方法論記事

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究

DOI：

10.3791/62419

⸱

2021年5月10日

 , 
1Cardiovascular Research Center, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Diabetes, Obesity and Metabolism Institute, Department of Medicine, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

この記事について

サマリー

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この記事では、2段階コラゲターゼ法によるマウス大動脈弁細胞の単離について説明します。孤立したマウス弁細胞は、この インビトロ 石灰化アッセイのような異なるアッセイを行う場合や、大動脈弁鉱化につながる分子経路を調べるために重要です。

要約

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大動脈弁細胞の石灰化は大動脈狭窄の特徴であり、弁カスプ線維症に関連している。弁間質細胞(VIC)は、骨芽細胞様細胞への脱分化プログラムの活性化を通じて大動脈狭窄における石灰化プロセスにおいて重要な役割を果たす。マウスVICは大動脈弁細胞の鉱化を駆動するシグナル伝達経路の解明のための良いインビトロツールである。本明細書に記載された方法は、これらの著者によってうまく使用され、新たに単離された細胞を得る方法を説明する。2段階コラゲナーゼ処置を1mg/mLおよび4.5mg/mLで行った。最初のステップは、内皮細胞層を除去し、汚染を避けるために重要です。第2のコラゲナーゼインキュベーションは、組織からプレートへのVICの移行を容易にすることである。また、単離されたマウス弁細胞の表現型特性評価のための免疫蛍光染色法についても議論される。さらに、カルシウム試薬測定手順およびアリザリン赤染色を用いてインビトロで石灰化アッセイを行った。マウスバルブ細胞一次培養の使用は、インビトロで細胞の無機化を阻害する新しい薬理学的標的を試験するために不可欠です。

概要

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石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、西洋集団において最も一般的な弁膜心疾患であり、1歳の65歳以上の高齢者の2.5%近くに影響を及ぼす。CAVDは600万人以上のアメリカ人に影響を及ぼし、正常な血流を損なうリーフレットの機械的特性の変化に関連している-1,2.現在、疾患の進行を止めたり、ミネラル退縮を活性化したりする薬理学的治療法はない。CAVDを治療するための唯一の有効な治療法は、手術または経カテーテル大動脈弁置換術3による大動脈弁置換術である。したがって、新しい薬理学的標的を特定するためには、バルブの鉱物化につながる分子メカニズムを調査することが不可欠です。実際、非治療大動脈狭窄症は、左心室機能不全および心不全4のようないくつかの有害な結果を有する。

大動脈弁は、線維症、海綿体、心室症と呼ばれる3層から構成され、NICを主な細胞タイプ5として含んでいる。線維症と心室は血管内皮細胞(VEC)5の層で覆われている。VECは、炎症細胞の透過性とパラクリンシグナルを調節します。増加した機械的ストレスは、VECの完全性に影響を及ぼし....

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プロトコル

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注:ここで説明されているすべての動物の手順は、マウントシナイ機関コアと使用委員会のIcahn医学部によって承認されています。

1. 成体マウスからの弁細胞分離前の調製

  1. 図1Aに示す手術器具をすべて洗浄し、70%のv/vエタノールを使用し、その後30分間オートクレーブして、70%エタノールで手術用ワークスペースを洗浄します。
  2. 500 μLのペニシリンストレプトマイシンを50 mLの10 mm HEPESに加えます。50 mLの 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のアリコートを準備します。氷の上にソリューションを維持します。
  3. 1 mg/mLおよび4.5 mg/mLコラゲナーゼ溶液を調製し、15 mLチューブ内の各溶液の5 mLを使用して、全手順を実行します。1 mg/mLコラゲラーゼの5 mLを調製するには、5 mgのコラゲラーゼと2.5mLのダルベックコの変性イーグル培地(DMEM、ウシ胎児血清(FBS)フリー))と10mM HEPESの2.5 mLを抗生物質(1%ペニシリン・ストレプトマイシンステップ1.2から)を混ぜます。0.22 μmフィルターでソリューションをフィルター処理して、汚染を除去します。
    注:酵素を保護するために氷の上にソリューションを保管してください。
  4. DMEM溶液を37°Cに温め、下記のすべてのステップで使....

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結果

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マウス大動脈弁は通常直径1mmであるため、異なる実験手順のために100万個の生存細胞を収集するために少なくとも3つのバルブをプールする必要があります。VIC 分離プロセスの異なる手順を図1と図 2に示します。バルブ組織を手動で削ることが困難であるため、渦を除去して渦を除去することによって生じるせん断応力を使用することが好ましい。実際、CD31免疫蛍光染色結果は、内皮細胞の汚染の欠如を示した(図3D)。また、マウスVICは、バルブセルの主要マーカーであるビメンチンおよびα-SMAを発現する(図3B、C)。

インビトロでの細胞の鉱物化
カルシウム試薬キットを使用してカルシウム濃度を測定しました。石灰化培地で処理した細胞は、非処.......

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ディスカッション

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本稿では、一次培養のためのマウス弁細胞分離の詳細なプロトコルを紹介する。8週齢のマウスから3つの大動脈弁をプールし、十分な数の細胞を得た。さらに、このプロトコルは、VIC表現型の特性評価と インビトロ 鉱化アッセイを記述する。 この方法は、マチューら7から先に説明したプロトコルから適応した。

大動脈弁の分離の間、細菌またはマイコプラズマの汚染から細胞を保護するために可能な伝染のすべての源を避けるために注意しなければならない。確かに、実験を開始する前にすべての外科ツールをオートクレーブすることが重要です。HEPES溶液は、細菌感染を最小限に抑えるために1%の抗生物質を補充する必要があります。さらに、マイコプラズマは細胞病理学を引き起こし、結果的に細胞培養10において測定されたすべてのパラメータを妨害する。

培養液の量が少ない小培養皿のめっき細胞は、VICの増殖および増殖にとって重要である。組織を落ち.......

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3 mm刃ハサミF.S.T15000-00
抗アルファ平滑筋 アクチン抗体アブカム
アンチマウス、アレクサ フルオア 488 コンジュゲート細胞シグナル伝達4412
アルセナゾ-III試薬セットポイントサイエンティフィックC7529-500カルシウムの濃度を測定するキット
ボンハサミF.S.T14184-09
水酸化カルシウムSIGMA -Aldrich 3121931219
CD31Novusbio
Collagenase Type I (125単位/mg)サーモフィッシャー サイエンティフィック17018029
DMEMTthermofisher11965092
極細ブドウ鉗子F.S.T11150-10
FBSGibco 16000044
細鉗子F.S.T Dumont
HClSIGMA-ALDRICHH1758
HEPES 1 M solutionSTEMCELLSテクノロジー
L-グルタミン 100xサーモフィッシャー サイエンティフィA2916801
マイコザップランザVZA-2011マイコプラズマ除去試薬
PBS 10xシグマ-アルドリッチ
ペネシリン ストレプトマイシン 100xサーモフィッシャー サイエンティフィ10378016
ピルビン酸ナトリウム 100 mMサーモフィッシャー サイエンティフィック
標準パターン鉗子 F.S.T11000-12
手術用ハサミ - シャープ-ブラントF.S.T14008-14
トリプシン 0.05%サーモフィッシャー サイエンティフィ25300054
ビメンチンアブカム
ック ック 11360070ック

参考文献

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  1. Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
  2. Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....

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