ショ ウジョウバエ 唾液腺におけるヘテロクロマチン関連タンパク質の可視化のための免疫蛍光染色

サマリー

このプロトコルは、ショ ウジョウバエ ポリテン細胞のヘテロクロマチン集合体を可視化することを目的としている。

要約

免疫染色によるヘテロクロマチン凝集体の可視化は困難な場合があります。クロマチンの多くの哺乳類成分は、ショ ウジョウバエのメラノガスター で保存されている。したがって、ヘテロクロマチンの形成とメンテナンスを研究するための優れたモデルです。 第3インスター D.メラノガスター 幼虫の唾液腺に見られるような多テン化された細胞は、クロマチンが1000回近く増幅するのを観察するための優れたツールを提供し、研究者は核中のヘテロクロマチンの分布の変化を研究することを可能にしました。ヘテロクロマチン成分の観察はポリテーン染色体製剤で直接行うことができるが、一部のタンパク質の局在化は治療の重症度によって変化する可能性がある。したがって、細胞内のヘテロクロマチンの直接可視化は、この種の研究を補完する。本プロトコルでは、この組織に用いられる免疫染色技術、二次蛍光抗体の使用、および共焦点顕微鏡を用いて、これらのヘテロクロマチン凝集体をより精密かつ詳細に観察する方法について述べる。

概要

エミール・ハイツ¹の初期研究以来、ヘテロクロマチンは、遺伝子発現、染色体のmeioticおよびmitotic分離、およびゲノム安定性^2、3、4の維持などの細胞プロセスの重要な調節因子と考えられてきました。

ヘテロクロマチンは、主に、反復配列を特徴的に定義する構成ヘテロクロマチンと、テロメアやセントロメレスなどの特定の染色体部位に存在する変容可能な要素の2つに分けられます。この種のヘテロクロマチンは、ヒストンH3のリシン9のジまたはトリメチル化(H3K9me3)およびヘテロクロマチンタンパク質1a(HP1a)5,6の結合などの特異的ヒストンマークによって主にエピジェネティックに定義される。一方、栄養性ヘテロクロマチンは染色体の腕を通して局所化し、主に発達的に沈黙した遺伝子^7、8から構成される。メタフェーズ細胞におけるヘテロクロマチンブロックの免疫染色、または相間細胞におけるヘテロクロマチン凝集体の観察は、ヘテロクロマティック領域⁹の形成および機能の理解において多くの光を明らかにした。

モデルシステムとしてのショウジョウバエの使用により、電子顕微鏡¹⁰を使用せずにヘテロクロマチンを研究するための必須ツールの開発が可能になった。HP1aなどのヘテロクロマチン関連タンパク質の位置効果変化や発見、ヒストン翻訳後修飾の記述以来、多くのグループはこれらの異球領域^10,11の可視化を可能にするいくつかの免疫組織化学的手法を開発してきた。

これらの技術は、ヘテロクロマチン関連タンパク質またはヒストンマークを認識する特定の抗体の使用に基づいています。細胞の種類や抗体ごとに、固定および透過性の条件を経験的に決定する必要があります。また、スカッシュ技術などの追加の機械的プロセスを使用する場合にも条件が異なる場合があります。このプロトコルでは、ショ ウジョウバエ 唾液腺を用いて異血球性病巣を研究することを説明する。唾液腺は、ゲノムの1,000部以上を含む多着細胞を有しており、衛星DNAおよび複製中の一部の異血球領域を除いて、クロマチンの特徴の大部分を増幅したビューを提供する。それにもかかわらず、ヘテロクロマチン領域はポリテーン染色体製剤で容易に可視化されるが、スカッシュ技術は、特徴的なクロマチン結合複合体またはクロマチンアーキテクチャを破壊する場合がある。したがって、唾液腺組織全体におけるタンパク質の免疫局在化は、これらの望ましくない効果を上回る可能性がある。我々は、いくつかのクロマチン結合タンパク質を検出するためにこのプロトコルを使用しており、我々は、変異型 ショウジョウバエ 株と組み合わせたこのプロトコルは、ヘテロクロマチン破壊¹²を研究するために使用することができることを実証した。

プロトコル

1. 第三のインスター幼虫文化

1. 1リットルの酵母、100gの未精製の全てのサトウキビ砂糖、16gの寒天、プロピオン酸10mL、ゼラチン14gを加えて、標準培地を1リットル用意します。800mLの水道水に酵母以外の成分をすべて溶解し、酵母を溶解します。30分間すぐにオートクレーブ。
   1. その後、培地を60°Cまで冷却し、プロピオン酸を最終濃度0.01%に加えます。ゼラチンが形成されるまでボトルを立たせます。
2. 3oインスター幼虫培養を最適化するには、まず5〜10日の成人を収集し、標準培地の広い首のボトルに50(男性25人と女性25人)を配置します。
3. ハエと一緒にボトルを25°Cの制御温度インキュベーターに入れ、産卵数が50個(野生型株の場合は約12時間)になるまで置きます。
4. インキュベーション時間が経過したら、成人を取り除き、新しいボトルに移して手順を繰り返します。胚を18°Cで72時間成長させる
   注: ショウジョウバエ 在庫のメンテナンス条件の詳細については、テネシー州とティンメル¹³を参照してください。

2. 幼虫コレクション

1. 幼虫のコレクションのためにスピラクレスを全く持っていない放浪幼虫を選択してください。スピラクルの発分後、幼虫は、分析に適した優れたポリテーン染色体を保持しながら、準備段階に入ります。唾液腺の細胞は^14,15のプログラム細胞死に備え始めるのが12時間後に行^われます。
2. 15 3°インスターの幼虫を取り、それらを洗うために時計ガラスに入れてください。次に、氷冷生理食液またはPBS(1x PBS:137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO_4、2mM KH 2 PO 4、2 mM KH₂PO_4、pHを7.4に調整)に移します。
3. 立体顕微鏡下でプロテアーゼ阻害剤を用いた冷たいPBSで15〜30対の唾液腺(または30分でできるだけ多く)を解剖する。唾液腺を氷冷PBSで1.5mLチューブに移します。
4. PBSとプロテアーゼ阻害剤の1 mLで1回洗浄します。組織がチューブの底に達するのを待ちます。
5. 洗浄後、1000 μL ピペットでPBSを取り出します。ティッシュに触れないように注意してください。
   1. あるいは、この洗浄工程の必要性を排除するためにPBSの5mLで唾液腺を解剖し、以下に記載のルブクン固定緩衝液の0.5mLに唾液腺を移すことによってステップ3に進む。

3. 唾液腺組織固定

1. 最後のステップからPBSを取り除いた後、50%メタノール(メタノールの0.5 mLを追加)と2%ホルムアルデヒドで、1x Ruvkun固定バッファーの0.5 mLを直接追加します。
   注:2xルヴクン溶液は、160 mM KCl、40 mM NaCl、20 mM EGTA、30 mMパイプpH 7.4です。
2. 4°Cで2時間、軽い回転でインキュベートします。

4. 唾液腺組織洗浄

1. トリス/トリトンバッファー(100 mMトリスpH 7.4、1%トリトンX-100および1 mM EDTA)の1 mLで1 5分間の回転洗浄を行います。
   メモ:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。

5. パーメビルゼーション

1. トリス/トリトンX-100の1mLで唾液腺をインキュベートする(上記と同じ)。一部のタンパク質では、1%βメルカプトエタノールを添加する必要があります。
2. 軽い振盪(300rpm)で37°Cで2時間インキュベートする。

6. 保存手順(オプション)

注:抗体をインキュベーションに直ちに進まない場合は、以下のように組織を保存してください。

1. 1 mLの BO₃ バッファー (0.01 M H₃BO₃ pH 9.2 + 0.01 M NaOH) で洗浄し、37 °Cで BO₃/10 mM DTT を 15 分間軽度の振盪 (300 rpm) でインキュベートします。
2. インキュベーション期間の終わりに、1 mLの_BO3 緩衝液単独で洗浄を行う。
   メモ:組織がチューブの底に到達するのを待ちます。
3. PBSを1 mL追加します。この溶液中の組織を最大72時間4°Cで保存し、次のステップに進みます。このステップは、遅延ライフサイクルを提示する可能性のある異なる変異株を扱う場合に特に有用であり、免疫検出はコントロールと同時に行うことができる。

7. 組織ブロッキング

1. 唾液腺をバッファーB(PBS + 0.1% BSA + 0.5% トリトン X-100 + 1 mM EDTA)の1 mLで室温で2時間培養します。

8. 免疫染色

1. すべてのバッファーBを取り外し、目的の抗体を加えて、バッファーA(PBS + 0.1%BSA)を加えます。
   注:ハイブリドーマバンクのHP1a C1A9c(濃縮抗体)は、1:3000まで使用します。C1A9s(上清)を使用する場合、我々は1:100から1:500希釈に試みており、このランク間の希釈はうまく機能します) 一晩で4 oCで回転します。この時点で、揺れが抗体に損傷を与える可能性のある気泡を発生しないことが重要です。

9. 免疫染色洗浄

1. 毎回1mLを用いて室温で撹拌下でバッファーBで3 x 15分の洗剤を行う。
2. 4oCで2時間回転下で2時間、フルオロフォアに結合した二次抗体と共に緩衝Bに腺を移す(2次抗体Alexa fluor 568 Invitrogenは1:3000を使用した)。
   1. 二次抗体を光から保護するために、チューブをアルミ製のホイルで覆います。
3. バッファーBの1 mLで回転しながら室温で2 x 15分の洗剤を行います。
4. シトックス(5mMストックの2μLを取り、バッファBの1mLに溶解する)またはHoechst(10mg/mLストックの1μLを取り、バッファBの1mLに溶解する)などのDNAマーカーを室温で10分間インキュベートします。
5. バッファーBで1回、PBSで1回洗浄を行い、各洗浄は室温で回転しながら10分間持続します。
   注:光から保護することを忘れないでください。

10. イメージング

1. 唾液腺をスライドに取り付け、カバースリップ付きのプールを作ります。
2. 唾液腺をプールの真ん中に入れ、AF1シティフルオールで覆い、粘性液体を広げる気泡の形成を避けます。その後、透明なマニキュアですべての側面をシールします。
3. 蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で観察します。同じ日にサンプルが観測されない場合は、光から離して4°Cで保管してください。
4. グラフパッドプリズム6を使用して、すべてのグラフと統計分析を生成します。
5. クリュスカル・ウォリス検定を用いて唾液腺のHP1a分布のデータを分析します。統計的有意性は(0.05*、0.01**<0.01**、< 0.001***、<0.0001****

結果

ショウジョウバエ唾液腺におけるHP1a免疫染色の代表的な結果を図1に示す。肯定的な結果は、1つの焦点(図1a)(不均一な凝集または凝縮物)を観察する。負の結果は信号または分散信号ではありません。二重信号、つまり二重点(図1c)を観測できる場合がありますが、通常は少量で発生します。

データ分析は、異なる変異背景内のHP1a分布を比較して、棒グラフとして表すことができる。例えば、 図2 では、野生型核の98%が1つの焦点の分布を提示し、核の2%が2つの病巣を存在させるのに対し、突然変異体では割合が変化し、2つの病巣の存在が40%に増加することがわかります。

図3は、 ショウジョウバエ 唾液腺における代...

ディスカッション

真核生物の細胞機能は、核内の3D構造を定義することができ、これはクロマチンとの異なるタンパク質とRNAを含む様々な分子との相互作用によって支えられる。過去3年間で、ヘテロクロマチンを含む関連性を有する生物学的凝縮物は、活性クロマチン^16、17、18の明確な核空間組織を促進する相分離の決定において基本的な役割^を果たしてきた。

ヘテロクロマチンは、細胞の機能と同一性を維持するために不可欠です.以前は、これらの密集した領域は転写されていないと考えられていた。しかし、より強力な技術を持った今、ヘテロクロマチンは転写されるだけでなく、核の足場を維持するための基本的なプロセスであり、発達過程または病理学的プロセス^12、19に敏感であることがわかります。また、心枢性ヘテロクロマチンに埋め込まれた...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1.5 mL 微量遠心チューブ	Axygen MCT-150-C	11351904	ブランドは重要ではありません
16% ホルムアルデヒド	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	ブランドは重要ではありません
完全なプロテアーゼ阻害剤 Ultra EDTA-free protease阻害剤	メルク	5892953001
カバースリップ	コーニング	CLS285022-200EA	22x22、ブランドは重要ではありません
DTT	Sigma	d9779	ブランドは重要ではありません
EDTA	Sigma	E5134	ブランドは重要ではありません
EGTA			ブランドは重要ではありません
ガラス スライド	ゴールド シール	3011	ブランドは重要ではありません
H3BO3	Baker	0084-01	ブランドは重要ではありません
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	製品形態 濃縮物 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	ブランドは重要ではない
Methanol	Baker	9070-03	ブランドは重要ではない
NaCl	Sigma	71376	ブランドは重要ではない
NaOH			ブランドは重要ではない
PIPES			ブランドは重要ではない
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake チューブ シェーカー
サーモミキサー C	エッペンドルフ	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	ブランドは重要ではありません
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL、ブランドは重要ではありません
β-メルカプトエタノール	Bio-Rad	1610710	25 mL、ブランドは重要ではありません