Method Article

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

DOI:

10.3791/62436

⸱

September 18th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Molecular Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Moscow Institute of Physics and Technology, 2Department of Immunology, Shemyakin and Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Institute of Biological Information Processing (IBI-7: Structural Biochemistry), Forschungszentrum Jülich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア(3μmの大きさ)の分布の定量分析方法について述べた。この方法は、様々な病理状態モデルにおける気道中の微粒子およびナノ粒子凝集分布の分析にも使用することができる。

Abstract

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アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディアは、ヒトの気道に侵入することができる空中病原体である。アレルギーのない免疫管轄者は抵抗性および免疫学的耐性を示し、免疫不全患者では、コニディアは気道を植民地化し、重度の侵襲性呼吸器疾患を引き起こす可能性がある。異なる気道コンパートメント内の様々な細胞は、真菌の侵入を防ぐ免疫応答に関与しています。しかし、病原体の排除の時空間的な側面はまだ完全には理解されていません。光学的にクリアされた全実装器官、特に実験用マウスの肺の3次元(3D)画像化により、感染後の異なる時点で気道中の蛍光標識病原体を検出することができます。本研究では、気道における A.フミガトゥス コニジア分布の定量分析を行う実験セットアップについて説明する。蛍光共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)を用いて、マウスへの中咽頭適用から6時間後に気管支枝および肺胞コンパートメントにおける蛍光標識されたコニディアの位置を追跡した。ここで説明するアプローチは、免疫応答の異なる段階での病原体の正確な位置の検出および病原体相互作用細胞の同定に以前に使用された。実験のセットアップは、異なる病理条件における病原体の除去の運動を推定するために使用することができる。

Introduction

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日常的に、人々は、気道1に浸透し得る日和見真菌アスペルギルス・フミガトゥス(A.フミガトゥス・コニディア)の胞子を含む空中病原体を吸入する。哺乳類の気道は、気道壁2、3、4の異なる構造によって特徴付けられる異なる世代の気道のシステムである。気管気管支壁は、粘液性クリアランス5を提供する毛状細胞である複数の細胞タイプから構成されている。肺胞では、毛様体細胞がなく、粘膜クリアランス6では浸透性肺胞空間病原体を排除できない。さらに、各気道生成は複数の免疫細胞集団のニッチであり、これらの集団のサブセットは特定の気道コンパートメントにとってユニークである。したがって、肺胞マクロファージは肺胞室に存在し、気管と伝導気道の両方が上皮内樹状細胞7,8と並んでいる。

A.フミガトゥスコニディアの概算サイズは2-3.5 μm9.ヒトやマウスでも小さな気道....

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Protocol

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ここで説明する実験動物に関するすべての方法は、ロシア科学アカデミーシェミヤキン・オヴチンニコフ生物有機化学研究所(IACUC)の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています(プロトコル番号226/2017)。

1. フミガトゥス ・コニディアアプリケーション

  1. 蛍光標識 A.フミガトゥス ・コニディアを得るために、コニディアペレットに3%パラホルムアルデヒドの1mLを加えて5×108 コニディアを固定する。50 mL試験管で、室温でシェーカー上で2時間インキュベートします。
  2. 20 mLのリン酸緩衝塩水(PBS)でコニディアを洗浄する:15分間1,000 x gで遠心分離機を15分間、静かに取り出し、20 mLのボリュームで新鮮なPBSを加えます。繰り返す。
  3. 0.1 M NaHCO3の900 μLでコニディアを溶かします。
  4. 594 nm蛍光色素のコハニミジルエステルを100μLのジメチルスルホキシドで溶解し、コニディアに添加します。
  5. 室温で150rpmでシェーカー上で1時間、色素と共にコニディアをインキュベートします。
  6. 遠心分離機で20mLのPBSで2回、15分間1,000 x gでコニディアを洗浄します。
  7. PBSで1×108

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Results

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上記のプロトコルに従って、マウスの肺葉の気道およびA.フミガトゥス・コニディアを示す3D画像が得られた(図1A)。ストレプトアビジン(気道の可視化に使用された)は、気管支および気管支15とラベル付けされた。さらに、その形態によって気道と容易に区別できる大血管と、胸膜は気道チャネルで視覚化される(図1A-C)。気道表面とマスクの作成は、船舶の除去と気道チャネルの胸膜突起を許可しました。しかし、気管支の枝にストレプトアビジンの弱い信号が原因で気道表面の完全性が破壊される(図1B-C)。気道マスクのさらなる処理は、欠落した断片の修復を可能にする(図1D)。

マウスの肺におけるA.フミガトゥス・コニディア.......

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Discussion

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全臓器3Dイメージングは、標本の解剖なしでデータを取得することを可能にし、これは、生物における病原体の解剖学的分布の空間的側面を調査する上で非常に重要である。レーザー光散乱を克服し、全臓器イメージング15、16、18、19を可能にする組織光学クリアリングのいくつかの技術と修正があります。カスタム組織クリアリングアプローチの1つは、メタノールベースの組織脱水と脱脂、続いてBABBによる光学的クリアリングで構成されています。このアプローチは100年以上前に開発され、いくつかの変更があります。私たちの研究では、Scottらが説明した最も簡単な修正を使用します。15このようなアプローチは、蛍光標識病原体での使用に最適です。また、長時間の撮像のためには高いフォトタンスを有するフッ素色が好ましい。残念ながら、トランスジェニックTd.......

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Disclosures

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著者らは、この研究に利益相反はないと報告している。

Acknowledgements

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著者らは、スヴェン・クラップマン教授(ドイツの大学病院エアランゲンとFUAエルランゲン・ニュルンベルク)が アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア株AfS150を提供してくれたことに感謝する。著者らはMIPTプレスオフィスに感謝します。V.Bロシア連邦の科学と高等教育省を認める(#075-00337-20-03、プロジェクトFSMG-2020-0003)。 A.フミガトゥス コニディアイメージングと定量に関する研究は、RSF No 19-75-00082によってサポートされました。気道のイメージ投射に関する仕事はRFBR No 20-04-60311によって支えられた。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
アレクサフロー594 NHSエステルサーモフィッシャーA20004<
em>Aspergillus fumigatus分生子ATCC46645AfS150、ATCC 46645誘導体
ベンジルアルコールPanreac141081.161198.0-100 %
安息香酸ベンジルクロスAC10586-001099 +%
C57Bl / 6マウスプーシキーノ動物ブリーディングセンター(ロシア)オス 生後12週から30週齢。
カテーテルVenisystemsG715-A0118G
細胞イメージングカバーガラス底チャンバーエッペンドルフ307420284または8ウェルチャンバー カバーガラス底部付き
遠心分離機エッペンドルフ5804R1000gの遠心分離機が使用可能
共焦点レーザー走査顕微鏡ZEISSLSM780
ジメチルスルホキシド Sigma-Aldrich276855≥99.9%
FIJI画像処理パッケージFIJIフリーソフト
鉗子B.ブラウンAesculapBD557R歯付き
鉗子B.ブラウンAesculapBD321R細い
先端鉗子Bochem1727滑らかな
ガラス瓶デュラン242101304接地蓋付き
グラフィックエディタ Photoshopアドビ フォトショップ CS
GraphPad ソフトウェアGraphPadプリズム8
イマリス 顕微鏡イメージングソフトウェアオックスフォードインスツルメンツ無料トライアル https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial
イソフルランカリズ
ー NaHCO3Panreac141638
客観的なZEISS420640-9800-000 プランアポクロマート、10 ×(NA=0.3)
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127
PBSPanecoP060Π
ピペットProLine7220205 to 50 μL
粉ミルクRothT145.2
サンプルミキサーDynalMXIC1
はさみB. BraunBC257R鈍
いシェーカーApexlabGS-2050-300 rpm
SkalpelBochem12646
絹糸B. Braun3 USP
Streptavidin, Alexa Fluor 488コンジュゲートサーモフィッシャーS11223
試験管SPL ライフサイエンス5005050 mL
トリス (ヒドロキシメチルアミノメタン)HeliconH-1702-0.5 氏121.14;CAS番号:77-86-1
Triton X-100AmrescoAm-O694-0.1
ZEN顕微鏡ソフトウェアZEISSZEN2012 SP5https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html
株アアドビ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
  2. Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Re....

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