高分解能 C18 RP-nano-HPLC カラムの頑健な充塡法

サマリー

ここでは、LC-MS/MS プロテオミクスワークフローを使用してペプチド特性評価を行うための低コストの逆相ナノフロー液体クロマトグラフィーカラムを作成するためのプロトコルを提示し、評価します。

要約

生体サンプルに蔓延する複雑さが高いため、効果的に分析するには、高感度と高分解能のクロマトグラフィー分離が必要です。ここでは、従来のボトムアッププロテオミクスワークフローで質量分析計に導入して検出する前に、分析ペプチドのオンライン分離のためのナノフロー逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)カラムを調製するための、堅牢で再現性があり、安価なプロトコールを紹介します。実験の目的や分離する分析種の化学的特性に応じて、最適なカラムパラメーターは、内径または外径、長さ、粒子径、細孔径、固定相粒子の化学的性質、および先端に内蔵されたエレクトロスプレーエミッターの有無が異なる場合があります。社内のカラムパッキングシステムにより、目的の特性を持つカラムを迅速に製造できるだけでなく、プロセスのコストも劇的に削減できます。ここで説明するC18 AQ(水性)フューズドシリカカラムの充填に最適化されたプロトコールは、分析種の効果的な分離を達成するための幅広い液体クロマトグラフィー装置に適合します。

概要

HPLCカラムは、製薬、医学、環境研究の分野における生産性に大きく貢献しています1,2,3,4。高品質のクロマトグラフィーカラムを利用できることは、複雑な分析種の分画における極めて重要なステップです。ショットガンプロテオミクスでは、エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量分析(MS)をナノフロークロマトグラフィー5,6,7,8に結合することにより、高い分析感度が日常的に達成されます。このアプリケーションでは、数千種類のペプチドを効率的に分離することが最も重要であり、質量分析計は高い感度と分解能で分析種を同定および定量できます。

質量分析アプリケーション用のカラム充塡剤の分野は、固定相の形態、溶媒と粒子の相互作用、およびハードウェア設計に関連する基本的なカラム充塡原理の理解が進歩し、複雑な生物学的環境における幅広い生体分子の詳細な特性評価が可能になり、近年驚異的な成長を遂げています9,10,11,12,13,14 で囲まれています。LC-MS 用の分析カラムのパッキングにおける実用的な考慮事項を強調する取り組みにより、プロテオミクスラボは、最大のパフォーマンスを約束しながら、特定の関心を満たすための社内パッキングシステムを開発する道を開きました 15,16,17,18。

内径が50〜150μmの範囲で、端がテーパー状のナノスプレーカラムは、エレクトロスプレーイオン化の目的に適しています。ショットガンプロテオミクスの分野では、分離は通常、充填された非極性固定相、最も一般的には疎水性炭素鎖結合シリカ(C8-C30)を流れる溶媒グラジエントを使用して行われ、粒子サイズは^1.7〜3.5μmの間で変化します19,20,21,22。溶出する分析種は、カラム内に統合されたESIエミッターを介して放出され、溶液相分析種からガス状イオンへの軟質イオン化が保証されます。LCカラムとESI-MSの結合により、タンデム質量分析のバイオメディカルサイエンスにおけるプロテオミクス戦略への応用が大幅に進歩しました。

内径が狭いLCカラムは、高口径のマイクロフローカラムに比べてクロマトグラフィーピークが狭くなり、感度が高くなるため、プロテオミクスワークフローに特に有利です。市販のプレパックLCカラムは、その利便性と使いやすさから魅力的なオプションですが、社内のオプションよりも法外に高価で柔軟性に欠ける可能性があります。この研究の目標は、溶融シリカキャピラリーとプロテオミクスアプリケーション用の社内構築圧力爆弾システムを使用して、内径の狭い逆相HPLCカラムを調製するための、技術的にシンプルで低コストのスラリー充填アプローチを説明することです。

プロトコル

1.キャピラリーチップの準備

1. セラミック劈開石を使用して、内径(ID)75μm、外径(OD)360μmのポリイミドコーティングされた溶融シリカキャピラリーを約60〜70cm切断します。
2. キャピラリーをその長さのほぼ中央で手で持ち、指の間に4〜5 cmの隙間を残し、アルコールランプの炎の上で回転させながら隙間の領域を加熱します。メタノールを染み込ませた低糸くずのティッシュを使用して、ガラスが見えるまで焦げた部分をきれいに磨きます。(図1)。
   注:ポリイミドコーティングされた溶融シリカキャピラリーの4〜5 cmは、レーザープーラーにロードする前に露出させて研磨する必要があります。
3. ESI用の円錐形エミッタを引っ張るには、熱値300(レーザー出力の2ワットに相当)、速度10(0.25 mm / sに相当)、遅延180ミリ秒の特別なプログラム設定のレーザーチッププーラーを使用して、直径1~5μmのチップを取得します(図2 および 図3A)。キャピラリーの研磨された部分をレーザープーラーにロードしてプレスプルすると、2本の空のキャピラリーカラムを充填する準備が整います。
   注:どのステップでもチップの頻繁な検査は、顕微鏡を使用して行われます。設定はレーザープーラーによって異なる可能性が高く、経験的に決定する必要があります。

2. こて先の重合/エッチング

1. 固定相粒子を毛細管内に保持するために、2つのケイ酸カリウム溶液とホルムアミドの混合物から多孔質フリットを調製します。使用直前に溶液を2mLチューブで調製し、ボルテックスを用いて混合する。
   1. SiO₂/K₂O比が2.50(w / w)、および1.65(w / w)およびホルムアミドの2つのケイ酸カリウム溶液をそれぞれ1:3:1(v / v / v)の比率で混合します。たとえば、100 μL のケイ酸カリウムを SiO₂/K₂O 比 2.50 (w/w) と混合し、300 μL のケイ酸カリウムを SiO₂/K₂O 比 1.65 (w/w)) と混合し、100 μL のホルムアミドを混合した後、ボルテックスします。この溶液は加熱すると重合し、多孔質のフリットを生成します。
2. レーザーで引っ張った毛細管先端をフリット懸濁液(沈殿物ではない)の透明な母液に約10〜20秒間浸し、毛細管現象により先端に約5mm浸透させます。チップの幅によっては、チップをフリット溶液に長時間浸しておく必要がある場合があります。一般に、チップの幅が広いほど、溶液がチップにより速く入ることができるため、浸漬時間は短くなります。
3. 先端に沿って熱いはんだごて(350°Fに設定)を置き、顕微鏡下でキャピラリーを検査しながらフリット溶液の重合を開始します。重合前(図3A)と重合後(図3B)の引っ張られた先端については、図3を参照してください。
4. フリット重合後のエミッターの詰まりを防ぐため、カラムチップを 50% フッ化水素酸(HF)溶液に 5 分間浸漬します(セットアップを 図 4 に示します)。また、HFエッチングは、柱にフラットな円錐形の形状を付与し、その寿命を延ばします。HFエッチング後、カラムの先端を最初にHF中和剤で、次に水で十分に洗浄して、酸との接触から保護することを確認します。
   注意: HFは非常に危険で腐食性の化学物質です。取り扱いの際は、暴露を防ぐために細心の注意を払うことをお勧めします。HFは、「危険!急性毒素」。
   1. 安全のため、HFを取り扱うときは、ニトリル手袋とネオプレン手袋の二重層に加えて、通常の白衣と難燃性の白衣の両方を使用してください。
      注:毛細血管の先端をフリットすることはオプションです。ただし、これにより、カラムの目詰まりに対する耐性が大幅に向上し、寿命が延びます。エレクトロスプレーエミッターを内蔵した空の石英ガラスキャピラリーカラムは市販されており、必要に応じてステップ1と2を置き換えるために使用できます。

3. 固定相の調製

1. 粒子径1.9 μm、細孔径120 Åの完全多孔質ReproSil-Pur 120 C18-AQシリカ粒子25-50 mgを300 μLのメタノールに懸濁します。約20回ピペットで上下させ、メタノール中のスラリー粒子の均質な混合物を確保します。
2. スラリー懸濁液を含むチューブを、社内で製造したカラムパッキング爆弾システムの圧力セルチャンバー内に置き、マグネチックスターラーの上に設置して、スラリー粒子を懸濁液に留まらせます。爆弾を一定の圧力で動作するヘリウムタンク(<1500 psi)に接続し、パッキング中にHPLCスラリーが乱れないようにします。( 図5に示す概略図)。
3. 図6Aに示すように、圧力セルの蓋をボルトで所定の位置に締めて固定します。
   注:HPLCポンプとHPLCパッキン爆弾の動作の違いを理解することが重要です。前者はカラム内の固定相によって加えられる背圧に関係なく一定の流量で動作するように設計されていますが、HPLC充塡圧力システムは一定の圧力で動作するため、キャピラリーカラムの長さ全体にわたって固定相粒子が途切れることなく高密度に充填されます。

4. 固定相によるカラムの充填

1. 最初にカラムの底部(フリットのない開放端)を圧力爆弾の上部にある指で締めたフィッティングに通し、カラムの先端が上を向くようにします。カラムをスラリーの入ったバイアルの底面に接触するまで押し込み、底面から1〜2 mm上に引っ込めます。指で締めるフィッティングを締めて、カラムを所定の位置に固定します。
2. パッキンボムをヘリウムガスタンク(推奨圧力<1500 psi)に接続し、~1300 psiの圧力でオンにします。ヘリウムガスは、スラリーを含むバイアルを収容する圧力セルに三方弁を介して入ります。バルブを時計回りに180°ゆっくりと回して開きます。
   注:ヘリウムガスがチャンバー内を流れ始めるとすぐに、チューブからスラリーがキャピラリーに押し込まれます。スラリーがカラムを通過すると、粒子はキャピラリーに保持され、溶媒はカラムの先端に液滴を形成します(図6B)。
   1. カラムチップに液滴が形成されるのが遅れる場合は、チップをすばやく炎上させて、チップが開いていることを確認します。この段階では、カラムの後ろに配置された光源は、パッキングプロセスの進行状況を観察するのに役立ちます(図7)。内径が75 μmのカラムの場合、通常、約30 cmの長さを充塁するのに30~60分かかります。
   2. カラムを通るスラリーの流れが止まるか遅くなる場合は、キャピラリーをパッキンボムの指きっぱいのフィッティングの上にしっかりと保持し、約4分の1回転させて少し緩めます(減圧のシューという音が聞こえる場合があります)。
      注:これにより、爆弾を完全に減圧することなく、コラムの位置を変えることができます。
   3. 次に、カラムを上下に動かしてカラムをゆっくりと再配置し、次に指で締めるフィッティングを締め直し、カラムがバイアルのベースに触れていないことを確認します。これにより、キャピラリーを通るスラリーの流れが常に均一になります。
   4. 前述の措置でパッキングが再開されない場合は、バルブを閉じ、パッキング爆弾をベントし、蓋を緩めてスラリーを検査し、沈殿物がないことを確認します。また、カラムの端が固体の固定相粒子で詰まっている可能性もあり、その場合は、キャピラリーの背面から少し切断すると、流れを再開するのに役立つ場合があります。
3. カラムの端で希望の長さより数センチ長く充填して、静止粒子が完全に充填され、充填されたカラムにヘリウム気泡が入る可能性を最小限に抑えます。

5.コラムの仕上げとバックフリットの作り方

1. 希望の充填長に達したら、ヘリウムガスタンクのメインバルブを閉じ、カラムの均一な充填を確保し、システムが自己減圧するのを待つために最低15分間待ちます。
   注:カラムの端に空の溶融シリカの結果としてHe気泡が混入するのを避けるために、より長い充塡長が推奨されます。圧力チャンバー内のキャピラリーの長さを考慮して、目に見えるカラムの部分が充填された後でも、充填プロセスを続行することが重要です。さらに、カラムの再配置が繰り返し必要な場合は、気泡が少なくなり、充填効率が向上するため、充填長を長くすることをお勧めします。
2. バルブを反時計回りに180度回転させて元の位置までチャンバーを静かに減圧します。カラムをしっかりと保持し、指で固定されているフィッティングを緩めて、カラムを徐々に取り外します。この手順は、気泡が発生しないように、非常に穏やかに行う必要があります。
3. 柱の端を25.5cmの長さに切ります。顕微鏡で検査しながら、350°Fの高温はんだごてを使用して、カラムの後端から長さ0.5cmのスラリーを取り除きます。
   1. ステップ2.1で残ったフリット溶液にカラムの後端を約10秒間浸し、顕微鏡で観察しながらカラムの裏側に熱いはんだごてを置いて重合します。バックフリットにより、ReproSil-Pur 120 C18-AQ パーティクルがカラム内に留まり、クロマトグラフィー洗浄中の逆流が防止されます。
      注:カラムの後ろのフリットもオプションですが、ステップ2のフロントフリットでも指摘したように、カラムをより堅牢にします。

結果

カラムの性能を評価するために、HEK293 細胞の全細胞ライセートから調製した 750 ng のトリプシンペプチド消化物を、プロトコールに記載されているように、長さ 25 cm、内径 75 μm のフューズドシリカキャピラリーにバルク ReproSil-Pur 120 C18-AQ 粒子を社内で充填してオンラインで分画しました。サンプルをロードする前に、アセトニトリル、イソプロパノール、H₂O の混合物 6 μL を使用してカラムを 6:2:2 の比率で洗浄し、バッファー A(バッファー A:3% DMSO を含む水)で事前に平衡化しました。トリプシンペプチド消化物は、70分間の逆相グラジエントを使用して分析しました。溶媒グラジエントは、バッファー B(バッファー B:アセトニトリル、3% DMSO および 0.1% ギ酸を含む)を 400 nL/min の流速で 4 分間かけて 0% から 6% に増加させることから開始しました。その後、流速を 200 nL/min に減らし、バッファー B の 6 〜 25% から始まる線形グラジエントを次の 58 分間にわたってカラムに適用しました。バッファーBをさらに25〜...

ディスカッション

最新のプロテオミクス戦略は、複雑な生物学的システムを効果的に分析するために、高品質のクロマトグラフィー分離に依存しています。したがって、高性能で費用対効果の高いナノフローLCカラムは、単一のワークフローで数千のタンパク質を特性評価することを目的とした成功したタンデム質量分析法の重要なコンポーネントです。

この研究では、上記のプロトコルを使用して作製した LC-MS/MS 用のさまざまな LC カラムの性能と信頼性を評価しました。これらのカラムの性能を 2 年間にわたって調製し、HEK293 細胞トリプシン消化物のオンライン分画に使用し、その後タンデム質量分析法で分析することで試験しました。 図 8 と 図 9 に示すように、クロマトグラフィー溶出プロファイルのアライメントや同定されたペプチドおよびタンパク質の数などのカラムパラメーターの比較は再現性があり、異なるカラム間のばらつきは 10% 未満を...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
99.99% ホルムアミド酸	シグマ・アルドリッチ		フリット
アルコールランプ	任意のブランド		熱供給用
ブレヒビューラー ヘリウム圧力セル	バイオサープラス		パッキンカラム
用 セラミックカラムカッター	シリカキャピラリーを切断するための	任意のブランド
ジメチルスルホキシド(DMSO) ≥ 99%	シグマ-アルドリッチ		可燃性キャビネットに保管
ホルムアミド  ≥99.5%	ット製造用	シグマ・アルドリッチ
フッ化水素酸(HF)(50%)	合後のエミッター開放用	フィッシャーサイエンティフィ
KASIL(ケイ酸カリウム溶液)	PQコーポレーション
Orbitrap Fusion Lumos	サーモフィッシャーサイエンティフィック		製MSデータ収集
用P2000 レーザープーラー	サッター		キャピラリーPTFEを引っ張るため
1/16インチフェルール 内径0.4mm(長) チューブフィッティング用	クロムレ	214104	爆弾設定用
Reprosil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 um, 1g	Dr. Masch GmbH	r119.aq.0001	バッチ5910
はんだ付け	任意のブランド		ポリメライゼーションを開始するため
ステンレス鋼パイプ継手、六角カップリング、1/4インチ。メスNPT	スウェージロック	SS-4-HCG	爆弾設置
用TSP075375溶融シリカ、75&マイクロ;m ID x 360 & マイクロ;外径	MOLEX/Polymicro	1068150019	カラムチューブ用
Ultimate 3000 UHPLC	Dionex		HPLCタイプ