方法論記事

質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによるグローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化分析

DOI：

10.3791/62409

⸱

2022年4月28日

 ,  ,  , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology IRCCS (IEO), 2European School of Molecular Medicine (SEMM), c/o Campus IFOM-IEO

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、複数の生物学的経路を調節する広範な翻訳後修飾です。質量分析は、修飾ペプチド濃縮のための生化学的アプローチと組み合わせると、R-メチルプロテオームをグローバルにプロファイリングするための最良の技術です。ここでは、ヒト細胞における全体的なR-メチル化を高信頼で同定するために設計されたワークフローについて説明します。

要約

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タンパク質アルギニン(R)-メチル化は、RNAプロセシング、シグナル伝達、DNA損傷応答、miRNA生合成、翻訳など、いくつかの細胞経路の調節に関与する広範なタンパク質翻訳後修飾(PTM)です。

近年、生化学的および分析的開発のおかげで、質量分析(MS)ベースのプロテオミクスが、単一部位分解能で細胞のメチルプロテオームを特徴付けるための最も効果的な戦略として浮上しています。しかし、MSによる in vivo タンパク質R-メチル化の同定とプロファイリングは、主にこの修飾の化学量論的性質と、さまざまなアミノ酸置換の存在、およびメチル化に同重な酸性残基の化学的メチルエステル化のために、依然として困難でエラーが発生しやすいままです。したがって、R-メチルペプチドの同定を強化するための濃縮法と、メチルプロテオミクス研究における偽発見率(FDR)を低減するための直交検証戦略が必要です。

ここでは、細胞サンプルからの高信頼性R-メチルペプチドの同定と定量のために特別に設計されたプロトコルについて説明し、細胞の代謝標識を重同位体コードメチオニン(hmSILAC)および二重プロテアーゼ溶液中消化で全細胞抽出物に結合し、その後、オフライン高pH逆相(HpH-RP)クロマトグラフィー分画と抗汎-R-メチル抗体を使用したR-メチルペプチドのアフィニティー濃縮を行います。高分解能MS分析では、生データはまずMaxQuantソフトウェアパッケージで処理され、その結果はMaxQuant出力ファイル内の軽メチルペプチドと重メチルペプチドに対応するMSピークペアの詳細な検索用に設計されたソフトウェアであるhmSEEKERによって分析されます。

概要

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アルギニン(R)-メチル化は、哺乳類プロテオームの約1%を修飾する翻訳後修飾(PTM)です1。タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)は、Rの側鎖のグアニジノ基の窒素(N)原子に1つまたは2つのメチル基を対称的または不斉に沈着させることによってR-メチル化反応を触媒する酵素です。哺乳動物では、PRMTは、モノメチル化(MMA)と不斉ジメチル化(ADMA)、MMAと対称ジメチル化(SDMA)の両方を沈着させる能力に応じて、タイプI、タイプII、およびタイプIIIの3つのクラスに分類でき、それぞれMMAのみである2,3。PRMTは主に、GARモチーフとして知られるグリシンおよびアルギニンリッチ領域内に位置するR残基を標的としていますが、PRMT5やCARM1などの一部のPRMTは、プロリン-グリシン-メチオニンリッチ(PGM)モチーフをメチル化することができます4。R-メチル化は、RNAスプライシング5、DNA修復6、miRNA生合成7、翻訳2など、いくつかの生物学的プロセスのタンパク質調節因子として浮上しており、このP....

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プロトコル

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1.細胞培養とタンパク質抽出(時間:3〜4週間必要)

  1. HeLa細胞を、それぞれ軽(L)または重(H)メチオニンのいずれかを供給された培地で並行して増殖させる(培地組成については 表1 を参照)。少なくとも8回の細胞分裂を行ったら、各SILACチャネルから細胞のアリコートを収集し、取り込み試験を実行します。
    注:取り込み効率を確認するには、LC-MS / MS分析によって、ヘビーチャネル内の重いメチオニン(Met-4)の割合が可能な限り100%に近いことをテストします。LC-MS/MSで重標識細胞のアリコートを分析し(設定については表 2を参照)、 表3に示すパラメーターを使用してMaxQuantでMSデータを処理します。Met-4の組み込みを確認するには、社内で開発されたスクリプトを https://bitbucket.org/EMassi/hmseeker/src/master/ で入手できます。
  2. メチオニンの大量取り込みは、>97%に達したら完了したと考えてください。各チャネルが全数約60×10に達すると、6 個の細胞(HeLa細胞については85%コンフルエントでそれぞれ15cmの約40皿に相当し、細胞型によって変動する)を採取する。それらを注意深く数え、1:1の比率で混合し、335 x g で4°Cで5分間遠心分離することによりペレット化し....

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結果

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本稿では、タンパク質抽出物の酵素消化と2つの異なるプロテアーゼの並列処理、それに続くタンパク質分解ペプチドのHpH-RP液体クロマトグラフィー分画、および抗汎-R-メチル抗体によるR-メチルペプチドの免疫親和性濃縮の組み合わせに基づく、グローバルプロテインR-メチル化の高信頼性同定のワークフローについて説明します(図1)。

細胞は、天然(Light、L、Met-0)または同位体標識(Heavy、H、Met-4)のいずれかのメチオニンの存在下で増殖させた。Met-4のみの抽出物の少量のアリコートでMS分析によってテストされた完全な同位体標識時に、 図1Aに示すように、重い細胞と軽い細胞を回収し、1:1 L / Hの比率で混合しました。 13CD3-メチオニン代謝標識により、メチル基はメチル供与体S-アデノシルメチオニン(SAM)からタンパク質骨格に付加され、軽同位体または重同位体のいずれかの形で存在します

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ディスカッション

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グローバルMSベースのプロテオミクスによる in vivo タンパク質/ペプチドメチル化の高信頼同定は、高いFDRのリスクのために困難であり、メチル化に同重体であり、直交MS検証戦略がない場合に誤った割り当てを引き起こす可能性のあるサンプル調製中にいくつかのアミノ酸置換およびメチルエステル化が発生します。このPTMの化学量論的性質は、グローバルなメチルプロテオミクスのタスクをさらに複雑にしますが、修飾ペプチドの選択的濃縮によって克服することができます10。

ここでは、HpH-RPクロマトグラフィーペプチド分画および抗汎-R-メチルペプチド抗体キットとの親和性濃縮に結合されたhmSILAC戦略の適用を通じて、R-メチルペプチドのグローバルMS分析の効率と信頼性を高めるように設計された生化学的および分析ワークフローを紹介します。前者の戦略はメチルペプチドの直交検証を可能にし、同定のFDRを強力に減少させ、後者のプロトコルは未修飾ペプチドのバックグラウンドからの検出可能性を高める22

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開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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MMとEMは、欧州分子医学学校(SEMM)の博士課程の学生です。EMは、3年間のFIRC-AIRC奨学金(プロジェクトコード:22506)の受領者です。結核グループのR-メチルプロテオームのグローバル分析は、AIRC IGグラント(プロジェクトコード:21834)によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
重炭酸アンモニウム (AMBIC)Sigma-Aldrich09830
過硫酸アンモニウム (APS)Sigma-Aldrich497363
C18 Sep-Pak カラム vacc 6cc (1g)WatersWAT036905
Colloidal Coomassie staining InstantSigma-AldrichISB1L-1L
cOmplete Mini, EDTA-freeRoche-Sigma Aldrich11836170001プロテアーゼ阻害剤
透析ウシ胎児血清 (FBS)GIBCO ThermoFisher26400-044
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich3483-12-3
DMEM MediumGIBCO ThermoFisherご要望 安定したグルタミンとメチオニンなし
EASY-nano LC 1200 クロマトグラフィーシステムThermoFisher
EASY-Spray HPLC カラムThermoFisherES907
グリセロSigma-AldrichG5516
HeLa細胞ATCCATCC CCL-2
HEPESSigma-AldrichH3375
ヨードアセトアミド (IAA)Sigma-Aldrich144-48-9
Jupiter C12-RP columnPhenomenex00G-4396-E0
L-メチオニンSigma-AldrichM5308Light (L) Methionine
L-Methionine-(methyl-13C,d3)Sigma-Aldrich299154Heavy (H) Methionine
LysargiNaseMerck MilliporeEMS0008
マイクロチップ細胞攪乱型Sonifier 250Branson
N,N,N′,N′-テトラメチルエチレンジアミン (TEMED)Sigma-AldrichT9281
ペニシリン-ストレプトマイシンGIBCO ThermoFisher15140122
PhosSTOPRoche-Sigma Aldrich4906837001Phosphatase Inhibitor
Pierce C18 TipsThermoFisher87782
Pierce  0.1% ギ酸 (v/v) in Acetonitrile, LC-MS GradeThermoFisher85175LC-MS Solvent B
Pierce  0.1% ギ酸 (v/v) in water, LC-MS GradeThermoFisher85170LC-MS Solvent A
Pierce アセトニトリル(ACN)、LC-MS グレードThermoFisher51101
Pierce 水、LC-MS グレードThermoFisher51140
ポリアクリルアミドSigma-Aldrich92560
Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein StandardsBio-Rad1610373
PTMScan 抗体 &-ADMACell Signaling Technology13474
PTMScan 抗体 &-MMACell Signaling Technology12235
PTMScan 抗体 &-SDMACell Signaling Technology13563
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass分光計サーモフィッシャー
シーケンシンググレード 改質トリプシンプロメガV5113
トリフルオロ酢酸シグマ・アルドリッチT6508
アルティメット 3000 HPLCジオネックス
尿素シグマ・アルドリッチU5378
真空濃縮器 5301エッペンドルフスピード VAC

参考文献

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  1. Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
  2. Blanc, R. S., Richard, S.

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R pH LysargiNase

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