MRGPRX2受容体を介してマスト細胞を活性化できる短いペプチドのライブラリーを生成する技術が記載されている。関連する技術は、容易で安価であり、他の細胞受容体に拡張することができる。
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この記事について
サマリー
要約
治療上重要な細胞受容体に特異的なリガンドを同定することは、新しい治療薬の設計と開発を含む多くの用途にとって極めて重要である。マス関連Gタンパク質受容体X2(MRGPRX2)は、肥満細胞の活性化を調節する重要な受容体であり、したがって、一般的な免疫応答を導く。MRGPRX2に対する多数のリガンドが同定されており、PMP、ディフェンシン、LL-37および他のタンパク質断片(すなわち、分解されたアルブミン)のような内因性ペプチドが含まれる。MRGPRX2特異的リガンドのさらなる同定には、多数のペプチド(すなわち、ペプチドライブラリー)のスクリーニングが必要である。しかし、肥満細胞は インビトロ で維持するのが難しく高価であり、したがって、多数の分子をスクリーニングするために使用することは経済的ではない。本論文は、MRGPRX2を用いてHEK細胞を発現する小ペプチド分子のライブラリーを設計、開発、およびスクリーニングする方法を示す。この細胞株は維持するために比較的容易で安価であり 、in vitro ハイスループット分析に使用することができる。活性化時に細胞内カルシウムフラックスをマークするカルシウム感受性フラ2蛍光色素を使用して、活性化を監視した。340nmおよび380nmの励起波長に対する510nmにおけるフラ-2の蛍光強度の比を用いてカルシウム濃度を算出した。このシステムを検証するために使用されるペプチドライブラリーは、内因性のproadrenomedullin N末端12(PAMP-12)分泌基化に基づいており、MRGPRX2を高い特異性および親和性で結合することが知られている。その後のペプチドは、PAMP-12に適用されるアミノ酸切り捨ておよびアラニンスキャン技術を介して生成された。ここで説明する方法は、結合ドメインおよび受容体活性化において重要な役割を果たす他の重要なパラメータを同定するために、化合物の大規模なライブラリをスクリーニングするための簡単で安価でありながら堅牢である。
概要
マスト細胞は免疫系の不可欠な部分であり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方で重要な役割を果たしています。マスト細胞は、主に免疫グロブリンE(IgE)-FcεRI受容体複合体への抗原の結合によって、または最近発見されたマス関連Gタンパク受容体-X2(MRGPRX2)1によって活性化される。MRGPRX2活性化はいくつかの免疫疾患および炎症性疾患に関連しており、したがって、受容体のリガンド2への結合機構を理解することが重要である。そのために、HEK細胞で過剰発現したMRGPRX2受容体に対して、小ペプチド分子のライブラリーが開発され、スクリーニングされた。研究では、ペプチドライブラリーは、アラニンスキャンとアミノ酸切り捨ての単純で汎用性の高い技術を使用して構築されました。アラニンスキャンは、アラニン残基に特定のアミノ酸を置き換えることを含みます.アラニンは小さく中性であり、置換された残基によって与えられた特定の特性のペプチドを取り除き、受容体相互作用におけるアミノ酸のそれぞれの生理化学的性質の重要性を連続的に強調する。逆に、アミノ酸切り捨てでは、ペプチド配列は、N末端、C末端、またはその両方から1つ以上のアミノ酸残基を欠くように設計されている。この一組のペプチドは、MRGPRX2結合に重要なアミノ酸配列を同定するために使用された。
ヒト肥満細胞株(LAD-2)の経験は、これらの細胞が
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プロトコル
ペプチドライブラリーの設計・開発
- 既知のリガンドすなわちPAMP-1213に基づいてマスト細胞MRGPRX2受容体のリガンドを同定するために、以下の手順に従う。
- リガンドのN末端アミノ酸残基を切り捨てることによりN切り捨てペプチドライブラリーを生成し、続いて、固相ペプチド合成(SPPS)によって生成する。
- 既知のリガンドのC末端アミノ酸残基をSPPSによって連続して切り捨てることにより、C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
- 1.1.1と1.1.2の結果に基づいて、それぞれNとC末端から所望の残基を切り捨てることによってSPPSを用いてN+C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
- 固相ペプチド合成を用いてペプチド13を合成する。
- N端子をアセチル(Ac)グループに、C端子をアミドグループに変更します。
- 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた純度と質量分析光度計を用いた質量に対して、ペプチドを特徴付けます。
- 親PAMP-12分子内の特定のアミノ酸の重要性を調べるために、以下の手順に従ってください。
- ペプチド分子のそれぞれのアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、一度に1つ....
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結果
表1は、末端アミノ酸切り捨ておよびアラニン走査を介して生成されるペプチド配列を含む。表1に示すように、ペプチド配列RKKWNKWALSRはその親PAMP-12に対してN末端フェニルアラニン(F)を欠いているため、N切り捨てライブラリーにおける代表的なペプチドである。同様に、FRKKWNKWALSでは、PAMP-12C末端セリンが除去されており、PAMP-12に由来するC切り捨てられたペプチドライブラリーを表す。N+C切り捨てられたペプチドライブラリーでは、NとC末端の両方からアミノ酸が除去される。N末端からの4アミノ酸の切り捨てとPAMP-12のC末端からの1残基の切り捨てはWNKWALSで生じる。アラニンスキャンに由来するペプチドライブラリーは、1つのアミノ酸をアラニンに置換し、ARKKWNKWALSRと同様に、N末端フェニルアラニンがアラニンに置き換えられる。フラ-2 AM色素は、MRGPRX2トランスフェクトHEK細胞1に対するペプチドの活性化電位を研究するために使用された。データは蛍光プレートリーダーに記録された。.......
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ディスカッション
カルシウムシグナル伝達は、マスト細胞脱顆粒の中心であり、受容体リガンド相互作用、リガンド同定、および創薬14の研究において広く用いられている。MRGPRX2は、かゆみ、喘息、アトピー性皮膚炎などの多くの炎症性疾患において重要な役割を果たしていることが最近発見されたマスト細胞受容体である2。さらに、いくつかの承認された薬物は、MRGPRX2受容体15を介して炎症反応を引き出すことを示している。したがって、リガンドと受容体の相互作用を研究し、新しいリガンドを同定し、活性化メカニズムを理解することが不可欠です。本研究では、ペプチドライブラリーの設計(表1)およびMRGPRX2ベースのマスト細胞活性化の研究における一般的なペプチド技術の使用を示す。基礎となるカルシウム動員は、肥満細胞活性化の指標として用いた。
フラ2は、細胞内カルシウム濃度を測定するために使用されるカルシウム感受性色素です。アセトキシメチルエステ.......
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開示事項
著者は競合する利益を宣言しません。
謝辞
SRとLDUは、アルバータ州のイノベーションズ戦略研究プロジェクト、NRC、NSERCディスカバリーの助成金を認め、このプロジェクトに対して認めます。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| ウシ血清アルブミン | Σ Aldrich | 5470 | |
| 塩化カルシウム | Σ Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Σ Aldrich | CLS3603 | |
| 黒色ポリスチレン マイクロプレート | Σ Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | 高血糖 |
| DMSO | Thermoフィッシャー | D12345 | 滅菌、生物学的グレード |
| EGTA | シグマ アルドリッチ | E3889 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャー | 12483-020 | |
| フレックスステーション 3 | 分子デバイス | FV06060 | |
| フラ-2 AM | サーモフィッシャー | F1221 | |
| グルコース | シグマ アルドリッチ | D8270 | |
| HEPESバッファー | サーモフィ | ッシャー15630-080 | |
| オノマイシン | シグマアルドリッチ | I9657 | |
| Lグルタミン | サーモフィ | ッシャー25030-081 | |
| ペン連鎖球菌 | サーモフィッシャー | 15140122 | |
| ペプチド | RSシンテシス | カスタム | ≥純度95%。 N末端 - アセチル基 C末端 - アミド基 |
| 塩化カリウム | Sigma Aldrich | 12636 | |
| 塩化ナトリウム | Σ | Aldrich S9888 | |
| TritonX-100 | DOW 化学 | 166704 |
参考文献
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H.
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再版と許可
