マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価

Anna C. Seubert; Marion Krafft; Kai Kretzschmar

doi:10.3791/62529

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方法論記事

マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価

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DOI:

10.3791/62529

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2021年7月31日

Anna C. Seubert¹ , Marion Krafft¹ , Kai Kretzschmar¹

¹Mildred Scheel Early Career Centre (MSNZ) for Cancer Research, IZKF/MSNZ, University Hospital Würzburg

この記事について

サマリー

我々は、成体マウスの舌上皮に由来する口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価の方法を提示する。

要約

私たちの口の中を覆う粘膜である口腔粘膜は、高度に区画化された組織であり、頬粘膜、歯肉、唇、口蓋、舌に細分化することができます。その最上層である口腔上皮は、生涯を通じて成体幹細胞によって維持されます。成体上皮幹細胞の増殖と分化は、 in vivo マウスモデルおよびin vitro ベースの二次元(2D)フィーダーセルモデルを用いて集中的に研究されています。これらの方法を補完するのがオルガノイド技術で、成体幹細胞を細胞外マトリックス(ECM)に富むハイドロゲルに埋め込み、成長因子の明確なカクテルを含む培地を提供します。これらの条件下では、成体幹細胞が増殖し、自発的に三次元(3D)細胞クラスター、いわゆるオルガノイドを形成します。オルガノイド培養は、最初にマウスの小腸上皮幹細胞から確立されました。しかし、その後、この方法は他の上皮幹細胞タイプにも適応されています。ここでは、マウス口腔粘膜オルガノイド培養物の作製と特性評価のためのプロトコールについて説明します。初代上皮細胞をマウス舌組織から単離し、ECMハイドロゲルに包埋し、上皮成長因子(EGF)、R-スポンディン、および線維芽細胞成長因子(FGF)10を含有する培地で培養する。最初の播種から7〜14日以内に、得られたオルガノイドを継代して、さらなる増殖と凍結保存を行うことができます。さらに、3Dホールマウントイメージングと遺伝子発現解析による確立されたオルガノイド培養の特性評価のための戦略も提示します。このプロトコルは、経口上皮幹細胞の挙動 をex vivo で還元主義的に調査するためのツールとして役立つ可能性があります。

概要

口腔粘膜は、私たちの口の中を覆う粘膜です。それは消化管の入り口として機能し、消化過程の開始に関与しています^1,2。さらに、口腔粘膜は、物理的、化学的、生物学的な侮辱からの保護を提供する外部環境に対する私たちの体のバリアとして機能します¹。機能と組織学に基づいて、哺乳類の口腔粘膜は、咀嚼粘膜(硬口蓋と歯肉を含む)、内層粘膜(軟口蓋の表面、舌の腹面と頬面として機能する)、および特殊な粘膜(舌の背側表面を覆う)^の3つのタイプに分類できます2。すべての口腔粘膜組織は、表面の層状扁平上皮とその下にある固有層¹の2つの層で構成されています。口腔上皮ケラチノサイトは、上皮の主要な細胞型であり、ランゲルハンス細胞¹などの上皮内免疫細胞の位置でもあります。間質コンパートメントである固有層は、線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、免疫細胞などの異なる細胞タイプで構成されています¹。すべての層状上皮と同様に、幹細胞と前駆細胞は口腔上皮¹の基底層に存在します。これらの特殊な細胞は、細胞分裂を通じ....