このプロトコールは、化学的に修飾されたmRNAのin vitro転写(IVT)、カチオン性リポソーム調製、および哺乳動物細胞におけるリポソーム対応mRNAトランスフェクションの機能分析を示します。
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方法論記事
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このプロトコールは、化学的に修飾されたmRNAのin vitro転写(IVT)、カチオン性リポソーム調製、および哺乳動物細胞におけるリポソーム対応mRNAトランスフェクションの機能分析を示します。
近年、化学修飾メッセンジャーRNA(mRNA)は、新規クラスのワクチン、タンパク質置換療法、免疫療法など、幅広い治療用途を開発するための強力な核酸分子として浮上しています。デリバリーベクターの中で、脂質ナノ粒子はRNA分子(siRNA、miRNA、mRNAなど)の送達においてより安全で効果的であることがわかっており、いくつかの製品はすでに臨床使用されています。脂質ナノ粒子を介したmRNAデリバリーを実証するために、機能的なme1Ψ-UTP修飾eGFP mRNAの合成、カチオン性リポソームの調製、カチオン性リポソームによるmRNAの静電複合体形成、および哺乳類細胞におけるトランスフェクション効率の評価に最適化されたプロトコルを提示します。この結果は、これらの修飾がカチオン性リポソームと共に送達されたmRNAの安定性を効率的に改善し、哺乳類細胞におけるeGFP mRNAの翻訳効率と安定性を増加させることを示しています。このプロトコルは、目的のmRNAを合成し、哺乳類細胞における標的遺伝子発現のためのカチオン性リポソームをトランスフェクションするために使用することができます。
治療用分子としてのmRNAは、その非統合性およびプラスミドDNA(pDNA)1と比較して非有糸分裂細胞をトランスフェクションする能力により、いくつかの利点を提供します。mRNAの送達は1990年代初頭に実証されましたが、その安定性の欠如、免疫活性化の欠如、および翻訳効率の低さのために、治療への応用は限られていました2。最近同定された、mRNA上のシュードウリジン5'-三リン酸(Ψ-UTP)やメチルシュードウリジン5'-三リン酸(me1Ψ-UTP)などの化学修飾は、これらの制限を克服するのに役立ち、mRNA研究に革命をもたらし、ひいてはmRNAを基礎研究と応用研究の両方で有望なツールにしました。その適用範囲は、iPS細胞の作製からワクチン接種および遺伝子治療まで多岐にわたります3,4。
mRNA技術の進歩と並行して、非ウイルス性送達システムの大幅な進歩により、mRNAの送達が効果的になり、この技術は複数の治療用途に実現可能になりました5。非ウイルスベクターの中で、脂質ナノ粒子は核酸の送達に有効であることがわかっています....
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1. me1 Ψ-UTP修飾mRNAの作製
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me1Ψ-UTP修飾mRNA産生、リポソーム調製、およびカチオン性リポソームを用いた複数の哺乳類細胞へのmRNAトランスフェクション実験のプロトコールを最適化しました(図1)。mRNAを合成するために、哺乳類コドン最適化eGFP IVTテンプレートをmEGFP-N1哺乳類発現ベクターから増幅し、有機抽出/エタノール沈殿法で精製しました(図2)。その後、me1Ψ-UTP修飾RNAとmRNAがIVTプロセスによって作製されました。変性RNAアガロースゲル電気泳動データにより、これらの合成RNAは良好な完全性と正しい長さ(RNAラダーに対して750塩基RNA、~1000塩基mRNA)を持つことが示されました(図3)。
カチオン性リポソームを調製するために、薄膜水和法および超音波処理を用いて、小さな単層小胞(SUV)を形成した。リポソームの物理化学的特性評価により、流体力学的直径は約65 nmで観察され、表面電位.......
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未修飾mRNAの治療応用は、半減期が短いことや細胞内自然免疫応答を活性化する能力があるため、トランスフェクションされた細胞でのタンパク質発現の低下につながるため、限定的でした11。Katalinらは、m5C、m6A、ΨU、me1Ψ-UTPなどの修飾ヌクレオシドを含むRNAがTLR活性化を回避できることを実証しました12。さらに重要なことに、IVT mRNAへのΨUまたはme1Ψ-UTPの取り込みは、標的タンパク質の優れた翻訳効率、室温での安定性の向上、およびヌクレアーゼからの分解の防止を示しました13、14。
このビデオでは、脂質対応me1Ψ-UTP修飾mRNAを複数の培養細胞に導入するためのプロトコールを実演しました。このプロトコールには、me1Ψ-UTP修飾mRNAの産生、カチオン性リポソーム調製、細.......
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MSは、財政支援(BT/PR25841/GET/119/162/2017)、VelloreのCSCR責任者であるAlok Srivastava博士、イメージングおよびFACS実験のためのCSCRコア施設であるSandhya博士に感謝します。リポソームの物理化学的データの分析に協力してくださった CSIR-Indian Institute of Chemical Technology Uppal Road, Tarnaka, Hyderabad, 500 007, TS, India の応用生物学部門の R. Harikrishna Reddy 氏と Rajkumar Banerjee 氏に感謝します。Vigneshwaran V、およびJoshua A、CSCRは、ビデオ制作の支援に対して。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アガロー | ロンザ | 50004 | |
| バスソニケー | ターDNMANMインダストリーズ | USC-100 | |
| チオン性脂質 | で | ||
| Chlorofrom | MPバイオメディカル67-66-3 | "コーション" | |
| コレステロール | Himedia | GRM335 | |
| DEPC水 | SRL BioLit | 66886 | |
| DMEM | ロンザ | 12-604F | |
| DNA ラダー | GeneDireX | DM010-R50C | |
| DOPE | TCI | D4251 | |
| EDTA ナトリウム塩 | MP バイオメディカル 194822 | ||
| エタノール | ヘイマン | F204325 | "コーション" |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 10270 | |
| フローサイトメトリー | BD | FACS Celesta | |
| Fluroscence 顕微鏡 | Leica | MI6000B | |
| Gel ドキュメンテーションシステム | Cell Biosciences | Flurochem E | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | 85801 | "Caution" |
| mEGFP-N1, 哺乳類発現ベクター | Addgene | 54767 | |
| N1-メチル疑似UTP | イエナバイオサイエンス | NU-890 | |
| フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1), pH 8.0 | SRL BioLit | 136112-00-0" | Caution" |
| リン酸緩衝液生理食塩水 (PBS), pH 7.4 | CellClone | CC3041 | |
| プローブ ソニック | ス ビブラ細胞 | VCX130 | |
| RNAラダー | NEB | N0362S | |
| RNase阻害剤 | Thermo Scientific | N8080119 | |
| SafeView 色素 | abm | G108 | |
| 酢酸ナトリウム | Sigma | S7545 | |
| サーモサイクラー | Applied biosystems | 4375786 | |
| Thermomixer | Eppendrof | 22331 | |
| Tris buffer | SRL BioLit | 71033 | |
| Trypsin | ギブコ | 25200056 |
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