マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

門脈を介した門脈内膵島移植(IIT)は、臨床現場でヒト膵島移植に最も一般的に使用される方法である。マウスIITモデルは、膵島移植を研究し、膵島移植の有効性を高めることができる有望な介入アプローチをテストする絶好の機会を提供します¹。IITは1970年代に初めて記載され、いくつかのグループ¹、^2、3、^4、5によって使用されました。それは20006,7年にヒト膵島移植のブレークスルーの後に人気を取り戻しました。 しかし、ほとんどの膵島移植研究は、その容易な成功のために実験的な膵島移植のための好ましい部位として腎臓カプセルを使用した。それどころか、IITはより技術的に困難であり、膵島移植研究にはあまり使用されていません^8,9。しかし、IITとは異なり、腎臓カプセルの下に移植された膵島は、血栓症、炎症、および肝組織虚血を特徴とする即時の血液媒介性炎症反応に罹患しないため、肝臓に移植された膵島よりも優れた機能を有する。したがって、腎臓カプセルモデルは、ヒト膵島移植において膵島が遭遇するストレスを完全に模倣していない可能性がある^10,11,12。

マウスにおけるIITの主な合併症の1つは、移植後の注射部位からの出血であり、これは異なるマウス系統間で死亡率の10〜30%を引き起こす可能性がある¹²。この論文では、出血をより迅速かつ確実に止め、IIT後のマウスの死亡率を減らすために、2つの洗練されたアプローチが開発されました。これらの洗練された詳細を視覚的に実証することは、研究者がこの技術的に困難な手順の重要なステップを特定するのに役立ちます。さらに、レシピエントの肝臓における膵島移植片の位置は、移植膵島を有するヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色肝臓組織(全切片)の組織学的検査によって決定された。

すべての手順は、サウスカロライナ医科大学とチャールストンのラルフHジョンソン医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て実施されました。

1. ストレプトゾトシン(STZ)を用いた糖尿病誘導

1. レシピエントマウス調製:
   1. すべてのマウスを個別に計量する。
   2. グルコメーターを用いて尾静脈血サンプルから血糖値を確認する。
2. 3つの異なるシナリオに対するSTZ線量決定:
   1. 脂肪肝疾患のマウスの場合、STZ [40mg / kg /日、腹腔内注射]を5日間連続して1回注射する。
   2. NOD-SCIDマウスの場合、一晩絶食した後、125mg / kgのSTZ、単回注射、すなわち注射する。
   3. C57BL / 6マウスの場合、225mg / kgのSTZ、単回注射、i.p.
3. STZ (13.5 ミリグラム/mL) の計算:
   注:この計算は、体重が30gの5匹のC57BL/6マウスを対象としています。
   1. 総体重:5匹×30g/匹=150g
   2. 必要なSTZ : 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg
4. STZの準備:
   1. 事前に計算された用量に従ってSTZを計量する。
   2. 秤量したSTZ粉末を氷上の10mLビーカーに移す。
   3. 3mLのクエン酸ナトリウム溶液をビーカーに加え、STZを溶解する。
   4. よく混ぜ、0.22 μmの細孔を通してろ過滅菌し、調製から10分以内にSTZ溶液を使用してください。
5. STZ注射:
   1. 所望の量のSTZ溶液(マウス1匹に十分)を1mLシリンジにロードする。
   2. マウス腹部の右下の象限に腹腔内注射を行う。
   3. 注射後5分間マウスを観察し、ケージに戻す前にこの期間中に不快感の兆候がないか確認してください。
   4. STZ注射後毎日グルコメーターを用いて尾静脈血試料から血糖値を監視する。
      注:この実験では、非空腹時血糖値が2日間連続して350 mg/dL>場合、マウスは糖尿病とみなされます。

2. 膵島の準備

注:ヒト膵島は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したCMRL-1066培地中で、100mm細胞培養皿あたり10,000膵島等価数(IEQ)の密度で培養した⁹。マウス膵島は、同じ密度の10%FBSおよび1%P/Sを有するDMEM中で培養した¹³。6〜10週齢の雄性NOD-SCIDおよびC57BL/7マウスを市販の供給源から入手した。

1. 培養した膵島を細胞培養皿から緩やかな引っ掻き傷で剥離する。
2. 1ccシリンジを使用して所望の数の膵島(例えば、300〜350膵島)を手作業で選択し、氷上の滅菌1.5mL微量遠心管に入れる。
3. 微量遠心機を用いてチューブを10秒間回転させる。
4. 上清を取り除き、ペレットを失うのを避けるために液体を残します。
5. ペレットを200 μLのHBSSに0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)で再懸濁する。
6. 再懸濁した膵島を0.5mLのインスリン注射器に吸引する。
7. シリンジを直立姿勢に置きます。膵島を1分間沈めましょう。
8. シリンジを押してすべての気泡を除去し、膵島を含む液体を約100〜150μL残す。
9. シリンジヘッドを下げ、シリンジの側面を軽く叩いて、膵島が液体全体に均等に分布するようにします。これで、膵島は注射の準備が整いました。

3. 膵島移植

1. マウスを2%イソフルランで全身麻酔下で誘導し、維持する。動物の適切な麻酔を確実にするためにペダル反射の欠如をチェックしてください。
2. マウスの腹部領域の毛皮を剃って取り除きます。
3. ブプレノルフィンの単回術前用量を投与する(0.1mg / kg i.p.)。
4. 2%ヨウ素と75%アルコールの3つの交互のワイプで手術領域を消毒する。
5. マイクロハサミで開腹を行い、1〜1.5cmの切開を生成します。
6. リトラクターで腹腔を開きます。以下に詳述するように、方法Aまたは方法Bのいずれかに従ってください。

方法A:(ゲルフォームでブリードを止める、図1A)¹⁴、^15、16

1. マウスの準備
   1. 切開部の周りに滅菌ガーゼを置きます。
   2. 鉗子を使って腸をそっと引き抜き、ガーゼの上に置きます。
   3. その場所によって門脈を特定し、それをよく露出させる。
   4. 手術全体を通して暖かい生理食塩水で腸を覆います。
2. 膵島プリロードインスリンシリンジ針を十二指腸近くの門脈を通して挿入する(図1B)。これを行うには、穴(ベベル)を下に向けて針を保持し、壁を貫通する前に開口部サーフェスの角度を門脈壁に平行に配置します。
   1. プランジャーを引いてシリンジに血液(20〜50μL)を吸い込み、最初に膵島を混ぜる。
   2. 膵島を門脈にゆっくりと注入しながら、プランジを引っ張ったり押したりを繰り返します。
   3. 注射部位を覆うようにゲルフォーム(約0.5cm x 0.5cmのサイズ)を置きます。
   4. 門脈から針を引き抜きながら、綿の先端でゲルフォームを押し下げます。
   5. ゲルを約2分間押し続け、活発な出血がないことを確認します。
   6. 綿の先端をロールオーバーしてゲルフォームから遠ざけ、ゲルフォームが門脈をよく覆うことを確認します。

方法B:(脂肪パッドで出血を止める、図1C)¹⁷

1. 門脈を徹底的に露出させる。
   1. 2つの綿の先端を使用して、露出した門脈を左右の両方から保持します。
   2. 十二指腸と門脈の間の脂肪組織パッドを特定する。
   3. 門脈に針を挿入する前に、脂肪パッドを貫通してください(図1D)。
   4. 方法Aのパート4.2.1および4.2.2で説明した同様の手順に従って、膵島を注入する。
   5. 綿の先端で脂肪を押し下げながら針を引き抜きます。
   6. 針を外した後、脂肪パッドを1分間押し続けます。
2. 門脈からの出血がないことを確認した後、腸を元の位置の腹腔に静かに戻します。
3. 閉鎖前に0.5mLの温かい生理食塩水(36〜37°C)を腹腔内に放置する。
   注:温かい生理食塩水は、手術後の腸の動きと回復を促進し、腸の壊死を防ぎます。
4. 5-0の縫合糸で筋肉層を閉じます。
5. 4-0縫合糸で皮膚層を閉じる。
6. 麻酔から完全に回復するまで、マウスを加熱パッド上の清潔なケージに入れます。
7. 12時間ごとに鎮痛剤(例えば、ブプレノルフィン0.1mg/kg i.p.)を引き続き投与し、手術後48時間にわたって補助的な熱を提供する。
   注:膵島移植手順は、完了するまでに約15〜20分かかります。

6. 肝臓切片全体のH&E染色と写真

1. 肝臓灌流
   1. パート3.1で説明したように、マウスを麻酔下に置きます。
   2. 門脈を慎重に露出させ、下大静脈を切断する。
   3. 25G針を備えた20mLシリンジを用いて、門脈を介して20mLの10%パラホルムアルデヒドを用いて肝臓を約5分間手動で灌流^する18。
      注:肝臓灌流は、肝臓組織から血液を除去し、膵島移植片を乱すことなく肝臓固定を改善することができる。
   4. 灌流された肝臓全体を他の器官から解剖する。
   5. 灌流肝臓組織を10%パラホルムアルデヒドで24時間固定する。
   6. パラフィンに組織を埋め込む。
   7. それぞれ5μm厚の組織切片を切り取り、スライドガラスに載せて染色する。
   8. 標準的な方法を用いてH&E、インスリン、フィブリン、および多形核好中球(PMN)染色を行う^15,16。
   9. 顕微鏡下で肝臓切片全体をスキャンします。

我々は、門脈を介して同系および異系膵島移植を行った。膵島移植機能は、両方の膵島移植モデルにおいて用量依存的に観察された。C57BL/6マウスを用いた同系膵島移植モデルでは、250匹の膵島を移植すると、マウスが高血糖に戻る前に一過性正常血糖が生じた。500膵島を受けたマウスは、移植後30日を超えて正常血糖に達し、維持した(図2A)。両群のマウスは体重の増加を示した(図2B)。

同様に、ヒト膵島対糖尿病NOD-SCIDマウス膵島移植モデルにおいて、体重45、85、または140 IEQs/kgを移植した場合の膵島移植機能を比較した。ノルモ血糖は、45 IEQ/g(〜225-275膵島/マウス)のヒト膵島を移植した場合に達成できなかった。膵島数が85 IEQ/g(~400-450膵島/マウス)に増加したとき、レシピエントの35.7%(10/28)は移植後60日目に正常血糖(p = 0.02対45 IEQ/g群)を達成した。さらに、ヒト膵島140IEQ/g(~600~650膵島/マウス)を受けたレシピエントの83.3%(5/6)が正常血糖に達した(図2C)。さらに、出血していた大多数のマウスは手術後に死亡し、出血のないマウスは生き残った (図2D)。

十分な数のヒト膵島がNOD-SCIDレシピエントに生着すると、移植後の初期段階で血糖値が十分に制御され、研究の終わりまで十分に維持される可能性がある。移植された膵島は、H&E染色およびインスリン染色によって容易に同定することができる。移植後28日目に、移植されたヒト膵島は肝臓全体に均等に分布し、そのほとんどは血管の周囲/近くに分布していた(図3)。

肝内モデルは、ヒト膵島移植に見られるような即時血液媒介性炎症反応を実証するために使用された。我々の組織切片では、インスリンの発現、ならびに移植膵島におけるフィブリンおよび多形核白血球浸潤の存在を観察した(図4A-D)。

図1:肝内膵島移植手順の説明図。方法Aおよび方法Bで使用される主要なステップの概略図(B、D)。膵島は、門脈を介して直接注入された(C)か、または脂肪パット(D)を介して間接的に注入された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:門脈内膵島移植の代表的な転帰。(A、B)。 同系マウス膵島門内移植。C57BL/6マウスの膵島(250または500)を、STZによって糖尿病にされた雄のC57BL/6マウスに移植した。(a)連続血糖値を測定した。ノルモ血糖は、<2日間連続して>200mg/dLのグルコースレベルと定義した。(b)レシピエントの体重の増加は、膵島移植後に観察された。(C) 45 IEQ/g(n=7)、85 IEQ/g(n=28)、および140 IEQ/g(n=6)で異なる数のヒト膵島を投与されたマウスにおいて、正常血糖に達した糖尿病性NOD-SCIDマウスの割合。(D)出血マウスおよび非出血マウスにおけるIIT後の生存率(それぞれn=14)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:移植後28日目におけるヒト膵島移植片を有するNOD-SCID肝臓の肝臓切片のH&E染色。 島は黒い円でマークされています。各円の直径は、各膵島のサイズと正に対応します。スケールバー = 肝臓切片全体で1,000 μm、差し込みで100 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:門脈内移植後6時間の肝臓における門脈内移植マウス膵島の代表的な組織学的写真 。 (A)H&E、(B)インスリン(赤色)(C)フィブリン、および(D)PMN染色剤。スケールバー = 100 μm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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