B型肝炎ウイルス(HBV)由来のペプチドマトリックスに基づいて、HBV特異的CD4 T細胞応答をHBV特異的CD4 T細胞エピトープの同定と並行して評価することができた。
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この記事について
サマリー
要約
CD4 T細胞は、慢性B型肝炎の病因において重要な役割を果たす。多目的な細胞集団として、CD4 T細胞は、彼らが分泌したサイトカインに基づいて明確な機能的サブセットとして分類されている:例えば、CD4 Tヘルパー1細胞のIFN-γ、CD4 Tヘルパー2細胞のIL-4およびIL-13、CD4 T濾胞ヘルパー細胞のIL-21、CD4 TヘルパーヘルパーセルのIL-17。B型肝炎ウイルス(HBV)特異的CD4 T細胞を、HBV由来ペプチド刺激後のサイトカイン分泌に基づいて分析すると、HBV特異的CD4 T細胞応答の大きさだけでなく、HBV特異的CD4 T細胞の機能サブセットに関する情報も提供できる。トランスクリプトミクスやメタボロミクス分析などの新しいアプローチは、HBV特異的CD4 T細胞に関するより詳細な機能情報を提供する可能性がある。これらのアプローチは、通常、ペプチド主要組織適合性複合体II多量体に基づいて生じるHBV特異的CD4 T細胞の単離を必要とするが、現在HBV特異的CD4 T細胞エピトープに関する情報は制限されている。HBV由来のペプチドマトリックスに基づいて、HBV特異的CD4 T細胞応答を評価し、慢性HBV感染患者からの末梢血単核細胞サンプルを同時に使用してHBV特異的CD4 T細胞エピトープを同定する方法が開発されました。
概要
現在、抗原特異的T細胞を解析する方法は3つあります。最初のアプローチは、T細胞受容体とペプチド(エピトープ)の相互作用に基づいています。抗原特異的T細胞は、ペプチド主要組織適合性複合体(MHC)多体で直接染色することができる。この方法の利点は、下流の転写/メタボロミクス分析に適した、生存可能な抗原特異的T細胞を得ることができるということです。この方法の制限は、特定の抗原に対するエピトープペプチドの同定数が今のところ制限されている間、検証されたエピトープペプチドを必要とするため、特定の抗原に対するT細胞応答全体に関する情報を提供できなかったということです。B型肝炎ウイルス(HBV)特異的CD8 T細胞エピトープと比較して、HBV特異的CD4 T細胞エピトープが少なく、1,2であり、現在HBV特異的CD4 T細胞の分析にはあまり適用されない。
第2のアプローチは、抗原ペプチド刺激3後の一連の活性化誘導マーカーのアップレギュレーションに基づく。一般的に使用されるマーカーには、CD69、CD25、OX40、CD40L、PD-L1、4-1BB 4が含まれる。この方法は、ワクチン接種者5、6、
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プロトコル
書面によるインフォームド・コンセントは、研究に含まれる各患者から得られた。この研究議定書は、サウスウエスト病院の医療倫理委員会の事前承認に反映された1975年のヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠しています。
1. HBV由来ペプチドマトリックスの設計
- NCBIデータベースからHBVコア抗原のアミノ酸配列をダウンロードします(GenBank: AFY98989.1)。
- ペプチド合成サービスプロバイダーからHBVコア抗原由来ペプチド(10残基、純度>90%、4mg/ペプチドで重なり合う35個の15-merペプチドのパネル)を購入します。
- 1つのペプチドのみを含むマトリックス内の各位置で6×6個のペプチドマトリックスを正方形に設定する。12個のペプチドプールがあります:6列のペプチドプールと6列のペプチドプール、各プール16に5〜6個のペプチドがあります。マトリックス中の行ペプチドプールとカラムペプチドプールは、HBVコア抗原の2つの別個の形成を表す。
- 購入したペプチドの3/4の場合、同じ行/カラムのペプチドを12個の別々のペプチドプールに混合し、ジメチルスルホキシド(DMSO)(各ペプチドに対して2μg/μL)に溶解します。HBV特異的CD4 T細胞応答の分析のために-80 °Cで貯えてください。
- 残りのペプチドを別々に溶解し(1....
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結果
サイトカイン分泌CD4 T細胞の頻度は、単一生産者と二重生産者の両方の合計として計算される。 図1に示すように、TNF-α分泌CD4 T細胞の頻度と、バックグラウンドコントロール(DMSO)におけるCD4T細胞(DMSO)のIFN-γ分泌頻度はそれぞれ0.154%と0.013%である。Cd4 T細胞を分泌するTNF-αの頻度と、ペプチドプールCore11に特異的なIFN-γ分泌CD4 T細胞の頻度はそれぞれ0.206および0.017であるため、TNF-α分泌CD4 T細胞応答とIFN γ分泌CD4細胞応答の両方が陰性と考えられる。TNF-α分泌CD4T細胞の頻度と、ペプチドプールCore09に特異的なIFN-γ分泌CD4 T細胞の頻度はそれぞれ2.715%と0.973%であるため、TNF-α分泌CD4 T細胞応答とIFN-γ分泌CD4細胞応答は両方とも正であると考えられる。
図 2に示すように、正のウェルは灰色の背景で示されています。HBVコア特異的TNF-α 分.......
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ディスカッション
このプロトコルの最も重要なステップは次のとおりです: 1) PBMCの拡張を開始するのに十分な高い生存率の PBMC;2) PBMC拡張に適した環境3) エピトープ同定前のPBMC培養における残留ペプチドプールの完全除去。
このプロトコルの全ての分析は、CD4 T細胞の強い増殖に依存する。一般に、10日の拡張後のPBMCの数は、初期値の2~3倍になります。PBMCの細胞数と生存率は、PBMCsの拡大における2つの重要な要因です。エピトープ同定を行わないHBV特異的CD4T細胞のみを解析することを目的としている場合、特に血液サンプルの量が制限されている場合には、初期PBMC数を減らすことが妥当である。我々の経験では、PBMCsの開始数が1.5×105 セル/ウェルを下回っている場合、PBMCsの拡張が成功することはほとんど得られない。新しい PBMC を拡張に使用する場合、セルの生存率は問題ありません。凍結保存されたPBMCを拡張に使用する場合、PBMCの凍結保存と解凍は、PBMCの生存率を維持するために非常に慎重に行われるべきです。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この研究は、中国国立自然科学財団(81930061)、重慶自然科学財団(cstc2019j-bshX0039、cstc2019jj-zdxmX0004)、および中国のキーによって支援されました。
感染症に特化したプロジェクト(2018ZX10723203)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルブミンウシV(BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC標識抗ヒトTNF-&α; | eBioscience | 17-7349-82 | 光から保護し続ける |
| ベンゾナーゼヌクレアーゼ | Sigma-Aldrich | E1014 | 細胞凝集 |
| を制限する Bリンパ芽球様細胞株 (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 HLA-DRB1*0803 ホモ接合 | |
| 体Bリンパ芽球様細胞株 (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | HLA-DRB1*1202 ホモ接合体 | |
| 細胞培養フラスコ(T75) | Corning | 430641 | |
| 細胞培養プレート(96ウェル、平底) | Corning | 3599 | 平底 |
| 細胞培養プレート(96ウェル、丸底) | Corning | 3799 | 丸底 |
| 細胞ストレーナー | Corning | CLS431751 | 細孔径 70 μm、ホワイト、滅菌 |
| 分離チューブ(15 mL) | KIRGEN | KG2611 | 滅菌遠心 |
| 分離チューブ(50 mL) | Corning | 430829 | 滅菌遠心 |
| 分離機、冷蔵 | エッペンドルフ | 5804R | |
| 遠心分離機、冷蔵 | サーモ | ST16R | |
| 遠心分離機、冷蔵 | サーモ | レジェンドマイクロ21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | 使用前に溶液を調製 |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | 結晶化を防ぐため室温で保存してください Dulbecco |
| 'リン酸緩衝生理食塩水 | NaCl (8000 mg)、KCl (200 mg)、KH2PO4 (200 mg)、Na2HPO4.7H2O (2160 mg) を含む ddH2O (1000 ml) を調製します。PHを7.4に調整します。オートクレーブで滅菌します。 | ||
| Ficoll-PAQUE Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| チップ(0.5-10) | Kirgen | KG5131 | |
| フィルターチップ(100-1000) | Kirgen | KG5333滅菌 | |
| フィルターチップ(1-200) | Kirgen | KG5233滅菌 | |
| FITC標識抗ヒトCD4 | BioLegend | 300506 | 光 |
| 固定可能な生存率 染料 eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | 光から保護してください |
| GolgiStop タンパク質輸送阻害剤 (モネンシンを含む) | BD Biosciences | 554724 | タンパク質輸送阻害剤 |
| 血球計算計 | ブランド | 718620 | |
| HBV コア抗原由来ペプチド | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| ヒト血清 AB | ジェミニ バイオ製品 | 100-51 | 100 ml |
| イオノマイシン | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | サンゴン バイオテック | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | サンゴン バイオテック | A100781-0500 | |
| LSRFortessa フロー サイトメーター | BD | ||
| L-グルタミン | ギブコ | 25030081 | 100 ml |
| 微量遠心チューブ (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | クレーブ滅菌 |
| マイクロプレート シェイカー | サイエンティフィック インダストリー | マイクロプレート ジーニー | |
| マイトマイシン C | ロシュ | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | サンゴン バイオテック | A100348-0500 | |
| NaCl | サンゴン バイオテック | A100241-0500 | |
| PCRチューブ(0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | 光 |
| PE標識抗ヒトIFN-&γ | eBioscience | 12-7319-42 | 光から保護してください |
| ペニシリン ストレプトマイシン | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | 光から保護してください |
| Phorbol 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| 組換えヒト IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 組換えヒト IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| ピルビン酸ナトリウム、100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF 精製抗ヒト HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA精製キット | プロメガ | A1125 |
参考文献
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
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再版と許可
