ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

近年、ヒト多能性幹細胞を腎臓オルガノイドに分化させるための多くのプロトコールが^{開発されている1}、²、^3、4、5。腎臓オルガノイドは、新しい再生医療アプローチの研究、腎臓関連疾患のモデル化、毒性試験の実施、治療薬開発を支援するための重要なツールを提供してきました。その幅広い適用性にもかかわらず、腎臓オルガノイドは、成熟の欠如、インビトロでの限られた長期培養能力、およびヒト腎臓に見られるいくつかの細胞型の不足などの限界を有する^6,7,8。最近の研究は、オルガノイド成熟のレベルを改善し、培養期間を延長し、既存のプロトコル⁹、^10、11、12を修正することによって腎臓細胞集団の複雑さを拡大することに焦点を当てている。我々の確立されたプロトコル^5,13のこの現在の反復において、我々は、プロトコルの第¹段階における培地成分を、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン(ITSE)、脂質、ポリビニルアルコール(E5-ILP)およびCHIR99021を添加した無血清ベース培地に改変した(図1)。これらの変更により、完全に定義された無血清の低タンパク質培地が提供され、以前の培地組成物^5,13よりも成分が少なく、追加の成長因子が存在しません。その結果、第1段階培地は、以前に公開されたバージョンよりも調製に労力がかからず、バッチ間の変動性を低減する可能性があります⁵。これまでの研究では、インスリンとトランスフェリンの両方が無血清培養において重要であることが示されている^14,15が、高レベルのインスリンは中胚葉分化を阻害し得る¹⁶。我々は、元のプロトコールで提供されたように低いインスリンレベルを維持し、アッセイの第2段階でKOSR(インスリンを含む)のレベルをさらに低下させた。腎臓オルガノイド形成のための他のプロトコールに沿って、より低いレベルのKOSRは、腎臓組織の増殖と分化との間のバランスを維持するのに有益である¹⁷。また、ステージII培地¹³におけるグルコース濃度を低下させた。

我々の方法は、腎臓オルガノイドの懸濁アッセイのためのセットアップを記載し、元の刊行物⁵、13に記載されているように、初期〜60%コンフルエントhPSC 100mm培養プレートから最大〜^1,000個のオルガノイドを生じる。このプロトコルは、複数の100 mmまたは150 mmプレートから始めて簡単にスケールアップして、オルガノイド数をさらに増やすことができます。

hPSCを用いたすべての実験は、施設のガイドラインに準拠して実施され、適切な個人用保護具を備えたクラスIIバイオセーフティフード内で実施された。すべての試薬は、特に断りのない限り、細胞培養グレードである。全ての培養物を37°C、5%_CO2 空気雰囲気下でインキュベートする。アッセイのすべての段階で、胚様体または腎臓オルガノイドを収集、固定、または分析のために調製することができる。このデータの生成に使用されたhPSCラインは、完全に特徴付けられ、公開されています¹⁸。

1. 培養プレートの準備

注:hPSCを分割する約1時間前に、幹細胞修飾基底膜マトリックス抽出物(BME)で2 x 100 mm組織培養プレートをコーティングする。プレートを事前にコーティングし、パラフィンフィルムで密封し、メーカーの指示に従って4°Cで保存することができます。

1. 2 x 100 mm組織培養処理プレート(腎臓オルガノイドアッセイ用に1枚、細胞株を維持するために1枚)とクラスIIバイオセーフティフード内の15mL円錐形チューブを調製する。
2. 15 mLの円錐形チューブに8 mLの冷たい無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)をアリコートし、各プレートの底部を培地で覆うのに十分な量の100 mmプレートに約4 mLを入れます。
3. 100 μL の BME アリコートを冷凍庫 (-20 °C) から取り出します。2 mL 血清学的ピペットを使用して、15 mL の円錐形チューブから約 1 mL の冷たい DMEM を採取します。気泡ができないように、冷たいDMEMで優しく上下にピペッティングして、BMEアリコートをゆっくりと解凍します。
   メモ: BMEアリコートを室温で放置しないでください。すぐに使用してください。
4. 解凍したDMEM/BMEを、残りのDMEMとともに15mL円錐管に戻します。10 mLの血清学的ピペットで、希釈したBMEを少なくとも8回上下にピペッティングしてBMEを均一に分散させ、気泡を作らないように穏やかに混合します。
5. 希釈したBMEの4mLをDMEMで各プレートに移し、BMEが均等に分布するようにプレートを静かに旋回させる。コーティングされたプレートを室温で1時間、または37°Cで30分間インキュベートする。
   注: 100 mm プレートあたり 50 μL の BME を使用します。他のhPSC培養培地および細胞株の使用は、異なる濃度のBMEを必要とし得る。

2. hPSCの継代

注:日常的なhPSC培養の場合、70〜80%のコンフルエントで細胞株を継代する。

1. 継代するhPSCプレートから培養液を吸引する。~8 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)をhPSCプレートに加え、穏やかに旋回させて細胞を洗浄する。
2. DBPSを吸引し、2mLの穏やかな細胞解離試薬(GCDR)を100mmプレートに加え、細胞を覆うように上に一滴ずつ落とす。
   注:他の解離試薬も使用することができる。それに応じて調整します。
3. コロニーが分裂し、細胞が位相コントラスト下で屈折するまで、室温で約6〜8分間インキュベートする(図2A)。
   注:タイミングは細胞株によって異なる場合があります。それに応じて調整します。
4. インキュベートしながら、50mLの円錐管を調製する。16 mL の hPSC 培地 (100 mm プレートあたり 8 mL) を加え、Rho 関連キナーゼ阻害剤 (ROCKi) を終濃度 5 μM まで加えます。
5. BMEコーティングプレートからDMEMを吸引し、各プレートに8mLのhPSC培地とROCKiを加える。
6. 細胞の準備ができたら(図2.3、 図2Aで説明したように)、GCDRを吸引し、プレートを実験者に向かって約45°傾け、セルリフターで細胞をこすります。
   注: 細胞がデタッチしている場合は、GCDR の吸引を省略して続行します。
7. プレートを約90°回転させ、もう一度こすり取って残りのセルを持ち上げます。プレートを45°に保ち、10 mL血清学的ピペットを使用して3 mLのhPSC培地で細胞を洗い流します。
8. ゆっくりとピペットを上下させて大きな凝集塊を分解し(2〜3回以下)、目的の細胞株に適した比率で細胞を調製したプレート上に播種する。細胞を入れたプレートをインキュベーターに入れ、プレートを図8の動きで静かに動かして細胞を均等に分配します。
   注:この実験ではhPSC株を1:5の比率で分割したが、これは他の細胞株および条件によって異なり得る。プレートを一晩中邪魔しないでおきます。
9. 〜24時間後、細胞に付着がないか調べる。小さな個々のコロニーが付着しているのを探します。使用済みの培地を吸引し、8 mLの新鮮なhPSC培地(ROCKi添加なし)を補充する。
10. 細胞が〜60%のコンフルエントに達するまで毎日観察および摂食を続け、腎臓オルガノイドアッセイを開始する(通常、継代後48〜72時間に達する)。コロニーは理想的には離散的であり、合流しない(図2B)。
    注:細胞の多能性状態を維持するためには、細胞を80%以下のコンフルエンシーに制限することが非常に重要です。コンフルエント培養物、粗い取り扱い、またはより高い継代は、望ましくない自発的分化または腎臓オルガノイド形成の低効率をもたらし得る。

3. 0日目 - 腎臓オルガノイドアッセイのセットアップ

1. 開始する前に、製剤に従ってE5−ILPおよびステージII培地の両方を調製する(表1 および 表2)。
   メモ:メディアは、4°Cで最大14日間保存できます。
2. 1 つの腎臓オルガノイドアッセイ (1 つの 6 ウェルプレートに 1 つの 100 mm 培養プレートが必要) の場合、50 mL 円錐管に完全な E5-ILP 培地を調製します: 8 μM CHIR99021 (14.4 μL)、3.3 μM ROCKi (6 μL)、0.1 mM β-メルカプトエタノール (32.7 μL) を添加した E5-ILP 18 mL。
3. 2mLの完全E5-ILP培地を6ウェル超低付着プレートの各ウェルに入れる。
4. hPSCを~60%コンフルエント(図2B)で~8mLのDPBSで2回洗浄します。DPBSを吸引し、次いで、100mmプレートあたり2mLのディスパーゼを加え、細胞を覆うように滴下し、37°Cで6分間インキュベートする。
   注:6分後、コロニーのエッジはカールし始め(図2C、赤い矢印)、残りのコロニーは付着したままになります。これが6分後に得られない場合は、細胞をさらに30秒間インキュベーターに戻します。他のhPSCメディアおよびマトリックスは、このタイミングと互換性がない場合がある。ラミニンベースのBMEコーティングは、ディスパーゼと互換性がありません。ラミニンベースのBMEが標準的なhPSCマトリックスである場合、セクション1のプレートの1つを、腎臓オルガノイドアッセイに使用するこの方法に記載したBMEでコーティングする。
5. 細胞3xを約10mLのDPBSで洗浄する。DPBSを吸引し、プレートを〜45°傾け、セルリフターでこすり落とします。
   注:Dispaseは無効化されていないため、完全に洗い流す必要があります。洗浄回数を減らさないでください。
6. 10 mLの血清学的ピペットを使用して、6 mLの完全E5-ILP培地でコロニーを上から洗い流します。ピペットを静かに上下させて、大きなコロニーを分解します(通常は2〜3回で十分です)。
7. コロニークラスターを均等に分配するには、1 ウェルあたり 1 mL を 6 ウェルプレートに加えます。37°Cのインキュベーター内に置かれたオービタルシェーカー(設定:オービタル=30、往復=330°、振動=5°-2秒)にプレートを置きます(図2D)。
   注:振動機能は、オルガノイドを適切に分布させ、凝集を防ぐために重要です。

4. 2日目 - 半培地変化による給餌

注:48時間以内に、コロニークラスターは胚様体を形成する。

1. 完全な培地を準備する:1つの6ウェルプレートの場合、15mLの円錐管に12mLのE5-ILP培地+ 8μM CHIR99021を調製する。
   注:β-メルカプトエタノールおよびROCKiは必要ありません。
2. 胚様体をプレートの底部に沈降させ、プレートを〜45°傾けてから、培地を上部からゆっくりと吸引し、ウェルあたり約1mL放置する。
   注:この段階での胚様体は急速に凝集する。5分>に落ち着くためにそれらを残さないでください。
3. 調製した完全培地(セクション4.1)をウェルあたり2mL加える。プレートをシェーカーに戻します。

5. 3日目 - ステージII培地への胚様体の移植

1. 50mL円錐管を調製し、DMEM(低グルコース)とする。胚様体をプレートの底に落ち着かせます。プレートを〜45°傾け、上から培地をゆっくりと吸引し、ウェルあたり約1mL放置する。
2. 10 mLの血清学的ピペットを使用して各ウェルからすべての胚様体を慎重に収集し、50 mLの円錐形チューブに移します。
3. 各ウェルを洗浄して、残りの胚様体を〜1mLのDMEM(低グルコース)で収集し、それらを同じ50mL円錐管に加える。
4. 胚様体をチューブの底に落ち着かせて、〜5分間放置する。待機中、6ウェルプレートの各ウェルにステージII培地を2mL加える。200 μmの細胞ストレーナーを使用して、大きな胚様体(>300 μm)を採取します(図2E)。
   1. 新しい50 mL円錐形チューブを使用し、200 μmのセルストレーナーを上に置きます。全ての胚様体のピペットは、10mL血清学的ピペットを用いて、細胞ストレーナーを注意深く覆った。
   2. 追加の約5mLのDMEM(低グルコース)で細胞ストレーナーをすすぎ、細胞ストレーナーに詰まった胚様体を回収する。胚様体が円錐管の底に落ち着くのを許す。
5. 胚様体が落ち着いたら、上清を吸引し、〜10mLのDMEM(低グルコース)で洗浄する。
6. DMEMを吸引し、胚様体を6mLのステージII培地に再懸濁する。
7. 胚様体を6ウェル超低付着プレートに戻し、6ウェル間に均等に分配する。
8. ステップ 4.2 および 4.3 で説明されているように、1 日おきに半分の中間変更を実行します。
   注:3日目以降、胚様体は「金色」で滑らかで球状の外観になります(図2F)。〜6日目から、個々の胚様体における尿細管形成が明らかになり、翌日に亘って数が増加し、14日目までに最適な数および成長に達する(図2G、H)。時折の凝集形成を排除するために、腎臓オルガノイド、または細管のない非常に小さな胚様体を目視で観察した上で、ステップ5.4.1および5.4.2で説明されているように、<200および大型>500μmのオルガノイドを500および200μmのセルストレーナーでふるいにかける。

6.スピナーフラスコに移して給餌する

注:スピナーフラスコは、多数のオルガノイドを必要とする実験のために、3日目以降いつでも使用することができる。オルガノイドの定期的な移動は、6〜8日目に私たちの研究室で行われます。機器が利用できない場合の代替案については、 ディスカッション セクションを参照してください。

1. 胚様体を45mLのステージII培地を含む125mLスピナーフラスコに移す。マグネチックスターラーの回転数を120rpmに設定し、インキュベーターに入れます(図2I)。
2. 胚様体または腎臓オルガノイドを養うには、腎臓オルガノイドをスピナーフラスコの底に短時間沈降させます。フラスコの片側アームから蓋を持ち上げ、先端が反対側の内壁に触れた状態で吸引ピペットを内側に置きます。
3. 吸引ピペットをゆっくりと角度をつけ、培地の約半分を吸引します。20 mL の新鮮なステージ II 培地を同じ開口部からピペッティングして補充します。

7. 6穴マグネチックスタープレート(6MSP)の設置

メモ: 6MSP 形式は、複数の条件をテストする必要がある場合は、スピナーフラスコの代わりに使用できます。化合物またはネフロトキシン治療のために6MSPを使用してください。これにより、拡散による栄養素の利用可能性を維持しながら、第2段階で使用される培地の量が節約されます。

1. 50 mL 円錐管内の楕円形のマグネチックスターバーを組織培養に適した洗剤で短時間洗浄するか (使用しない場合)、または以前に使用した場合は 1 時間>浸します。
2. 滅菌DPBSで3倍速で簡単に洗う。
3. 70%エタノールで1xを5分間、滅菌DPBSで1xを洗浄する。
4. 付着防止液ですすぎ、滅菌DPBSで1xを洗って吸引します。
5. 慎重に、長い滅菌鉗子を使用して、胚様体または腎臓オルガノイドを有する6ウェルプレートの各ウェルに1つの磁気攪拌子を置く。
6. プレートを6MSPの上に置き、速度を120rpmに設定します(図2J)。腎臓オルガノイドをセクション4.2および4.3に従って半分の培地変化で維持する。
   メモ: 磁気スターバーを所定の位置にカチッと収めて回転を開始するには、まず出力レベルを 100 に簡単に設定してから、すべて回転したら、出力レベルを 25 に下げる必要があります。

私たちのプロトコルのこの最新バージョンでは、腎臓オルガノイドの分化は、定義された低タンパク質培地で開始されます。アッセイは完全に懸濁状態で行われ、尿細管形成の開始のためのhPSCs分化および組織化の先天的能力に依存する。100mm〜60%コンフルエントなhPSC培養プレートに由来する単一のアッセイは、我々の以前の刊行物5に示されているように、日常的に500〜1,000個の腎臓オルガノイドを生じる。このような多数のオルガノイドが生成されるため、このプロトコルは化合物試験に適しています。私たちは日常的に化合物試験に6ウェルフォーマットを使用していますが、このプロトコルは第2段階(3日目以降)で他のマルチウェルフォーマットに簡単に拡張でき、よりスループットの高い化合物テストが可能です。パラフィン切片の免疫蛍光は、オルガノイド、すなわち肝細胞核因子-1β(HNF1B)およびロータス・テトラゴノロブス・レクチン(LTL)を発現する腎尿細管(図3A-HNF1B、LTL)、およびV-maf筋腱膜神経症線維肉腫癌遺伝子ホモログB(MAFB)およびネフリン(NPHS1)を発現するポドサイトクラスター(図3A-MAFB、図3B)におけるネフロンセグメントの存在を示す。 - NPHS1)。さらに、このプロトコールにおける改変は、培養26日目における血小板および内皮細胞接着分子1(PECAM1)による染色を示す図3Bに見られるように、内皮細胞の増殖を支持することができる。

表1:E5-ILP培地組成。 化学的に規定された脂質および抗マイコプラズマ試薬を除くすべての試薬を、0.22μmステリックアップ濾過ユニットの上部チャンバに直接ピペットでピペットします。濾過後、脂質及び抗マイコプラズマ試薬を添加する。4°Cで最大2週間保存してください。

表2:ステージII培地組成。 抗マイコプラズマ試薬および抗マイコプラズマ試薬を除くすべての試薬を0.22 μmステリックアップ濾過ユニットの上部チャンバに直接ピペットでピペットする。ろ過したら、抗マイコプラズマ試薬を加えます。4°Cで最大2週間保存してください。

図1:プロトコルの概要 スピナーフラスコと6MSPの2段階および使用のタイミングを示すプロトコルの概略概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A)GCDRで処理したhPSCコロニーの明視野画像。(b)最適なコンフルエント性、およびコロニーサイズは、腎臓オルガノイドアッセイを開始する。(c)hPSCsをディスパーゼで6分間処理した。赤い矢印は、丸みを帯びたコロニーの端を指しています。(D)オービタルシェーカー上のオルガノイドアッセイ。(E)200μmのセルストレーナーを使用して、大きな胚様体をふるいにかける。(f)ステージII培地に移す前の3日目(D3)の胚様体。(G)尿細管形成の出現は、8日目(D8)および(H)14日目(D14)のオルガノイド採取および治療に最適な時点に観察され得る。(i)多位置磁性プレート上での塊状培養に用いるスピナーフラスコ。(j)マルチウェル磁気攪拌プレート上でアッセイする。スケール バー、200 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

(A)尿細管上皮(HNF1BおよびLTL)および足細胞クラスター(MAFB)に対する陽性染色を示す14日目の腎臓オルガノイドの免疫蛍光標識パラフィン切片の代表的な共焦点画像。(b)26日目の腎臓オルガノイド切片を有足細胞集塊(NPHS1)および内皮細胞(PECAM1)について標識した。スケールバー、100μm(A);200 μm (B).この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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