方法論記事

ApoEにおける後肢虚血の改変外科モデル-/- ミニチュア切開を用いたマウス

DOI：

10.3791/62402

⸱

2021年5月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 2European Center of Angioscience ECAS, Medical Faculty Manheim, Heidelberg University, 3Computer-Assisted Clinical Medicine, Mannheim Institute for Intelligent Systems in Medicine, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Cooperative Core Facility Animal Scanner ZI, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事は、小さな切開を有するマウスにおける急性虚血を確立するための効率的な外科的アプローチを示す。このアプローチは、ほとんどの研究グループが、実験室でのアップグレードなしで適用できます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究の目的は、ほとんどの動物実験で実施できるマウスに急性虚血を誘導する改変外科的アプローチを導入し、評価することにある。大腿動脈(DLFA)の二重結紮に対する従来のアプローチとは対照的に、右のインギナル領域に小さな切開部が、DLFAを行うために近位大腿動脈(FA)を露出するようになされた。次いで、7-0縫合を用いて、切開を膝領域に引きずり込んで遠位FAを露出させ、手術後にFA閉塞を検出するために両側後肢に磁気共鳴画像(MRI)を使用した。手術後0、1、3、5、および7日目に、後肢の機能的回復を目視で評価し、Tarlovスケールを用いて採点した。組織学的評価は、DLFAの7日後に動物を安楽死させた後に行った。この処置は10匹のApoE-/- マウスで右足で正常に行われ、その後の観察中に死亡したマウスはなかった。全10匹のマウスの切開サイズは5mm(4.2±0.63mm)未満であった。MRIの結果は虚血側のFA血流が明確に遮断されたことを示した。Tarlovスケールの結果は、後肢の機能が処置後に有意に低下し、次の7日間にわたってゆっくりと回復することを示した。組織学的評価は虚血性側に顕著な炎症反応を示し、虚血後肢の微小血管密度を低下させた。結論として、この研究は、DLFAを使用して後肢虚血(HLI)を行うためにミニチュア切開を使用して変更された技術を導入する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

末梢動脈疾患(PAD)などの血管疾患の研究のための前臨床動物モデルのための満たされていないニーズがあります。診断と治療の発展にもかかわらず、2018年1年にはPAD患者数が2億人以上で、その数は絶えず増加しています。いくつかの新しい治療アプローチ2、3、4、5、6、7が記載されているが、臨床応用へのこれらの治療様式の翻訳の成功は困難な作業のままである。従って、ヒト疾患状態をシミュレートする生体内の実験モデルにおいて信頼性が高く、関連するが、PAD6,7を治療するためのこれらの新しい治療アプローチの潜在的なメカニズムおよび効率を調べる必要がある。

高脂血症およびアテローム性動脈硬化症(AS)は、PADの開発のための主な危険因子である。ApoE-/-マウス(高脂肪食)は異常な脂肪代謝と高脂血症を示し、その後、臨床的に関連するPADをシミュレートするための最良の選択としてApoE-/-マウスをレンダリングするアテローム硬化性プラークを開発する。前臨床HLI動物モデルは、世界中の実験室で最も広く使用されている大腿動脈(DLFA)の二重結紮によって生成される8、9、10、11、12、13、14、15急性慢性虚血をシミュレートする。しかし、このアプローチは通常、比較的大きく侵襲的な切開を必要とする。さらに、必然的に、痛み傷害や炎症の増加に苦しむ動物(特にマウス)につながり、その後の実験結果5、6、16、17にも影響を与える。この論文では、APOE-/- マウスにおける急性慢性HLIモデルについて、非常に小さな切開を用いて説明する。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:すべての実験手順はECガイドラインEC 2010/63/EUに従って行われ、現地のドイツの法律(35-9185.81/G[1]239/18)によって承認されています。体重29.6-38.0gのC57BL/6Jバックグラウンドを持つ10匹の雄のApoE-/- マウスを12時間の明暗サイクルに収容し、8週間から12週間、西洋の食事(1.25%コレステロールと21%脂肪)と水 アドリビタム を与えた。HLIは、以下に説明する20週齢マウスに対して行った。

1. アポエにおけるHLI誘導-/- マウス

  1. 手術に必要な機器とツールを準備します ( 資料一覧 および 図 1を参照)。使用前にオートクレーブ処理を介して手術器具を殺菌し、手術中にガラスビーズ滅菌器を使用します。
  2. すべての外科的処置の前にミダゾラム(5mg/kg)、メデトミジン(0.05 mg/ml/kg)、フェンタニル(0.5mg/kg)の混合物の皮下注射(S.C.)でマウスを麻酔する。
    1. 麻酔の発症後、目の獣医軟膏を使用して乾燥を防ぎ、前肢および後肢にペダル離脱反射がないことを確認する。
  3. その後、マウスを加熱パッドに置き、コア体温を約37°Cに保ちます。 綿棒と脱毛クリームを使用して、右側の後肢の皮膚から慎重に髪を取り除きます。
    注:脱毛クリームは、後肢、特に切開が行われるインギナル領域をカバーするのに十分な量で使用する必要があります。脱毛クリームは3分未満の持続時間のために使用する必要があり、その後、湿った綿棒2〜3回で除去する必要があります。
  4. マウスを、解剖顕微鏡の下の加熱パッドの仰向けの位置に置きます。マウスの皮膚を消毒するために、皮膚消毒剤(材料表参照)を使用してください。その後、尖った鉗子と外科用はさみを使用して、インギナル領域の真ん中に約3〜4mmの切開を行います。手順の概略図については、 図 2 を参照してください。
  5. 皮下脂肪組織を細かく尖った鉗子の助けを借りて慎重に取り除き、近位大腿神経血管束を露出させる。細かい尖った鉗子を慎重に使用して、大腿骨鞘の膜を貫通する。生理食動物で湿らせた綿棒を使用して、大腿動脈(FA)を大腿神経(FN)と大腿静脈(FV)から慎重に離します。
  6. 近位FAを通して2つの7-0吸収可能縫合糸を渡し、2つのネクタイ間のFAをトランセクトするためにスプリングハサミを使用してダブルノットを作ります。
  7. 遠位FAを露出させるために、切開の下端を通して7-0吸収性縫合糸を通過し、後肢の膝の右側の領域に切開を静かにドラッグします。
  8. 皮下組織を慎重に脇に移動し、神経血管束を露出させる。細かい尖った鉗子を使用して大腿骨鞘の膜を突き刺し、FVおよびFNからFAを解剖する。
  9. 遠位FAを通して2つの7-0吸収性縫合糸を渡し、二重結び目を作る。スプリングハサミを使用して、2つのネクタイの間にFAをトランセクトします。
    注:左四肢にはライゲーションは行われず、各マウスのコントロールとして働いた。
  10. その後、6-0吸収性縫合糸を使用して切開をステッチします。きれいなケージの暖房パッドの上にマウスを置き、回復するまでその重要なパラメータを監視し続けます。術後鎮痛薬を提供する:ブプレノルフィンs.c(48時間ごとに0.1mg / kg体重)。48時間後、飲料水中にメタミゾールを投与する(24mg/5mLの水は1日4回200mg/kgの用量に相当する)。

2. 磁気共鳴画像

注:DLFAの翌日、マウスはFA閉塞を評価するためにMRIスキャンを受けなければなりません。

  1. 透明な誘導室にマウスを置き、右反射が失われるまで周囲の空気中の1.5-2%イソフルランでマウスを麻酔します。
  2. 咬傷ホルダーを備えた加熱された動物のベッドの上にマウスを置き、レーザー制御システムで磁石の方に置きます。体温は37±1 °Cに保ちます。
  3. 画像取得中、周囲空気中の1.5~2%のイオブルランで麻酔を維持し、圧力プローブを用いて呼吸を監視します。
  4. パラメータエコー時間(TE)/繰り返し時間(TR)/フリップ角度(FA)=2 ms/12 ms/13°、4つの平均、178 x 144の取得行列を256 x 192および121スライスで3次元(3D)飛行(TOF)血管造影シーケンスを使用して、横スライスの向きの画像を取得し、0.15の等度分解を引き起こします。静脈からの信号を抑制するには、後肢に遠位に飽和スライスを配置します。

3. 臨床評価とフォローアップ

  1. 機能的スコアリング Tarlov スケール18,19 (表 1) を使用して、手術後 1日、 3日、5日目、7日目の機能回復を推定します。

4. 組織学的評価

  1. 手術の7日後、ペントバルビタール注射(115mg/kg)を適用してマウスを安楽死させる。
  2. パーフューズリン酸緩衝生理食塩(PBS)は、左心心室(1マウスあたり100 mL)を通して1%パラホルムアルデヒド(PFA)を含有する。マウスの両側胃腸(Gm)を4°Cで一晩4%PFAで固定する。
  3. 前述のプロトコル20に従ってパラフィンにサンプルを埋め込む。
    1. パラフィン埋め込み組織ブロックの厚さ4~5μmをミクロトームに切り取ります。丸いペンキのブラシの助けを借りて、42°Cに維持水浴に切断ティッシュセクションを置きます。
    2. 顕微鏡スライドを45°の角度で水中に挿入し、収集するセクションのグループの下に慎重に配置します。
    3. 慎重に水からスライドを持ち上げ、セクションがスライドに取り付け、37°Cのベンチトップインキュベーターで一晩乾燥させます。
  4. パラフィン切片のヘマトキシリン/エオシン(HE)染色を行う。
    1. セクションを含むスライドをスライドホルダに配置します。フレッシュキシレンの3容器を準備し、各容器にスライドを5分間入れ、切片を脱パラフィン化します。
    2. スライスを96%、80%、70%、50%、30%エタノール、および5分間脱イオン水に連続して浸漬して、切片を水分補給します。
    3. ヘマトキシリン溶液中のステインを10分間使用した。
    4. スライスを脱イオン水の容器に移し、水道水を5分間流してすすいます。
    5. 顕微鏡を使用して、ヘマトキシリン染色の強度を確認します。染色によって細胞核の同定が明確に可能な場合は、次のステップに進みます。染色強度が細胞核の同定を容易にしない場合、または染色強度が薄い場合は、ヘマトキシリン溶液にスライドを1分間置き、水で洗浄を繰り返し(ステップ4.4.4)、再度確認します。
    6. 5分間のエオシン-Y溶液中のカウンターステイン。
    7. 各々10sの期間に対して、スライスを脱イオン水30%、50%、70%、80%、96%エタノールを連続して含む容器に浸漬して、切片を脱水する。次に、各10 sの新鮮なキシレンの3つの容器に順番にセクションを置きます。
    8. スライドを、横断を上向きにして、顕微鏡スライドストレージマップ上に水平に配置します。スライドに十分なマウントメディアを追加し、スライドをカバースリップで取り付けます。
  5. パラフィン切片の免疫体化学(IHC)染色を行う。
    1. デパラフィン化と水分補給のステップ 4.4.1~4.4.2 を繰り返します。その後、10 mMクエン酸ナトリウムバッファーを容器に浸し、pH6、サンプルをマイクロ波で沸騰させます。
      注:サンプルの過熱または過加熱は、一貫性のない染色を引き起こす可能性がありますので、10分間、沸点のすぐ下に温度を維持します。
    2. 次に、ベンチトップのセクションを30分間冷やします。その後、5分間、PBSで3回洗浄します。サンプルの周りを慎重に乾燥させ、疎水性ペンを使ってサンプルの周りに大きな円を描きます。.
      メモ:サンプルに触れないでください。疎水性ペンでマーキングすると疎水性の境界が生じ、抗体溶液の少量の使用が容易になります。
    3. Pbsで10分間0.3%H2O2にセクションを入れることにより、内因性ペルオキシダーゼ活性をクエンチする。ブロックバッファーの400 μL(PBSは3%のウシ血清アルブミンと非イオン性洗剤の0.3%を含む)を加湿したチャンバ内の室温で1時間ブロックセクション。
    4. PBSで5分間、セクションを洗います。次に、薄めた抗CD31抗体(1:250)を100~400μL添加して、セクションを覆うほどの量を増やします。これに続いて、加湿チャンバ内で4°Cで一晩の切片をインキュベートする。
      注: セクションが完全に抗体溶液で覆われていることを確認します。
    5. 一次抗体を取り出し、各5分間、PBSで切片を3回洗います。
    6. DAB濃縮物をDAB希釈液の1mLに1滴加えて3、3'-ジアミノベンジジン(DAB)混合物を調製し、よく混合する。その後、100~400 μLのDAB混合物をセクションに加え、許容可能な染色強度が観察されるまで2分間注意深く監視します。
      注: セクションが DAB の混合で完全に覆われていることを確認します。
    7. その後、水道水を流して5分間すすります。手順 4.4.3-4.4.5 で説明されているようにヘマトキシリン染色を行います。
    8. ステップ4.4.6で説明したeosin-Y染色を行う。ステップ 4.4.7 で説明した脱水処理を行います。
    9. 取り付け媒体を使用してカバースリップでセクションを取り付けました。ImageJを使用して、前に述べたように微小血管密度とみなすことができる5つの無作為選択フィールド(40倍)におけるCD31陽性領域(%)のパーセントを推定する。

5. 統計分析

  1. 統計解析ソフトウェアを使用して、結果を標準偏差±平均として表現し、比較に対していない t-test を実行します。 P < 0.05 は統計的に有意であると考えてください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

アポエの特徴-/- マウス
DLFA手術はHLIモデルを確立するために10匹のマウスで正常に行われ、処置後に死亡したマウスはいずれも死亡しなかった。体重の変化に従うために、マウスはDLFA処置(プレDLFA)の前およびDLFA手術の7日後(ポストDLFA)の後に体重を量った。プレDLFAウェイトは29.6~38.0g(平均34.74±2.47g)、DLFA後重みは26.5~34.1g(平均30.77±2.15g)の範囲で、DLFA前の重みよりも有意に低かった(P <0.05、 図3A)。手術時間は15分から47分(麻酔時間を含まない8.82分±平均34.2分)10匹のマウスの切開サイズは3〜5mm(平均4.2±0.63mm)の範囲でした。

MRIスキャンと機能回復
MRIスキャンは、右FAの近位領域および遠位領域が灌流を示さなかった...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、必要な実験室のアップグレードなしに3〜4mmの切開を介してFAの近位および遠位領域で二重結紮を使用してApoE-/-マウスにHLIモデルを確立するための修正され、簡素化され、外科的に効率的なアプローチを報告する。この方法の主な特徴は、マウスHLIモデル8、9、10、11、12、15、20、22、23、24を説明する以前に報告された研究と比較して、切開の小さいサイズである。

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、記事の内容は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的関係がない場合に構成されたと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者はヴィクトリア・スクデ、アレクサンダー・シュルンド、フェリックス・ヘルナーに優れた技術サポートをしてくれたことに感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10xリン酸塩緩衝液生理食塩水Roth9143.1ヘマトキシリンおよびエオシン染色および免疫組織化学染色に使用
30% H2O2Roth9681.2免疫組織化学染色
6-0吸収性縫合糸にPROLENE8776H皮膚の縫合に使用
6-0吸収性縫合糸PROLENEEP8706手術に使用
7-0吸収性縫合糸PROLENEEH8021E動脈の結紮に使用
7-0吸収性縫合糸PROLENEEP8755手術に使用
酢酸ロス6755.1ヘマトキシリンおよびエオシン染色に使用
アルブミンフラクチオンVロス8076.2免疫組織化学染色
オートクレーブに使用Systec GmbHSystec VX-150手術器具の滅菌に使用
Axio vert A1顕微鏡カールツァイスZEISS Axio Vert.A1ヘマトキシリンとエオシンの染色と免疫組織化学染色
Bruker BioSpec 94/20 AVIIIBruker Biospin MRI GmbHN/A大腿動脈閉塞のスキャン
Buprenovet Sine 0,3mg/mlBayer AG2542 (WDT)術後の疼痛管理に使用されます。用量 - 手術後48時間、8時間ごとに0.1mg/kg
CD31抗体アブカムab28364免疫組織化学染色に使用
エオシンY溶液 0.5% 水中ロスX883.1ヘマトキシリンおよびエオシン染色に使用
エピトープ賦活化液 pH 6ライカバイオシステムズ6046945免疫組織化学染色に使用
エタノール ≥ 99,5 %ロス5054.1ヘマトキシリンとエオシンの染色と免疫組織化学染色に使用
フェンタニルケイマン化学437-38-7麻酔に使用
細かい点の鉗子Medixplus93-4505S神経と静脈から動脈を分離するために使用
ガラスビーズ滅菌器サイモン・ケラータイプ250手術器具の滅菌に使用
Graefe iris鉗子湾曲VUBUVUBU-02-72207皮膚と皮下組織の鈍い分離に使用
毛髪除去クリーム、Veet(アロエベラ付き)レキットベンキーザー108972マウスの後肢から毛を取り除く
加熱プレートSTÖRK-TRONIC7042092マウスの衛星温度を保つ
ヘマトキシリンRothT865.2ヘマトキシリンとエオシンの染色と免疫組織化学染色に使用
ライカ手術用顕微鏡ライカM651操作を容易にするために視野を拡大
液体DAB+基質 発色剤システムダコK3468免疫組織化学染色
に使用男性ApoE-/-マウスチャールズリバー研究所N / A梢動脈疾患マウスモデルメ
デトミジンケイマンケミカル128366-50-7
麻酔マイクロニードルホルダーブラック&ブラックサージカルB3B-18-8を保持する
マイクロ縫合鉗子を結ぶライフセーバーサージカルインダストリーズPS-MSF-145手術中の結び目を支援するために使用されます
ミクロトームバイオベースBk-MT268M組織切片化に使用
ミダゾラムレシオファーム44856.01.00麻酔に使用
MR互換の小動物モニタリングおよびゲーティングシステムモデル1025SAインスツルメンツN/aMRIスキャン中の動物のバイタルサインのモニタリング
Octeniderm farblosSchülke &マイヤーGmbH180212、目
と鼻のための皮膚軟膏バイエルAGの1578675麻酔下で目を濡らしてください
パラホルムアルデヒドロス0335.1組織の固定に使用
ペントバルビタールネンブタール76-74-4麻酔に使用
生理食塩水DeltaSelect1299.99.99麻酔
スプリングハンドルはさみ、細くて鋭い先端ブラック&ブラックサージカルB66167切断に使用されます
SuperCutはさみブラック&黒の外科B55992皮膚を切るために使用
Triton X-100Roth9002-93-1免疫組織化学染色の
ために使用される西洋の食事、1.25% コレステロールssniff SpezialdiäマウスE15723-3の食事療法
ヘマトキシリンおよびエオシンの汚れおよび免疫組織化学の汚れに使用される
使用 体重 末を確立するために使用されます針の消毒に使用されます 動脈のキシレンロス4436.3のための10 GmbH

参考文献

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