方法論記事

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

DOI：

10.3791/62486

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2021年6月5日

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1Ottawa Hospital Research Institute, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Ottawa

この記事について

サマリー

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ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。

要約

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重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)によって引き起こされるCOVID-19パンデミックが進化し続ける中、ウイルスに対する中和抗体の存在が将来の感染に対する保護を提供することが明らかになりました。したがって、有効なCOVID-19ワクチンの作成と翻訳が前例のないスピードで続く中、SARS-CoV-2に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法の開発は、以前に感染した個人と予防接種を受けた個人の両方に対する感染に対する長期的な保護を決定するためにますます重要になります。本論文では、最近COVID-19から回復した患者から回復血清中中和抗体の存在を測定するために、SARS-CoV-2スパイクタンパク質を擬似型にしたウイルス性口内炎ウイルス(VSV)を用いた高スループットプロトコルについて説明する。複製擬型ウイルスを使用すると、SARS-CoV-2 処理に必要な封じ込めレベル 3 の機能が不要になり、このプロトコルは事実上すべてのコンテインメント レベル 2 ラボにアクセスできます。96 ウェル形式を使用すると、短いターンアラウンドタイム 24 時間で多くのサンプルを同時に実行できます。

概要

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2019年12月、コロナウイルスの新しいコロナウイルスが同定され、コロナウイルス病2019(COVID-19)1の原因物質であるSARS-CoV-2と知られています。SARS-CoV-2はコロナビリダ科に属するベタコロナウイルスである。これらのエンベロープウイルスは、大きな陽性感覚RNAゲノムを含み、ヒトおよび動物両方における呼吸器および腸感染症の原因である2。2021年5月時点で、世界中で1億5,700万人以上のCOVID-19の症例が報告されており、320万人以上が死亡しています。効果的なワクチンの開発は、少なくとも77の前臨床ワクチンを調査中で、90は現在臨床試験を受けている世界中の研究者の主要な目標となっています4.

コロナウイルスは、スパイクタンパク質(S)、ヌクレオキャプシド(N)、エンベロープタンパク質(E)、膜タンパク質(M)を含む4つの構造タンパク質をコードする。SARS-CoV-2の侵入には、Sの受容体結合ドメイン(RBD)と宿主受容体、ヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)、および宿主細胞セリンプロテアーゼによるタンパク質分解性切断後の膜融合、トランス膜プロテアーゼセリン2(TMPRSS2)5、6、7、8、9、100との相互作用が必要です。.SARS-CoVのSタンパク質の液性免疫優位性は、以前に報告されており、SARS-CoV-211、12、13についても示されています。実際、Sに対する中和抗体応答は、感染24ヶ月後のSARS-CoV患者から回復血清中に検出されており、長期的な免疫応答におけるそれらの重要な役割を強調している。Sタンパク質は有望なワクチン標的として同定されており、開発中のほとんどのワクチンの重要な成分となっています15,16.

中和抗体の迅速な検出はワクチン開発の重要な側面であるが、影響を受けた領域における感染率および血清疫学的サーベイランスの速度に光を当てる可能性もある17。SARS-CoV-2 S糖タンパク質を擬似型の複製能力VSVは、野生型VSV糖タンパク質の代わりに、バイオセーフティレベル2の設定でSARS-CoV-2感染を研究するために、Whelanと同僚18によって親切に寄贈された。VSV発現スパイク(VSV-S)は、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体応答を決定するために利用される。ここで使用されるVSV-Sは増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するので、eGFP病巣は感染を定量化するために24時間以内に検出され、プラーク形成には48〜72時間かかることがあります。ここに要約すると、VSV-S-eGFP感染を中和する回復期の患者血清の能力を決定するための簡単で効果的なプロトコルがあります。この方法はまた、SARS-CoV-2 Sタンパク質の宿主とウイルスの相互作用を妨害することを目的とする他の潜在的な治療を尋問するために容易に適応され得る。

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プロトコル

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1. SARS-CoV-2擬似ウイルスの製造および定量のためのめっき細胞(1日目)

  1. 組織培養の準備
    1. 暖かい1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩(DPBS);10%胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシン(オプション)を含むDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM)。約15分間水浴中に0.25%トリプシンエチレン酢酸(EDTA)から37°Cまで。
    2. 70%エタノールで組織培養フードを消毒し、必要に応じて組織培養フードに組織培養皿、パスツールピペット、血清ピペットを配置します。水浴からPBS、DMEM、トリプシンを取り除き、組織培養フードに入れる前に70%エタノールで消毒します。
  2. めっきと細胞の維持






    3. figure-protocol-1





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結果

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本プロトコルは、VSV-S-eGFP擬ウイルス感染の阻害(検出されたeGFP病巣の喪失によって定量化可能)を介してSARS-CoV-2 Sタンパク質に対する中和抗体を検出するための迅速かつ効果的な方法を概説する。図1に、プロトコルの概略図を示します。市販の抗体は、アッセイが実行されるたびに正のコントロールとして使用して、アッセイの一貫性を確保することが推奨されます。ここでは、IGG対照と比較してSARS-CoV-2スパイクRBDに対して市販の中和IgG抗体を用いた希釈曲線を示す(両方の抗体の詳細については、材料表を参照してください。図2)。

回復期患者サンプルは、SARS-CoV-2感染後約3ヶ月で採取し、かつ、上述の方法を用いて疑似ウイルス中和を決定した(図3)。重要なことに、健康なドナー血清を用いて最小限のバックグラウンド阻害が観察された。さらに、このアッセイは、入院...

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ディスカッション

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ここで説明する方法は、必要に応じてさまざまなラボ環境やリソースに合わせて調整できます。重要なことに、このプロトコルの主な制限は、封じ込めレベル2空間および組織培養フードの必要性である。VSV-S-eGFPのようなSARS-CoV-2スパイクを擬似型複製するRNAウイルスの適用は、封じ込めレベル3の作業領域を必要とするSARS-CoV-2ウイルスに代わる手ごわい代替手段であるが、一部のグループでは制限されたままである可能性がある。ここで説明する他のすべての手順は非常に柔軟であり、ほぼすべての包含レベル 2 のラボで実行できます。例えば、自動計数機能を備えた蛍光イメージャーの使用は必要ありません。ここで使用される 96 ウェル形式は、利用可能な最も低い目標(2x)を使用してほぼ全体のウェルをイメージするために必要な約 4 つの視野のみを意味します。

手動蛍光顕微鏡を使用して各ウェルの複数のフィールドを画像化し、ImageJ(フリーソフトウェア)を使用してeGFP病巣を定量化することができます。さらに、96ウェル形式を使用して、可能な限り低い量の血清を使用し、消耗品の使用量を最小限に抑...

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開示事項

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著者は、この出版物に関連する競合する財政的利益を持っていません。

謝辞

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Whelanラボは、このプロトコルで使用されるVSV-S-eGFPウイルスを寛大に提供してくれたことに感謝します(Case et al. 2020で説明)。また、患者の血液サンプル(REBプロトコルID 20200371-01H)を収集したビル・キャメロン博士とユタポーン・コーワン博士(およびチーム)に感謝します。著者らは、この記事の研究、著者、および/または出版物に対する次の財政支援の受領を開示する:この研究は、オタワ病院財団からの寛大な支援とカナダ保健研究所(#448323)からの助成金とCOVID-19科学のためのシスルダウン財団からのファストグラントからC.S.I.T.R.J.への迅速な助成金によって資金提供されましたJPは、クラスターMitacsフェローシップによって資金提供されています。T.A.はCIHRバンティング・フェローシップによって資金提供を受けています。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.25% トリプシン-EDTA (Gibco)Fisher scientificLS25200114
ArrayScan VTI HCSThermo Fisher Scientific自動蛍光イメージャー
カルボキシメチルセルロースSigmaC5678
ダルベッコ修正イーグル培地 (Gibco)フィッシャーサイエンティフィ10-013-CV
ダルベッコ修正イーグル's medium (Powder) (Gibco)サーモフィッシャーサイエンティフィック12-800-017
ダルベッコ'Fisher scientific21-031-CV
HEPESFisher scientificBP-310-500
IgG Isotype Control (マウス)Thermo Fisher Scientific31903
Penicillin/streptomycinThermo Fisher ScientificResearch 15070063
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse MabSinoBiological40592-MM57
Vero E6 細胞ATCC CRL-1586
ック

参考文献

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