ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

Summary

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ ポリテン細胞のヘテロクロマチン集合体を可視化することを目的としている。

Abstract

免疫染色によるヘテロクロマチン凝集体の可視化は困難な場合があります。クロマチンの多くの哺乳類成分は、ショ ウジョウバエのメラノガスター で保存されている。したがって、ヘテロクロマチンの形成とメンテナンスを研究するための優れたモデルです。 第3インスター D.メラノガスター 幼虫の唾液腺に見られるような多テン化された細胞は、クロマチンが1000回近く増幅するのを観察するための優れたツールを提供し、研究者は核中のヘテロクロマチンの分布の変化を研究することを可能にしました。ヘテロクロマチン成分の観察はポリテーン染色体製剤で直接行うことができるが、一部のタンパク質の局在化は治療の重症度によって変化する可能性がある。したがって、細胞内のヘテロクロマチンの直接可視化は、この種の研究を補完する。本プロトコルでは、この組織に用いられる免疫染色技術、二次蛍光抗体の使用、および共焦点顕微鏡を用いて、これらのヘテロクロマチン凝集体をより精密かつ詳細に観察する方法について述べる。

Introduction

エミール・ハイツ¹の初期研究以来、ヘテロクロマチンは、遺伝子発現、染色体のmeioticおよびmitotic分離、およびゲノム安定性^2、3、4の維持などの細胞プロセスの重要な調節因子と考えられてきました。

ヘテロクロマチンは、主に、反復配列を特徴的に定義する構成ヘテロクロマチンと、テロメアやセントロメレスなどの特定の染色体部位に存在する変容可能な要素の2つに分けられます。この種のヘテロクロマチンは、ヒストンH3のリシン9のジまたはトリメチル化(H3K9me3)およびヘテロクロマチンタンパク質1a(HP1a)5,6の結合などの特異的ヒストンマークによって主にエピジェネティックに定義される。一方、栄養性ヘテロクロマチンは染色体の腕を通して局所化し、主に発達的に沈黙した遺伝子^7、8から構成される。メタフェーズ細胞におけるヘテロクロマチンブロックの免疫染色、または相間細胞におけるヘテロクロマチン凝集体の観察は、ヘテロクロ....

Protocol

1. 第三のインスター幼虫文化

1. 1リットルの酵母、100gの未精製の全てのサトウキビ砂糖、16gの寒天、プロピオン酸10mL、ゼラチン14gを加えて、標準培地を1リットル用意します。800mLの水道水に酵母以外の成分をすべて溶解し、酵母を溶解します。30分間すぐにオートクレーブ。
   1. その後、培地を60°Cまで冷却し、プロピオン酸を最終濃度0.01%に加えます。ゼラチンが形成されるまでボトルを立たせます。
2. 3oインスター幼虫培養を最適化するには、まず5〜10日の成人を収集し、標準培地の広い首のボトルに50(男性25人と女性25人)を配置します。
3. ハエと一緒にボトルを25°Cの制御温度インキュベーターに入れ、産卵数が50個(野生型株の場合は約12時間)になるまで置きます。
4. インキュベーション時間が経過したら、成人を取り除き、新しいボトルに移して手順を繰り返します。胚を18°Cで72時間成長させる
   注: ショウジョウバエ 在庫のメンテナンス条件の詳細については、テネシー州とティンメル¹³を参照してください。

2. 幼虫コレクション

1. 幼虫のコレクションのためにスピラクレスを全く持っていない放浪幼虫を選択してください。スピラクルの発分後、幼虫は、分析に適した優れたポ....

Results

ショウジョウバエ唾液腺におけるHP1a免疫染色の代表的な結果を図1に示す。肯定的な結果は、1つの焦点(図1a)(不均一な凝集または凝縮物)を観察する。負の結果は信号または分散信号ではありません。二重信号、つまり二重点(図1c)を観測できる場合がありますが、通常は少量で発生します。

データ分析は、異なる変異背景内のHP1a分布を比較して、棒グラフとして表すことができる。例えば、 図2 では、野生型核の98%が1つの焦点の分布を提示し、核の2%が2つの病巣を存在させるのに対し、突然変異体では割合が変化し、2つの病巣の存在が40%に増加することがわかります。

図3は、 ショウジョウバエ 唾液腺における代.......

Discussion

真核生物の細胞機能は、核内の3D構造を定義することができ、これはクロマチンとの異なるタンパク質とRNAを含む様々な分子との相互作用によって支えられる。過去3年間で、ヘテロクロマチンを含む関連性を有する生物学的凝縮物は、活性クロマチン^16、17、18の明確な核空間組織を促進する相分離の決定において基本的な役割^を果たしてきた。

ヘテロクロマチンは、細胞の機能と同一性を維持するために不可欠です.以前は、これらの密集した領域は転写されていないと考えられていた。しかし、より強力な技術を持った今、ヘテロクロマチンは転写されるだけでなく、核の足場を維持するための基本的なプロセスであり、発達過程または病理学的プロセス^12、19に敏感であることがわかります。また、心枢性ヘテロクロマチンに埋め込まれた.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量遠心チューブ	Axygen MCT-150-C	11351904	ブランドは重要ではありません
16% ホルムアルデヒド	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	ブランドは重要ではありません
完全なプロテアーゼ阻害剤 Ultra EDTA-free protease阻害剤	メルク	5892953001
カバースリップ	コーニング	CLS285022-200EA	22x22、ブランドは重要ではありません
DTT	Sigma	d9779	ブランドは重要ではありません
EDTA	Sigma	E5134	ブランドは重要ではありません
EGTA			ブランドは重要ではありません
ガラス スライド	ゴールド シール	3011	ブランドは重要ではありません
H3BO3	Baker	0084-01	ブランドは重要ではありません
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	製品形態 濃縮物 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	ブランドは重要ではない
Methanol	Baker	9070-03	ブランドは重要ではない
NaCl	Sigma	71376	ブランドは重要ではない
NaOH			ブランドは重要ではない
PIPES			ブランドは重要ではない
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake チューブ シェーカー
サーモミキサー C	エッペンドルフ	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	ブランドは重要ではありません
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL、ブランドは重要ではありません
β-メルカプトエタノール	Bio-Rad	1610710	25 mL、ブランドは重要ではありません