーの周りに電気テープを貼り付け、破損から保護します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.受精後48時間(48hpf):A-A'におけるゼブラフィッシュ胚の代表的な実体顕微鏡画像。開発の48 hpfでゼブラフィッシュ胚の正常形態, マイクロインジェクションB-B'の準備ができて.48 hpfでマイクロインジェクションの十分な発達段階を達成しておらず、すでにある程度の心臓浮腫(黒矢印)と膨らんだ黄身を呈するゼブラフィッシュ胚の形態。A'とB'はそれぞれAとBの倍率です。スケールバーは500 μmを表します。

図 4.ゼブラフィッシュマイクロインジェクションプレートの概略表現:A. 3%寒天/2%アガロースプレートにおける麻酔化胚の整列。 B. 受精後2日間のゼブラフィッシュ胚のグラフィック表現は、ペリビテリン空間(PVS)を示す黒矢印を有する。 C および D. 癌細胞は、48時間の受精後胚のペリビテリン空間(PVS)に注入されたPVSに異なる角度で注入することができる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 5.転移アッセイ。1時間の注射後(1hpi)注射胚は、循環中の腫瘍細胞の不在(NO_circ)または存在(CIRC)に従ってソートされる。注射後4日で、微小転移を呈する両群の異種移植片の数を定量化する。(A)NO_circ群の細胞は、微小転移を形成するためにすべての転移ステップを受けなければならなかったが、CIRCグループ(B)の細胞は転移カスケードの最後のステップのみを受ける。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 6.注射後1日および注射後4日間における異種移植片の代表的な蛍光顕微鏡画像。蛍光タンパク質TdTomatoを発現するヒト癌細胞(赤色)を、2dpfゼブラフィッシュ胚にマイクロインジェクションした。1dpiでは、注入された胚をスクリーニングし、ひどく注入されたものまたは腫を浮腫で捨てる(A-A')腫瘍サイズに応じてよく注入された胚を並べ替える(B-B')。C. SW620異種移植片において1dpiで異なる腫瘍サイズカテゴリーに存在する細胞の総数の定量を代表する。各ドットは、4 dpi 12.At セクションで説明されているように定量化された異種移植片を表し、幼虫をスクリーニングし、異なるクラスを定量化する:腫瘍なし(D);PVS(E)の腫瘍と、CHTの微小転移を有する(F)スケールバーは500 μmを表します。

図 7.共焦点イメージング用の異種移植片の取り付けの概略表現カバースリップYのラベリングの例、カバースリップXの水色のラインは、取り付け媒体の漏れを防ぐために石油ゼリー/シリコーングリースが適用される周囲を表します。2.共焦点イメージング用カバースリップX上の異種移植片のアライメントの例。3.水性取り付け媒体(青い矢印)はカバースリップX.4の上にカバースリップYを結合するために使用されます。適切にマウントされたカバーリップの例。5.カバーリップは、ガラススライドの上に置かれ、透明なテープで固定されます。6.共焦点イメージングの準備ができて取り付けられた異種移植片。BioRender.com で作成されたこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 8.腫瘍サイズの共焦点顕微鏡画像定量の視覚的表現4日後注射AにおけるHCT116異種移植片の共焦点像。5 μm間隔で取得したDAPIチャネルの一連のzスタックスライス。赤い破線は、セルカウントに使用される 3 つの代表的なスライスを囲みます。B.ImageJ/フィジーソフトウェアのセルカウンタープラグインを使用したDAPI核定量の図。C-E.DAPIで、またはホスホヒストンH3抗体(緑色)を用いて、有糸分裂体の数値を可視化/定量することができる腫瘍内の単一細胞分解能の例。DとEはCの倍率である。スケールバーは50 μmを表します。

図 9.代表結果。A-E.HCT116大腸癌細胞株をヴィブラントCM-DiIで標識し、受精後2日間のPVS(dpf)胚に注射した。注射後、異種移植片を34°Cでインキュベートした。 1dpiでは、異種移植片をスクリーニングし、非治療コントロールおよびFOLFIRIで無作為に分配し、3日間連続して治療し、4dpiで固定した。A.免疫蛍光をアポトーシス細胞を検出するために、抗切断カスパーゼ3抗体および核対抗にDAPIを用いて行った。有糸分裂指数Cの定量化、アポトーシス(活性化カスパーゼ3の%)D、および腫瘍サイズEは、FOLFIRIが有糸分裂の有意な減少(マン・ホイットニー検査、P<0.0001)およびアポトーシスの有意な誘導を誘発することを明らかにした(マン・ホイットニー検査、P<0.0001)は腫瘍<の54%の縮小を伴う。分析される異種移植片の数は図に示され、各ドットは1つの異種移植片を表す。F-H.PVSおよびCHT Iにおける緑色のヒト特異的マーカー(ヒトHLA、ki67およびhMITO)で標識された4日後の注射後の大腸癌異種移植片の代表的な画像。J-J'.親油性染色CellTrackerディープレッド(Cy5 - white)、CellTracker Green CMFDA(488 - 緑色)およびDAPIカウンターステインで標識された2つの異なるヒト大腸癌細胞株を注入したポリクローナル異種移植片の共焦点画像。K-K'.親油性染色セルトラッカーディープレッド(Cy5 - 白)、ヴィブラントCM DiI(594 - 赤)およびDAPIカウンターステインで標識された2つの異なるヒト大腸癌細胞株の共焦点画像。スケールバーは50 μmを表します。

表1:複数の細胞株の注入に最適なインビトロ合流

表2:染料と条件

表 3: ペトリ皿オプション

表 4: ソリューションの構成

何一つ