RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

Summary

RNAシーケンシングの微分発現解析方法の詳細なプロトコルが提供されました: リンマ, エッジ, DESeq2.

Abstract

RNAシーケンシング(RNA-seq)は、遺伝子改変と複雑な生物学的プロセスとの関係を明らかにし、腫瘍の診断、予後、および治療に大きな価値を持つため、トランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つです。RNA-seqデータの微分分析は異常転写を同定するために非常に重要であり、リンマ、EdgeRおよびDESeq2は微分分析のための効率的なツールである。しかし、RNA-seq微分解析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。

本明細書において、リンマ、DESeq2およびEdgeRを介して、脈管癌(CHOL)と正常組織の間で、それぞれ微分発現遺伝子(DEG)を同定するための詳細なプロトコルを提供し、その結果は火山プロットおよびベン図に示される。リンマ、DESeq2およびEdgeRの3つのプロトコルは類似しているが、分析のプロセス間で異なったステップを有する。たとえば、線形モデルは limma の統計に使用され、負の二項分布は edgeR および DESeq2 で使用されます。さらに、正規化された RNA-seq カウント データは、EdgeR と limma に必要ですが、DESeq2 には必要ありません。

ここでは、リンマ、EdgeR、DESeq2の3つの差分解析方法の詳細なプロトコルを提供します。3つの方法の結果は部分的に重なっています。3 つのメソッドには独自の利点があり、メソッドの選択はデータのみに依存します。

Introduction

RNA-シーケンシング(RNA-seq)は、多くの利点(例えば、高いデータ再現性)を有するトランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つであり、複雑な生物学的プロセス^1,2の機能とダイナミクスについての理解を劇的に高めています。異なる生物学的文脈下での異常転写物の同定は、RNA-seq分析の重要なステップである。RNA-seqは、病因と関連する分子機構と生物学的機能を深く理解することを可能にします。したがって、微分分析は、腫瘍^3、4、5の診断、予後および治療に対して価値があると考えられてきた。現在、RNA-seqの微分発現解析、特にリンマ、DESeq2およびEdgeR^1、6、7のために、よりオープンソースのR/バイオ伝導体パッケージが開発されている。しかし、差分分析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。

このプロトコ....

Protocol

注:R-studioプログラムを開き、Rファイル"DEGs.R"をロードし、ファイルは補助ファイル/スクリプトから取得することができます。

1. データのダウンロードと前処理

1. がんゲノムアトラス(TCGA)からコリンジオカルシノーマ(CHOL)のハイスループットシーケンシング(HTSeq)カウントデータをダウンロードしてください。このステップは、次の R コードで簡単に実現できます。
   1. R パッケージをインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。
   2. [ 実行 ] をクリックして R パッケージを読み込みます。
      if(!必要な名前空間(「バイオックマネージャー」、静かに=真))
      + インストール.パッケージ(「バイオックマネージャー」)
      バイオクマネージャー::インストール(c(「TCGAbiolinks」、"要約実験")
   3. 作業ディレクトリを設定します。
      図書館(TCGAbiolinks)
      ライブラリ(要約実験)
      setwd(「C:/ユーザー/リウシイ/デスクトップ」)
   4. がんの種類を選択します。
      がん< - "TCGA-CHOL"
   5. "GDCquery.R" ファイルから R コードを実行して、データをダウンロードします。ファイル "GDCqu....

Results

火山プロットとベン図が特に使用されている微分表現解析の結果を可視化するための様々なアプローチがあります。リンマは、cholと正常組織の間の3323 AGを|logFC|≥2およびadjで同定した。P.Val <0.05 しきい値として、その中で1880はCHOL組織でダウンレギュレートされ、1443 はアップレギュレートされた (図 1a)。一方、edgeR は 1578 のダウンレギュレーション DEG と 3121 のアップレギュレーション DEG を特定しました (図 1b)。DESeq2 は、1616 のダウンレギュレーション DEG と 2938 のアップレギュレーション DEG を特定しました (図 1c)。これら3つの方法の結果を比較すると、1431個のアップレギュレーションDEGと1531個のダウンレギュレートDEGが重なっていた(図2)。

Discussion

癌における豊富な異常性転写物は、RNA-seq差動分析⁵によって容易に同定することができる。しかし、RNA-seq微分発現解析の適用は、R言語と適切な方法を選択する能力を持つ特定のスキルを必要とするため、しばしば制限されています。この問題に対処するために、我々は、3つの最も知られている方法(リンマ、EdgeRおよびDESeq2)とRNA-seqの微分発現解析を適用するためのチュートリアルの詳細な紹介を提供する。これにより、3つの方法すべてにおける類似点と相違点の理解が容易になり、個々のデータに適した方法を選択することができ、複雑な動的生物学的プロセスを理解できるようになります。

ここでは、リンマ、edgeR、DESeq2を通じたRNA-seq微分発現解析の詳細なプロトコルを、(i)データのダウンロードと前処理、(ii-iv)リンマ、edgeR、DESeq2を介した微分発現解析、(v)それぞれ、これらの3つの方法の結果をベン図を通じた比較に示す。

3つの方法は、微分式解析のプロセス.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
R		バージョン3.6.2	フリーソフト
Rstudio			フリーソフト