工学的HEK細胞を用いたMRGPRX2を活性化するペプチドのスクリーニング

マスト細胞は免疫系の不可欠な部分であり、自然免疫応答と適応免疫応答の両方で重要な役割を果たしています。マスト細胞は、主に免疫グロブリンE(IgE)-FcεRI受容体複合体への抗原の結合によって、または最近発見されたマス関連Gタンパク受容体-X2(MRGPRX2)1によって活性化される。MRGPRX2活性化はいくつかの免疫疾患および炎症性疾患に関連しており、したがって、受容体のリガンド²への結合機構を理解することが重要である。そのために、HEK細胞で過剰発現したMRGPRX2受容体に対して、小ペプチド分子のライブラリーが開発され、スクリーニングされた。研究では、ペプチドライブラリーは、アラニンスキャンとアミノ酸切り捨ての単純で汎用性の高い技術を使用して構築されました。アラニンスキャンは、アラニン残基に特定のアミノ酸を置き換えることを含みます.アラニンは小さく中性であり、置換された残基によって与えられた特定の特性のペプチドを取り除き、受容体相互作用におけるアミノ酸のそれぞれの生理化学的性質の重要性を連続的に強調する。逆に、アミノ酸切り捨てでは、ペプチド配列は、N末端、C末端、またはその両方から1つ以上のアミノ酸残基を欠くように設計されている。この一組のペプチドは、MRGPRX2結合に重要なアミノ酸配列を同定するために使用された。

ヒト肥満細胞株(LAD-2)の経験は、これらの細胞が培養およびインビトロを維持することが困難であることを示している:2週間の倍増時間、高価な培地サプリメント、および過ごす間に必要な直接的な注意^3。これらの属性は、潜在的なリガンドの大規模スクリーニングに適さない細胞を作る。本明細書において、MRGPRX2受容体(HEK-X2)を発現する安定的にトランスフェクトされたHEK細胞を、ペプチドライブラリー¹をスクリーニングするために使用した。HEK-293細胞は、その高いトランスフェクション効率、より速い倍率、および実験室⁴で培養される非高価な培地サプリメントの必要性による表面受容体の異種発現のために広く使用され、研究されている。HEK-293細胞株をトランスフェクトするプロトコルが実証されており、5.MRGPRX2受容体を安定的に発現するHEK-293細胞(継代13-19)は、N-切り捨て、C-切り捨て、N+C切り捨て、およびアラニン走査¹を介して生成されたペプチドで活性化された。野生型HEK細胞(HEK-WT)(継代16-21)をコントロールとして用いた。活性化時に細胞内カルシウム放出をモニターし、MRGPRX2に基づく活性化を研究した。

MRGPRX2による細胞活性化は、続いて細胞分解性カルシウム動員を行う。肥満細胞におけるこの調節された細胞内カルシウム放出は、貯蔵操作カルシウムエントリー(SOCE)によって調節され、間質相互作用分子1(STIM1)によって調整される。免疫応答カスケード^6、7の中心である。パッチクランプや蛍光色素⁸を含む、細胞内カルシウム濃度の検出には様々な方法が用いられている。利用可能なすべての技術のうち、各種検出技術による共役における蛍光カルシウム色素が広く用いられている^9.関心を集めた2種類の蛍光色素は、Fluo-4のような単一波長色素と、Indo -1やFura-2のような二重波長比比色素です。二重波長比比色素が単一波長色素を超える利点は、比比色素が染料のロード、写真の漂白、および焦点^10、11のような実験的エラーに対して正しいということです。

フラ2アセトキシメチルエステル(Fura-2 AM)は、カルシウム結合時に励起が低波長にシフトする細胞浸透、緑色蛍光色素です。実験的に、Fura-2は340および380 nmで励起され、放出は510 nmで記録される。カルシウム結合の際、 図1に示すように340nmの蛍光強度は380nmの蛍光強度が低下する一方で減少する。データは、380nm(F380)での励起後の強度に対して340nm(F340)での励起後の蛍光強度の比、すなわちF340/F380として表される。F340/F380比は細胞内カルシウムに比例し、その値はGrynkiewicz式¹²によって計算することができる。蛍光信号は、色素の励起から得られるので(340nmと380nm)、蛍光信号の比は、染料負荷、染料漏れ、光漂白、および細胞密度などの実験的要因を補正します。

ペプチドライブラリーの設計・開発

1. 既知のリガンドすなわちPAMP-12¹³に基づいてマスト細胞MRGPRX2受容体のリガンドを同定するために、以下の手順に従う。
   1. リガンドのN末端アミノ酸残基を切り捨てることによりN切り捨てペプチドライブラリーを生成し、続いて、固相ペプチド合成(SPPS)によって生成する。
   2. 既知のリガンドのC末端アミノ酸残基をSPPSによって連続して切り捨てることにより、C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
   3. 1.1.1と1.1.2の結果に基づいて、それぞれNとC末端から所望の残基を切り捨てることによってSPPSを用いてN+C切り捨てられたペプチドライブラリーを生成する。
   4. 固相ペプチド合成を用いてペプチド¹³を合成する。
   5. N端子をアセチル(Ac)グループに、C端子をアミドグループに変更します。
   6. 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた純度と質量分析光度計を用いた質量に対して、ペプチドを特徴付けます。
2. 親PAMP-12分子内の特定のアミノ酸の重要性を調べるために、以下の手順に従ってください。
   1. ペプチド分子のそれぞれのアミノ酸残基をアラニンに置換することにより、一度に1つずつSPPSを用いて、アラニンスキャンペプチドライブラリーを生成します。N端子をアセチル(Ac)グループに、C端子をアミドグループに変更します。
   2. 高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いた純度と質量分析光度計を用いた質量に対して、ペプチドを特徴付けます。
      注:合成ペプチドが高純度であることを確認してください。質量分析法とHPLCを用いてペプチドを特徴付けます。

2.インビトロ 細胞培養

1. 培養HEK-X2およびHEK-WT細胞は、以下の手順に従う。
   1. 高グルコースDMEMを10%胎児ウシ血清(FBS)、2mM L-グルタミン、ペニシリン100 U/mL、ストレプトマイシン100μG/mLで補って培地を調製します。
   2. 組織培養(TC)で細胞を通過させ、T-75培養フラスコを処理し、5%CO2を含む37°Cで培養器で増殖し、75〜80%のコンフルエントになるまで培養した。
   3. 75%コンフルエントになったら、細胞を洗浄し、2〜3分間トリプシンを2〜3 mL加えます。37°Cでインキュベートし、5%CO2インキュベーターを使用して細胞を剥離する。
   4. 細胞が切り離されたら、トリプシンの細胞を収集します。6~9mLの新鮮な培地を加えます。
   5. 細胞を1620 x g で3〜5分間遠心分離する。
   6. 遠心分離後、上清を捨ててペレットを回収する。新鮮な培養培地中の細胞を再懸濁する。所望の濃度に従って細胞を希釈する。
      注:HEK細胞は、急速に成長している細胞であり、したがって、細胞培地サプリメントを最適化します。HEK細胞は接着細胞である。接着をサポートするためにTC処理培養フラスコでそれらを通過する。
2. 実験用に96ウェルアッセイプレートを準備します。
   1. 各ウェルに200μLの細胞懸濁液を加え、濃度200,000個の細胞/mLを加え、40,000個の細胞/ウェルをシードします。
   2. 37°C、5%CO2インキュベーターで24時間細胞を増殖させます。
      注: プレートサイズとセルひずみタイプに基づいて、ウェルごとのセル密度を最適化します。黒いTC処理96ウェルプレートに三重で、透明な底が平らな実験を行います。

3. フラ-2 AMカルシウムアッセイ

1. 以下の手順に従って染料を準備します。
   1. 実験には、Fura-2 AM色素を使用してください。
   2. 25 mM HEPES バッファー、120 mM NaCl、5 mM KCl、1 mg/mL グルコース、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を含む HEPES-Tyrode のバッファー (HTB) バッファーを準備し、オートクレーブ滅菌水に 1.8 mM CaCl 2 を追加し、新たに 1.8 mM CaCl₂ を追加します。
   3. 50 μg Fura-2 AM バイアルに DMSO 50 μL を加え、Fura-2 AM 色素の 1 mM ストック溶液を準備します。1 μM色素濃度の色素ローディング媒体を調製するために、フレッシュ培地のmLあたり1 mM Fura-2 AM色素を1μL添加します。
   4. インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、培地を捨てます。新鮮な染料ローディング媒体で媒体を交換してください。各ウェルに200μLの染料ローディング媒体を加えます。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターで30〜40分間インキュベート_します。
   5. 40分のインキュベーションの後、培地を取り除く。HTBバッファーで細胞を洗います。蛍光読み取り用に100μLのHTBバッファを追加します。蛍光の読書のためのプレートを取ります。
      注:染料負荷媒体中の染料の濃度を最適化します。染料漏れや光漂白は、染料に関連する可能性のある懸念事項です。沈殿を避けるために、HTB バッファーに新鮮な CaCl₂ を追加します。

4. 細胞の活性化と蛍光読み取り

注:自動ピペットシステムを備えた蛍光プレートリーダーは、プレートリーダーからプレートを取り出すことなく、化合物源からアッセイプレートへの化合物の自動転送を可能にします。

1. 細胞がインキュベートされている間に 、プレートリーダーを設定します。
   1. 温度を37°Cに設定します。
   2. [ 設定 ]で [ Flex] を選択します。
   3. 読み取りモードを蛍光と底読みに設定します。
   4. 波長で、波長の数を 2 に設定します。励起を 340 nm および 380 nm に設定します。放出を 510 nm に設定します。
   5. [感度] は[既定] のままにします。
   6. [ タイミング] で 、[間隔] を 3.9 秒に設定します。25 読み取りを取得するには 、ランタイム を 94 s に設定します。
   7. 次にアッ セイプレートタイプを選択します。
   8. 次に、 読み取るウェルを選択します。
   9. [複合転送] で、[転送]を 1 に設定し、初期ボリュームを100 μL に設定します。
   10. 次に、 複合ソース プレートタイプを選択します。
   11. [トリチュレート] は[使用しない] のままにします。
   12. ピペットのヒントレイアウトでヒントを選択します。
   13. [複合列] および [チップ列]では、転送する化合物が複合プレートの列 1 に含まれるようにします。[先端列]を1 に設定し、[複合列]を 1 に設定します。
   14. [自動校正]は[オン]のままにします。
   15. [OK] をクリックします。
2. 温度が37°Cに達したら、 プレートをプレートリーダーにロードします。
   1. 読書室を押して、蛍光プレートリーダーにアッセイプレートを入れます。
   2. ソースを押してコンパウンドプレートを置きます。各ペプチド、イオノマイシンおよびエチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル)-N,N,N',N'テトラ酢酸(EGTA)-トリトンX-100溶液の200 μLを添加して、化合物プレートを調製します。
   3. チップラックを押して、チップボックスを置きます。黒い先端を使用して、自己蛍光を避けてください。
   4. プレートがロードされたら、ソフトウェアの設定を確認し 、読み取りを押します。

5. データ分析

1. グリンキエヴィチ方程式により蛍光比からカルシウム濃度を決定する -
   
   ここで、K_d は、Fura-2 AM の解離定数であり、 Rは、各ペプチドに対して340nmおよび380nm(F340/F380)で励起した後の発光比であり_、Rmax は30μMの50μLの30μMイオノマイシンを添加して観察される最大蛍光比であり、R_分 は100mMMEGTA/2の50μLを添加することによって観察される最低蛍光である F380_min およびF380_max は、それぞれカルシウムフリー及び結合状態におけるフラ-2 AMの絶対蛍光強度である。
   注:機械は、いくつかの力で液体を分配します。ペプチドの分配高さをプレートの底部に近づけすぎないようにしてください。セルを切り離す場合があります。黒いピペットチップを使用して、自家蛍光を避けてください。各実験の各プレートの最大蛍光と最小蛍光を読みます。

表1は、末端アミノ酸切り捨ておよびアラニン走査を介して生成されるペプチド配列を含む。表1に示すように、ペプチド配列RKKWNKWALSRはその親PAMP-12に対してN末端フェニルアラニン(F)を欠いているため、N切り捨てライブラリーにおける代表的なペプチドである。同様に、FRKKWNKWALSでは、PAMP-12C末端セリンが除去されており、PAMP-12に由来するC切り捨てられたペプチドライブラリーを表す。N+C切り捨てられたペプチドライブラリーでは、NとC末端の両方からアミノ酸が除去される。N末端からの4アミノ酸の切り捨てとPAMP-12のC末端からの1残基の切り捨てはWNKWALSで生じる。アラニンスキャンに由来するペプチドライブラリーは、1つのアミノ酸をアラニンに置換し、ARKKWNKWALSRと同様に、N末端フェニルアラニンがアラニンに置き換えられる。フラ-2 AM色素は、MRGPRX2トランスフェクトHEK細胞1に対するペプチドの活性化電位を研究するために使用された。データは蛍光プレートリーダーに記録された。ペプチドリガンドが細胞を活性化した場合、340nm(F340)でポンピングされた蛍光は増加し、380nm波長(F380)でも同様に減少する(図1a)。しかし、ブランク(または非活性化ペプチドまたはHEK-WT対照)については、図2aに示すように、相対的な増加と減少はそれぞれ低いであろう。しかし、カルシウム濃度は、図1b、2bに示すようにF340/F380比で表される。比率F340/F380は、その場合の較正でカルシウム濃度を得るために、Grynkiewicz方程式でさらに置換することができます(図3)。表1に記載されたペプチドは、質量分析法(図4a)およびHPLC(図4b)を特徴とし、高純度であることが判明した。

表1:N、CおよびN+C- 切り捨て、およびアラニンスキャン後に 生成される代表的なペプチド配列。ペプチドのN末端はアセチル修飾され、C末端にはアミド基が含まれていた。

図1:活性化ペプチドの代表的なデータ( a) 活性化ペプチドの蛍光シグナル。表されるデータは、PAMP-12 (FRKKWNKWALSR) に対応します。ペプチドは、矢印で示されるように、10回の読み取りサイクル(36s)に対するベースラインを生成した後に添加した。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2: ブランクの代表的データ( ) ブランクの蛍光シグナル。HTBは、矢印で示すように、10回の読み取りサイクル(36s)のベースラインを生成した後に追加された。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3: 染料校正の規格の代表的なデータ(a)ヨノマイシンは、矢印で示されるように、10番目の測定値で添加され、Ca+2結合状態で最大蛍光を得た。EGTAトリトンX-100は、最小の信号を得るために、矢印で示されるように、20の測定値の後に追加されました。(b)380nm(F380)での励起後の蛍光発光に対する340nm(F340)での励起後の蛍光発光の割合(F340/F380)。これらの値は、細胞内カルシウム濃度を得るためにGrynkiewicz方程式にさらに入れられます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:代表的ペプチドの特徴付けにより、配列および純度を確認する。(a)代表ペプチド配列WNKWALの理論質量は857.90Daであり、これは質量分析におけるm/z比で示された。(b) HPLCで確認したペプチドの純度99%。このペプチドは、N+C切り捨てられたペプチドライブラリーに属する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者は競合する利益を宣言しません。