ペプチドマトリックスに基づくHBV特異的CD4 T細胞応答の解析とHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

現在、抗原特異的T細胞を解析する方法は3つあります。最初のアプローチは、T細胞受容体とペプチド(エピトープ)の相互作用に基づいています。抗原特異的T細胞は、ペプチド主要組織適合性複合体(MHC)多体で直接染色することができる。この方法の利点は、下流の転写/メタボロミクス分析に適した、生存可能な抗原特異的T細胞を得ることができるということです。この方法の制限は、特定の抗原に対するエピトープペプチドの同定数が今のところ制限されている間、検証されたエピトープペプチドを必要とするため、特定の抗原に対するT細胞応答全体に関する情報を提供できなかったということです。B型肝炎ウイルス(HBV)特異的CD8 T細胞エピトープと比較して、HBV特異的CD4 T細胞エピトープが少なく^、1,2であり^、現在HBV特異的CD4 T細胞の分析にはあまり適用されない。

第2のアプローチは、抗原ペプチド刺激³後の一連の活性化誘導マーカーのアップレギュレーションに基づく。一般的に使用されるマーカーには、CD69、CD25、OX40、CD40L、PD-L1、4-1BB 4が含^まれる。この方法は、ワクチン接種者^5、6、ヒト免疫不全ウイルス感染患者^7、および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2感染患者^8、9における抗原特異的T細胞応答を分析するために使用されてきた。ペプチド-MHCマルチマーベースのアッセイとは異なり、この方法は検証されたエピトープによって制限されず、下流の分析のために実行可能な細胞を得ることができます。この方法の制限は、抗原特異的T細胞のサイトカインプロフィールに関する情報を提供できなかったということである。また、いくつかの活性化された抗原非特異的細胞によるこれらの活性化誘導マーカーの発現は、分析におけるバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があり、特に標的抗原特異的T細胞が稀である場合に問題となる可能性がある。現在、HBV特異的CD4 Tセル⁴に対するこの方法の適用は限られている。この方法を利用してHBV特異的CD4 T細胞を確実に分析できるかどうかは、さらなる調査が必要です。

第3のアプローチは、抗原ペプチド刺激後のサイトカイン分泌に基づく。活性化誘導マーカーベースの分析と同様に、この方法は検証されたエピトープによって制限されない。この方法は、抗原特異的T細胞のサイトカインプロファイルを直接明らかにすることができる。この方法の感度は、抗原特異的T細胞のサイトカイン分泌に依存し、試験されるサイトカインの数は通常制限されるので、活性化誘導マーカーベースの方法よりも低い。現在、この方法はHBV特異的T細胞の解析に広く用いられている。HBV特異的T細胞を細胞分泌する細胞は、直接的なex vivoペプチド刺激^10、11によってほとんど検出できなかったので、HBV特異的T細胞のサイトカインプロファイルは、通常、10日間インビトロペプチド刺激拡大12、13、14、15、16の後に分析される。マトリックス形態におけるペプチドプールの配置は、抗原特異的エピトープ^17,18の同定を容易にするために利用されてきた。ペプチドマトリックスとサイトカイン分泌解析を組み合わせて、HBV特異的CD4 T細胞応答を評価し、HBV特異的CD4 T細胞エピトープを同時に^同定する方法が開発された。このプロトコルでは、この方法の詳細が説明されています。HBVコア抗原は、このプロトコルにおけるデモンストレーションの一例として選択される。

書面によるインフォームド・コンセントは、研究に含まれる各患者から得られた。この研究議定書は、サウスウエスト病院の医療倫理委員会の事前承認に反映された1975年のヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠しています。

1. HBV由来ペプチドマトリックスの設計

1. NCBIデータベースからHBVコア抗原のアミノ酸配列をダウンロードします(GenBank: AFY98989.1)。
2. ペプチド合成サービスプロバイダーからHBVコア抗原由来ペプチド(10残基、純度>90%、4mg/ペプチドで重なり合う35個の15-merペプチドのパネル)を購入します。
3. 1つのペプチドのみを含むマトリックス内の各位置で6×6個のペプチドマトリックスを正方形に設定する。12個のペプチドプールがあります:6列のペプチドプールと6列のペプチドプール、各プール¹⁶に5〜6個のペプチドがあります。マトリックス中の行ペプチドプールとカラムペプチドプールは、HBVコア抗原の2つの別個の形成を表す。
4. 購入したペプチドの3/4の場合、同じ行/カラムのペプチドを12個の別々のペプチドプールに混合し、ジメチルスルホキシド(DMSO)(各ペプチドに対して2μg/μL)に溶解します。HBV特異的CD4 T細胞応答の分析のために-80 °Cで貯えてください。
5. 残りのペプチドを別々に溶解し(10 μg/μL)、-80°Cで保存してエピトープを同定します。

末梢血単核細胞(PBMC)の単離

1. 慢性HBV感染患者からの静脈血のサンプル5 mL。
   注:血液量は、ペプチドプールの数に1バックグラウンドコントロールと1陽性対照を加えた量に応じて概算する必要があります。1つのペプチドプールの分析は3 x 10⁵ PBMCを必要とします。平均して、1 mLの血液から1 x 10⁶ PBMCを得ることができた。
2. フィコール密度勾配遠心分離(800×g、20分)を使用して血液からPBMCを分離し、後で使用するために液体窒素中の単離されたPBMCsを凍結保存します。
3. パスツールピペットを使用して、透明なFicoll層と赤血球層の間の顆粒球を収集します。メーカーのプロトコルに従ってゲノムDNA精製キットを使用して顆粒球からゲノムDNAを抽出します。
4. DNAサンプルをジェノタイピングサービスプロバイダーに送信し、HLA-DRB1遺伝子型を決定します。

3. HBVペプチドマトリックスを用いたPBMCsのインビトロ展開

1. PBMCsを解凍します。
   1. 温水槽で1:10,000ベンゾナーゼ(25 U/mL)~37°Cを加えた温かいRPMI 1640。
      メモ:ベンゾナスは、解凍中の細胞の凝集を制限するのに役立ちます。各サンプルは、ベンゾナスで20mLのRPMI 1640を必要とします。すべてのサンプルを解凍するために必要な量を計算し、1:10,000 ベンゾナーゼ(25 U/mL)で別のメディアのアリコート(37°C)を調製します。一度に5個以下のサンプルを解凍します。
   2. 液体窒素からサンプルを取り出し、水浴(37°C)で凍結したバイアルを素早く解凍します。
   3. 解凍した細胞懸濁液を15 mL遠心分離管に移します。ベンゾナスRPMI 1640(37°C)をチューブに1 mL滴下します。遠心分離管にベンゾナーゼRPMI 1640(37°C)の6 mLをゆっくりと加え、ベンゾナーゼRPMI 1640(37°C)の別の2 mLで凍結をすすいで全細胞を取り出した。残りのサンプルをできるだけ早く続行します。
      注: 凍結保存サンプルの遅い希釈は、解凍された細胞の生存率を維持するための鍵です。
   4. 遠心分離機(400×g、10分)、上清を取り除き、チューブをタップしてペレットを緩めます。
   5. ペレットを温かいベンゾナーゼRPMI 1640の1mLに静かに再懸濁します。穏やかに混合し、必要に応じて70μmの細胞ストレーナーを通して細胞をフィルタリングします(つまり、目に見える塊が存在する場合)。
   6. アリコート10μLの懸濁液をDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で希釈し、トリパンブルー(0.04%)を加え、ヘモサイトメーターに負荷を与え、1分間待ち、生存細胞(透明細胞)の数を数えます。
   7. 9 mLのベンゾナーゼ RPMI 1640 (37 °C) をチューブに加え、遠心分離機 (400 × g, 10 分) を加え、上清を取り出し、チューブをタップしてペレットを緩めます。
2. 25 mM HEPES、2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および10%ヒトAB血清(完全培地)を補充したRPMI 1640のPBMCを再中断します。細胞密度を1.5 x 10⁶ セル/mLに調整します。3 x 10⁵ 細胞/ウェルの密度で96ウェルプレート(平底)のプレートPBMC。
3. HBV由来ペプチドプール(各1つのペプチドにつき2μg/mL)を各ウェルに加えます。バックグラウンドコントロールとポジティブコントロールの井戸の場合は、同じ量の溶媒(DMSO、1 μL/mL)を加えます。10 U/mL IL-2と10 ng/mL IL-7を追加します。37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
4. 3日目に、IL-2の50 U/mLとIL-7の10 ng /mLを含むサプリメント培地。
   注:1日目から3日目には、明らかなT細胞増殖は認められない。B細胞、NK細胞、NKT細胞、単球などの非T細胞の死により、細胞総数は通常1/3から1/2まで減少します。
5. 7日目には、培養培地の半分をペプチド(4μg/mL)、IL-2(100 U/mL)、IL-7(20ng/mL)を含む新鮮な培地に置き換えます。
   注:下部の細胞を乱さないように、培地の上から約90μLの培養液を慎重にピペットします。3日目から7日目にかけて、堅牢なT細胞増殖が観察され、増殖T細胞は通常凝集してクラスターを形成する。
6. 10日目に、各ウェルのピペット細胞培養を7~9回穏やかにして細胞クラスターを分解し、生存細胞の数を数え、HBV特異的CD4 T細胞応答解析のために各ウェル内の2×105細胞を96ウェルプレート(丸底)に移した。
7. 12日目にエピトープ同定のために残りの細胞を培養し続け、培養培地の体積を100μL(過剰培地を捨てる)に調整し、ペプチド(4μg/mL)、IL-2(100 U/mL)、IL-7(20ng/mL)を含む新鮮な完全な培養培地を100μLで培養します。
   注:7日目から10日目の間、T細胞は活発に増殖し続けます。培地が黄色に変わったら、ステップ3.5のように培地を交換してください。一般に、セル数は10日目に6×10⁵ を超えます。各ウェルは通常、3つのウェルで同様の細胞数を示し、すべてのウェルのセル数の推定値として平均値を使用します。

4. 細胞内フローサイトメトリーによるHBV特異的CD4 T細胞応答の解析

1. ペプチドプールでPBMCを刺激する
   1. 96ウェルプレート(丸底)に移された細胞については、プレート(550×g、3分)で3回洗浄します。洗浄ごとに200μLの培地を使用してください(最初の2回の洗浄に対してRPMI 1640、最後の洗浄用の完全な培養培地)。上清を捨てます。
      注:繰り返し洗浄することによって培養中の残留サイトカインを除去すると、細胞内フローサイトメトリー分析の背景を効果的に減少させる可能性があります。
   2. 特定のペプチドプールで刺激された細胞のウェルごとに、同じペプチドプール(1つのペプチドにつき2μg/mL)を加えた完全な培養培地を200μL加えます。バックグラウンドコントロールのウェルのために、DMSOの1 μL/mLを添加した完全な培養培地を加える。陽性対照のウェルには、1 μL/mLのDMSO、150 ng/mLのフォルボル12-ミリステート13-アセテート(PMA)、および1 μmol/Lのイオノマイシンを添加する完全な培養培地を加える。
      注:DMSOの高用量は、T細胞のサイトカイン分泌を遮断します(TNF-αの場合、最も重要です)。5 μL/mL より高い DMSO の投与量は推奨されません。一般的に、実験におけるDMSOの投与量は1μL/mLを超えません。
   3. 37°Cで、5%CO2で6時間インキュベートする。
   4. 1時間の培養後、モネンシン(1.37 μg/mL)を培養物に加えます。
2. フローサイトメトリー
   1. 6時間のインキュベーションの後。遠心分離後の上清(550×g、3分)を取り除き、200μLのDPBS(550×g、3分)、染色面マーカー(CD3、CD4、およびCD8)および生存マーカー(固定性ビアビリティ色素を使用)を4°C冷蔵庫で30分間洗浄します。
   2. 200 μL の DPBS (550 × g, 3 分) で 1 回洗浄します。細胞を固定し、透過し、4°C冷蔵庫で細胞内サイトカイン(TNF-αおよびIFN-γ)を45分間染色する。
   3. 細胞内染色での最終洗浄後、細胞を150 μLのフローサイトメトリーバッファー(DPBS + 0.5%BSA)に再懸濁させる。
   4. フローサイトメーター上のフローサイトメトリーデータを取得します。
3. フローサイトメトリー結果の解析
   1. 陽性の定義:バックグラウンドコントロールウェルの少なくとも2回のT細胞分泌頻度を有する場合は陽性と同様に正を考える(図1)。
   2. 次の式に従って、分析したサイトカインごとに応答率を計算します(図2):
      
      注:マトリックス内の行ペプチドプールとカラムペプチドプールは、HBVコア抗原の2つの異なる形成を表すので、最終的な応答率は2で割る必要があります。

5 HBV特異的HLA-DR制限CD4 T細胞エピトープの同定

1. T-75フラスコ(5-20×6^細胞、 完全培養培地20mL)における同種Bリンパ芽球細胞株(BLCLs)を解凍し維持する。
   注:BLLSの良好な状態を保証するために、このステップは患者のPBMCの解凍の2週間前に開始されるべきである。遺伝子型入力の結果によると、患者はBLCLsと同じHLA-DRB1アレルを共有する必要があります。
2. 同定候補ペプチドのスクリーニング (図3)
   1. 10日目のT細胞応答率結果によれば、最も高い応答率(1行のペプチドプールおよび1列のペプチドプール)で2つのペプチドプールをスクリーニングする。
   2. このペプチドを含む他のペプチドプールもT細胞応答解析において陽性の結果を示す場合には候補ペプチドとしてそれらの2つのプールにペプチドをセットする。後でエピトープ同定のために他のペプチドプールと共に拡張されたPBMCを使用してください。
3. ペプチドを使用したBLLSのパルス化
   1. 12日目に、生存BLLSの数を数え、細胞を15mL遠心分離管に移し、遠心分離機(350×g、10分)上清を除去します。完全な培養培地中の細胞ペレットを再懸濁し、アリコートBLLSを96ウェルプレート(丸底)に4×10⁴ 細胞/ウェルで80μL完全培養培地で再懸濁する。
   2. 1つのペプチド(10 μg/mL)を加え、37°Cでインキュベートし、2時間5%の_CO2 をインキュベートします。設定2バックグラウンドコントロール:HLA-DRブロッキング(抗HLA-DR(10 μg/mL)で1時間の前処理で脈動するペプチド;DMSO(1 μL/mL)パルス。各ウェルの完全な培養培地の最終容積は100 μLである。
   3. ミトマイシンC(100 μg/mL)を加え、37°Cでインキュベートし、5%の_CO2 を1時間インキュベートします。
   4. 200 μL の RPMI 1640 (550 × g, 3 分) をプレートで 3 回洗浄し、非パルスペプチドおよびマイトマイシン C を除去します。最初の洗浄では、100 μLのRPMI 1640で培養培養を補います。
   5. 完全な培養培地の120 μLで細胞を再懸濁します。
4. ペプチドパルスBLLSでPBMCを刺激する。
   1. 12日目に、PBMCを96ウェルプレート(丸底)に移します。
   2. プレート内で遠心分離後(550×g、3分)、プレート内に200μLのRPMI 1640(550×g、3分)で2回洗浄します。
      注:反復洗浄による培養中の残留サイトカインおよびペプチドの除去は、細胞内フローサイトメトリー分析における背景を低下させる重要なステップである。特に残留ペプチドの場合、BLLSに結合し、バックグラウンドを著しく増加させます。
   3. 210 μL の完全な培養培地を使用して、各ウェルで PBMC を再中断します。
   4. エピトープ同定のために選ばれたPBMCsのウェルについては、アリコート(それぞれ70 μL)をペプチドパルスBLLS(2つのバックグラウンドコントロールを含む3つのウェル)と混合します。
      注:12日目には、PBMCを拡張するペプチドプールの数は、通常、ウェルあたり5〜7×10⁵ 以上に達するため、PBMC/BLCCの比率は約6/1〜4/1です。
   5. 37°Cで、5%CO2で6時間インキュベートする。
   6. 1時間の培養後、モネンシン(1.37 μg/mL)を培養物に加えます。各ウェルの完全な培養培地の最終容積は200 μLである。
5. フローサイトメトリー
   1. 手順 4.2 と同じ操作を繰り返します。
6. フローサイトメトリー結果の解析
   1. このペプチドパルスBLCCでインキュベートされたPBMCがバックグラウンドコントロールでインキュベートされたPBMCの少なくとも2回のCD4 T細胞のサイトカイン分泌頻度を示す場合、HLA-DR制限CD4 T細胞エピトープとしてペプチドを検証する(HLA-DRプリブロッキングで脈動するペプチド;DMSO脈動) (図4)。

サイトカイン分泌CD4 T細胞の頻度は、単一生産者と二重生産者の両方の合計として計算される。 図1に示すように、TNF-α分泌CD4 T細胞の頻度と、バックグラウンドコントロール(DMSO)におけるCD4T細胞(DMSO)のIFN-γ分泌頻度はそれぞれ0.154%と0.013%である。Cd4 T細胞を分泌するTNF-αの頻度と、ペプチドプールCore11に特異的なIFN-γ分泌CD4 T細胞の頻度はそれぞれ0.206および0.017であるため、TNF-α分泌CD4 T細胞応答とIFN γ分泌CD4細胞応答の両方が陰性と考えられる。TNF-α分泌CD4T細胞の頻度と、ペプチドプールCore09に特異的なIFN-γ分泌CD4 T細胞の頻度はそれぞれ2.715%と0.973%であるため、TNF-α分泌CD4 T細胞応答とIFN-γ分泌CD4細胞応答は両方とも正であると考えられる。

図 2に示すように、正のウェルは灰色の背景で示されています。HBVコア特異的TNF-α 分泌CD4t細胞応答率を算出する場合、ペプチドプールCore01、Core02、Core04、Core05、Core06、Core07、Core08、Core09、およびCore10のデータを含める必要があります。CD4 T細胞応答率を分泌するHBVコア特異的IFN-γ分泌率を計算する場合、ペプチドプールCore01、Core02、Core03、Core04、Core05、Core06、Core07、Core08、Core09、およびCore10のデータが含まれます。

図3に示すように、エピトープ同定のための候補ペプチドは赤色で示されている。Core01は、カラムペプチドプール内のCD4T細胞とIFN-γ分泌の両方でTNF-α分泌率が最も高い。ペプチドC1-15、C31-45、C61-75、およびC91-105は、これらのペプチドを含む行ペプチドプールがT細胞応答においても陽性の結果を示すように候補ペプチドとして設定されている。ペプチドプールCore07、Core08、Core09、Core10を用いて拡大したPBMCは、それぞれペプチドC1-15、C31-45、C61-75、C91-105のエピトープ同定に使用されます。Core09は、CD4 T細胞と行ペプチドプール内のCD4細胞を分泌するIFN-γの両方のTNF-αの応答率が最も高い。ペプチドC61-75、C66-80、C71-85、C76-90、C81-95、およびC86-100は、これらのペプチドを含むカラムペプチドプールとして候補ペプチドとして設定され、T細胞応答にも陽性の結果を示す。ペプチドプールCore01、Core02、Core03、Core04、Core05、Core06を用いて拡大されたPBMCは、ペプチドC61-75、C66-80、C71-85、C76-90、C81-95、C86-100のエピトープ同定にそれぞれ使用されています。

図4に示すように、ペプチドプールCore08拡張PBMCsの場合、 ペプチドC31-45パルスBLLSによる刺激後、TNF α分泌CD4 T細胞の頻度と、CD4細胞を分泌するIFN-γの頻度はそれぞれ0.995%および0.131%であり、これはバックグラウンドコントロール(HLA-DRブロッキングを有するペプチドC31-45パルスBLLs) DMSO パルス BLLS)。従って、C31-45ペプチドはHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープとして検証される。ペプチドプールCore10拡張PBMCの場合、ペプチドC91-105パルスBLCCによる刺激後、CD4T細胞を分泌するTNF-αの周波数と、CD4T細胞を分泌するIFN-γの周波数はそれぞれ0.221%および0.000%である。 バックグラウンドコントロールの2倍を超えない(HLA-DRプリブロッキング付きのペプチドC91-45パルスBLLS、DMSOパルスBLCLs)ので、ペプチドC91-105はHLA-DR制限CD4 T細胞エピトープとして検証されていません。

図1: ペプチドプール内でCD4 T細胞を分泌するTNF-α/IFN-γのフローサイトメトリーのデモンストレーションは、それぞれのペプチドプールで刺激を受けた後にPBMCsを拡大しました。

図2:CD4 T細胞を分泌するHBVコア特異的TNF-α/IFN γの分析のデモンストレーション TNF/DMSOおよびIFN-Ƴ/DMSOは、ペプチドプール刺激PBMCsの各ウェル内のCD4T細胞をDMSO制御のウェル内でTNF-α/IFN-γ分泌する頻度で割ったTNF-α/IFN-γ分泌頻度の比を示します。灰色の背景は、バックグラウンドコントロールとの比較によって判断された正のCD4 T細胞応答を有するウェルを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: エピトープ同定のための候補ペプチドのスクリーニングのデモンストレーション TNF/DMSOおよびIFN-Ƴ/DMSOは、ペプチドプール刺激PBMCsの各ウェル内のCD4T細胞をDMSO制御のウェル内でTNF-α/IFN-γ分泌する頻度で割ったTNF-α/IFN-γ分泌頻度の比を示します。灰色の背景は、バックグラウンドコントロールとの比較によって判断された正のCD4 T細胞応答を有するウェルを示す。赤色のペプチドは、スクリーニング基準に従って候補ペプチドを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:エピトープ同定結果のフローサイトメトリーの実証 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。