尿中バイオマーカー研究のための収集、処理、および保存に関する考慮事項

Summary

このプロトコルは、尿路感染症バイオマーカー研究のための尿サンプルの収集、処理、および保管に関する考慮事項を提供することを目的としています。

Abstract

尿路感染症の新規マーカーとして有望視されている尿中タンパク質がいくつかあります。現在の診断方法と比較して予測精度が高い新しいバイオマーカーの同定は、尿路感染症の患者を管理する能力を大幅に向上させる可能性があります。しかし、サンプルの収集、処理、保存はすべて、バイオマーカー研究の結果に影響を与える可能性があります。これらの各段階がバイオマーカー研究に及ぼす影響を理解することは、この分野の将来の質の高い研究に情報を提供するとともに、この分野の他の研究を批判的にレビューするために必要です。ここでは、尿サンプル処理の各段階の影響に関する文献をレビューし、尿中タンパク質に対するさまざまな条件の影響を報告しています。このプロトコルは、収集技術、保管の時間と温度、処理技術、試薬の使用、およびバイオマーカーの安定性に関する長期凍結に焦点を当てます。タンパク質に焦点を当てますが、バイオマーカー研究に利用できる可能性のある他の材料についても簡単に説明します。そうすることで、このプロトコルは、尿中バイオマーカー研究の設計を支援するための将来の研究者へのガイドを提供します。

Introduction

尿路感染症(UTI)は、子供^{と大人の両方で}最も一般的な細菌感染症の1つです1。UTIの診断は、一部の集団では複雑ではありませんが、神経因性膀胱の患者など、他の集団ではより複雑になる可能性があります²。尿路感染症を正確に診断する能力は、不必要な抗生物質の使用を減らすことで抗菌薬適正使用の取り組みを改善し、尿路感染症の早期診断に役立つ可能性があり、罹患率のリスクを減らすことができます。尿路感染症の蔓延を考えると、この一般的な感染症の管理を改善することに大きな関心が寄せられています。

文献には、UTI ^3,4,5,6,7 を診断する能力に有望であることを示す新しいバイオマーカーの数が増えています。ただし、尿サンプルの処理には、結果を変更する可能性のあるいくつかの要因があります。これらの要因は、収集方法、温度、短期および長期保存の期間、処理技術、試薬の使用、凍結融解サイクル8にまで及び^ます。これらの各々の変化がバイオマーカーの測定値にどのように影響するかを理解することは、文献内の研究を批判的に解釈するとともに、尿バイオマーカーに焦点を当てた質の高い研究を設計するために必要です。

ここでは、尿バイオマーカーとして有用性を持つ可能性のあるタンパク質に対する収集技術、短期および長期の保存温度と期間、試薬の使用、凍結融解サイクルの影響など、各因子の影響に関する文献のナラティブレビューを提供し、この文献のレビューに基づいて最適な処理のための推奨事項を提供します。このプロトコルは、ウェスタンブロットまたは ELISA を使用して測定されたタンパク質バイオマーカーに焦点を当てます。

Protocol

このプロトコルは、機関のヒト研究倫理委員会のガイドラインに従っています。研究のための生物学的標本の収集と利用に先立ち、治験審査委員会(IRB)から承認を得ていることを確認してください。

1. コレクション

1. 滅菌検体カップで尿サンプルを採取します。特定の研究デザインに基づいて、尿サンプルの種類、および特定の包含基準と除外基準を決定します。UTI研究では、会陰汚染を避けるために、クリーンキャッチ法またはカテーテル法のいずれかを使用してください。
2. きれいな尿サンプルを採取するには、参加者にタオルで尿道周囲領域を拭き取り、少量をトイレに排尿してから、検体カップに排尿するように指示します。
3. 汚染を避けるために、女性は指を使って陰唇を広げ、男性は排尿前に包皮を引っ込めるように指示します(該当する場合)。
4. 収集時間を記録します。
5. 個々の研究デザインと研究課題の必要に応じて、各参加者から関連する臨床データを収集します。
6. このデータが電子カルテから確実に利用できない場合は、処理および保存する前に、各サンプルで尿検査または尿ディップスティックを実行することを検討してください。

2. サンプルの処理と保存

1. サンプルはすぐに処理してください。これが不可能な場合は、サンプルを4°Cで最大24時間保存してください。
2. サンプルを4°Cで保存できない場合、または4°Cで24時間以上保存する必要がある場合は、0.2 Mホウ酸または10 mM NaN₃ をサンプルに加えます。このような試薬が、計画されたダウンストリームアプリケーションに適合していることを確認してください。
3. サンプルが4°Cで費やされた時間を記録します。
4. サンプルを1000〜1500 x g で10〜20分間遠心分離します。遠心分離は4°Cである必要はありません。
5. 上清を集め、別々の微量遠心チューブに分注します。
6. チューブに複数の明確な識別子(日付やサンプルID(ID)など)をラベル付けします。-80°Cでの生体サンプルの保存用に特別に設計されたコンピュータ生成バーコードの使用を検討してください。 使用できない場合は、サンプルのラベル付けに使用するペンが耐水性であることを確認してください。
7. 各場所に特定のコードがあるように、各冷凍庫ボックスにラベルを付けます。このためには、各列に異なる文字で番号を付け、各行に番号を付けます。これにより、サンプルの位置を簡単に特定するためのマップやその他のガイドを作成できます。
8. サンプルを-80°Cですぐに凍結します。 凍結の時間を記録します。
9. 測定当日にサンプルを37°Cのウォーターバスで解凍し、室温または4°Cでの不要な保存を最小限に抑えます。
10. 各アリコートの追加凍結融解サイクルの時間と回数を記録します。

3. 分析

1. 市販のELISAを使用する場合は、製造元の指示に従ってください。
2. サンプルを重複して実行します。
3. 目的のタンパク質の予想濃度を特定し、サンプル中のタンパク質レベルがキットの範囲内にあることを確認します。予想されるタンパク質レベルが上限を超える場合は、サンプルを希釈します。
4. プレートリーダー(ELISA)またはウェスタンブロットからデータを取得した後、サンプル中の各バイオマーカーの濃度を手動(非推奨)または任意のソフトウェアを使用して測定します。
5. 結果を分析します。データ分析は、個々の研究デザインによって異なります。
6. 尿中濃度を考慮してバイオマーカー値を調整することを検討してください。
   注:伝統的に、バイオマーカーの研究者は、特に正常な腎機能を持つ参加者において、尿中濃度を説明するために、尿クレアチニンを正常化の方法として使用してきました。ただし、正規化は結果に違いをもたらさないと報告する人もいます⁴。このハードルを克服するために、一部の研究者は正規化された結果と正規化されていない結果の両方を報告しています。
7. サンプル処理のコンテキストで結果を解釈できるように、収集から凍結までの時間範囲と、出版された原稿で処理前の4°Cでの時間を報告することをお勧めします(図1)

4. 好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(NGAL)に対する各種保存条件の影響

1. 新鮮な尿に2 ng / mLの組換えNGALをスパイクします。.
2. 尿を分注し、さまざまな処理および保管条件にさらします。
   1. 尿を1000〜1500 x g で10〜20分間遠心分離します。遠心分離は4°Cである必要はありません。 さまざまな条件(20°C、4°C、-20°C)で24時間、48時間、または72時間保管してください。
   2. 比較のために、サンプルのアリコートを-80°Cで保存します。
3. ステップ4.2.1で述べたように、サンプルをさまざまな条件で維持した後、製造元の指示に従ってコントロールを含む市販のELISAキットを使用して、サンプル中のNGALのレベルを測定します。

Results

遠心分離はNGALレベルにわずかな影響を与えました。-80 °C で保存した遠心分離済みサンプルは、遠心分離していないサンプルよりも NGAL レベルが低かった(0.32 ng/mL ± 2.17 ng/mL、0.21 ng/mL ± 2.77 ng/mL)。凍結サイクルは、3回目の凍結融解サイクル後のNGALレベルにも影響を与えました。(図2)。調査した条件(遠心分離、凍結融解サイクル、保存温度)のうち、保存温度がNGALレベルに最も大きな影響を与えました。サンプル採取直後は-80°Cで保存するのが、最も安定したサンプル保存方法でした。NGALレベルには、他の保存条件ごとに変動が見られ、サンプルは室温(20°C)で保存され、レベルの変化が最も大きかった。(図3)

まとめると、これらの結果は、測定されたタンパク質レベルがサンプル処理方法によってどのように異なるかを示しており、再現性のある結果を得るためには、一貫性と信頼性のあるプロトコルの重要性だけでなく、ここで分...

Discussion

一貫性があり再現性のある結果を生み出すことの重要性は、個々の研究の成功に限定されず、文献内の結果のより良い比較も可能にします⁹。主要な手続きステップにおける研究間のばらつきは、バイオマーカーシグナルとその解釈に影響を与える可能性のある不可逆的なバイアスを導入する可能性があり、これがいくつかの研究間の不一致の原因となる可能性があります¹⁰。これは、バイオマーカー研究のための尿サンプルを処理するためのより標準化されたアプローチを確立する必要性を示しています。

ほとんどの尿中バイオマーカー研究の研究デザインは、尿収集の時間と方法を決定します。ただし、時間に敏感でない方法でバイオマーカーを測定する場合は、最初の朝のサンプルを避けることをお勧めします。初朝の尿サンプルは、その濃縮された性質により、最も情報が豊富な尿プロファイルを提供すると考えられていますが、これらのサンプルは細菌や上皮細胞の汚染を受けやすいため、尿バイオマーカーの...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ホウ酸	Sigma-Aldrich	B6768	迅速に処理および凍結できないサンプルに考慮される
冷凍ボックス	フィッシャーサイエンティフィック	03-395-464
微量遠心チューブ	トーマスサイエンティフィック	1149X93
NGAL ELISAキット	R&D Systems	DLCN20	代表的な結果を作成するために使用されます
ピペットとチップ	ピペットのサイズと液体の量によって異なります。
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002	迅速に処理および凍結できないサンプルに考慮される
尿収集カップ	Thermo Scientific	3122B03ORG	他の研究に必要でない限り、滅菌カップは必要ありません