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概要

インビボでは 膵臓の高解像度イメージングが膵臓のインビタルイメージングウィンドウで容易であった。

Abstract

生きた小動物モデルにおける膵臓の直接 生体細胞 分解能イメージングは技術的に困難であった。最近の生体内イメージング研究は、腹部イメージングウィンドウを用いて、生体内の腹部器官における細胞ダイナミクスの可視化を可能 にした。しかし、生理学的な動き(例えば、蠕動や呼吸)の影響を受けやすいマウス膵臓の柔らかいシート状のアーキテクチャにより、マウス膵 臓 の膵臓で膵島または癌細胞を同定、追跡、定量するために、細胞レベルで数週間にわたって細胞内で安定した縦方向のイメージングを行うことは困難であった。本明細書において、膵臓微細構造の経縦経時間経過インビトバイタルイメージングのために膵臓を腸から空間的に分離することができる新規支持基剤、統合された膵臓内脳イメージングウィンドウを移植する方法について説明する。画像化窓を用いた縦方向 インビボ イメージングは安定した可視化を可能にし、3週間にわたって膵島の追跡と微細構造の高解像度3次元画像化を可能にする、正形膵臓癌モデルでここに証明されるように。我々の方法により、さらに、細胞レベルで膵臓を含む様々な疾患の病態生理を解明することができる生体内イメージング研究。

Introduction

膵臓は、消化管の外分泌機能と血流中にホルモンを分泌する内分泌機能を有する腹部器官である。膵臓の高解像細胞イメージングは、膵炎、膵臓癌、および糖尿病を含む膵臓を含む様々な疾患の病態生理を明らかにすることができる^1。コンピュータ断層撮影、磁気分解能画像、および超音波検査などの従来の画像診断ツールは、臨床分野^1,2で広く利用可能である。しかし、これらのイメージングモダリティは構造的または解剖学的変化のみを視覚化することに制限されているが、細胞レベルまたは分子レベルでの変化は決定できない。ヒトにおける糖尿病や膵臓癌の分子変化が診断^3、4の10年以上前に開始できることを考えると、潜伏期間中の分子転移から膵臓疾患を検出することは、早期診断とタイムリーな介入を提供する可能性を秘めている。したがって、分解能の限界を克服し、機能に関する貴重な洞察を提供するイメージングは、膵臓癌の早期診断または、糖尿病の進行期における膵島の改変の高度な同定を提供することによって顕著に注目を集める^5。

特に島と共に、核イメージング、生物発光イメージング、および光コメレンストモグラフィーは、非侵襲的な島頭撮影技術⁶として示唆されている。しかし、これらの方法の分解能は、数十~数百マイクロメートルの典型的な値で、小島の細胞レベルでの変化を検出する限られた機能を提供する、実質的に低い。一方、以前の高解像研究では、ex vivo^7,8(例えば、 膵臓のスライスまたは消化、非生理学的⁹⁽例えば、膵臓の外在化)および異所性状態10、11、12(例えば、腎臓カプセルの下、肝臓内、および眼の前房に移植)、解釈および臨床的意味を制限する。もし、高解像イメージングのin vivo、生理学、および異形性体モデルを確立できれば、膵島の調査に不可欠なプラットフォームとなるでしょう。

生体動物の微視的分解能レベルで病態生理を明らかにする生体内イメージングは、最近、大きな注目を集めています¹³.in vivo イメージング法のうち、マウスの腹部に窓を埋め込む腹部イメージングウィンドウ¹⁴の開発により、新しい知見(すなわち、早期肝転移¹⁵ の前微小転移段階および腸上皮¹⁶における幹細胞維持のメカニズム)の発見が可能になった。腹部イメージングウィンドウは貴重な結果をもたらすが、膵臓に対するこの窓の用途および膵臓を含む疾患に基づく結果として生じる生体内イメージング研究は、広範囲に調査されていない。

ヒト膵臓の固形器官特性とは異なり、マウスの膵臓は、拡散分散した軟組織様構造¹⁷である。したがって、蠕動や呼吸などの生理学的な動きによって絶え間なく影響を受けます。膵臓の腹部イメージングウィンドウの適用に関する以前の研究は、腸の動きによって誘発された動きアーティファクトのためにさまようことを実証した^18.結果として得られた平均画像では重度のぼかしが観察され、マイクロスケール構造の視覚化と同定が妨げられていた。

ここでは、膵臓を含む疾患における縦方向細胞レベル事象を調べるため、生体内顕微鏡^19,20と組み合わせた新規支持基盤統合膵臓生体内イメージングウィンドウの使用について説明する。前の研究¹⁸の方法論の詳細な説明に加えて、膵臓を含む様々な疾患に対する膵画像化窓の拡張応用について本論文で説明する。このプロトコルでは、カスタム構築されたビデオレートレーザースキャン共焦点顕微鏡システムを、生体内顕微鏡システムとして利用した。4つのレーザーモジュール(405、488、561、および640 nmの波長)が励起源として利用され、4つの発光信号がバンドパスフィルタ(BPF1:FF01-442/46)を介して光増倍管(PMT)によって検出されました。BPF2: FF02-525/50;BPF3: FF01-600/37;BPF4: FF01-685/40)。レーザースキャンは、回転する多角形ミラー(X軸)と、ビデオレートスキャン(30フレーム/秒)を可能にするガルバノの走査ミラー(Y軸)で構成されていました。生体内顕微鏡に関する詳細は、前の研究10、18、19、20、21、22、23に記載されている。

以前の島の調査¹⁸では、遺伝子導入マウスモデル(MIP-GFP)24を用いて、生きたマウスの中の小島をGFPでタグ付けした状態で安定した画像を作成することに成功しました。この方法により、1週間の間に小島の変化を高解像度で可視化することができました。また、最大3週間の同じ膵島のイメージングを促進し、これは、糖尿病の病因の病因の間に機能的追跡またはモニタリングのための膵島の長期研究の実現可能性を示唆^する。さらに、蛍光膵臓癌細胞(PANC-1 NucLight^Red)25をマウスの膵臓に直接移植する、正腸膵臓癌モデルを開発した。膵臓内イメージングウィンドウの適用により、このモデルは、膵臓癌の腫瘍微小環境における細胞および分子病態生理学を調査し、新しい薬剤候補の治療的モニタリングのためのプラットフォームとして利用することができる。

Protocol

本論文に記載されている手順はすべて、実験動物のケアと使用のためのガイド(2011)26に従って行われ、韓国科学技術院(KAIST)とソウル国立大学バンダン病院(SNUBH)の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。 1. 窓等の材料の準備 腹腔18内の腸から膵臓を隔離するために膵臓のインビタルイメージングウィンドウをカスタム設計する(図1A、B)。ウィンドウの詳細な青写真は、前の研究18の補足図に記載されています。 C57BL/6Nマウス、8-12週齢の男性を、膵臓内イメージングに使用する。Alexa 647フルオロフォアと共役した抗CD31抗体を、イメージングの2時間前に、血管標識18の目的で注入する。 小島の研究では、小島が蛍光レポータータンパク質でタグ付けされたトランスジェニックマウスモデルを準備します。ここで、マウスインシュリン1遺伝子プロモーターの制御下で緑色蛍光タンパク質を発現させたMIP-GFPを利用し、マウス24内のすべての島のβ細胞において活性である。 膵臓癌研究のために、蛍光レポータータンパク質とBALB / Cヌードマウスでタグ付けされたトランスジェニック癌細胞を調製する。本研究では、PANC-1 NucLight赤細胞を使用した。PANC-1癌細胞25 は、NucLight赤色蛍光プローブで標識した。 すべての外科用ツールを殺菌し、ガラスをカバー(PEGか、ないか)、およびオートクレーブを使用して窓をイメージする。 PEGコーティングをカバーガラスに塗布して炎症反応を防ぎ、生体適合性を高め、長期イメージングに適しています。 2. 手術 無菌の外科用プラットフォームを準備し、70%エタノールで表面を殺菌する。注: 縦手方向のイメージング セッションでは、無菌技術が不可欠です。 タイルアミン/ゾラゼパム(30 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の混合物でマウスを麻酔します。注: 高血糖の悪影響のため、ケタミンの代わりにタイルタミン/ゾラゼパムの使用をお勧めします。最適な麻酔は、実験9、27の目的のために選択されるべきです。 家庭温用の制御加熱パッドを備えた直腸プローブを使用して体温を監視します。 マウスの左脇腹を剃り、交互のアルコールとヨウ素ベースのスクラブの3ラウンドを適用します。注:脱毛剤を使用する場合は、化学的な火傷を避けるために1分以上放置しないでください。 マウスの左脇腹に1.5cmの切開を行い、皮膚と筋肉を解剖します。 切開マージンに黒またはナイロン4-0縫合を使用して、財布ストリング縫合を行います。 切開部にマイクロリトラクタを使用し、脾臓を静かに露出させる。 慎重にリング鉗子で脾臓をプールし、膵臓を識別します。 マウスの脇腹に窓を置き、窓の空きスペースを通して脾臓と膵臓を渡します。膵臓の操作は、出血や膵炎を引き起こす可能性がありますので、非常に異邦性でなければなりません イメージングウィンドウのプレートに膵臓をそっと置きます。脾臓はウィンドウの空きスペースに配置されます。 がん細胞の研究のために、膵臓にPANC-1 NucLightレッド(1.0 x 106 細胞)を直接注入します。注:異種ヒト膵臓がんの異種移植片の異所性ヒトと同位体を画像化するために、PANC-1または他のヒト膵臓癌細胞などの癌細胞の直接移植を28に促進することができる。生体内蛍光顕微鏡法で可視化するために、PANC-1細胞を、核29に標識するNucLightレッドレンチウイルス試薬を用いて赤色蛍光タンパク質でトランステーションした。最大射出量は不明であるが、膵臓の圧力効果を避けるために、可能な限り体積を減少させる。 イメージングウィンドウの余白にN-ブチルシアノアクリル酸接着剤の滴を塗布します。 塗布された接着剤の量を最小限に抑えるには、31Gカテーテル針を使用して塗布します。ドロップの量が大きい場合、組織は意図せずに窓やカバーガラスに付着します。 12mmの丸いカバーガラスを撮像窓の余白にそっと塗布します。 縫合ループを引っ張って窓の側面溝に収まり、3回結びます。 これらのマウスが目を覚ましているときにタイトなステッチの中断を防ぐために結び目の最大近位部位をカットします。 マウスは麻酔から回復させ(2〜3時間)、ケトプロフェン(5mg /kg、首の基部または動物の股関節の緩い皮膚に皮下)を注入して痛みを軽減させます。12時間ごとに痛みの徴候を再評価し、ケトプロフェンは1〜3日間24時間ごとに考慮する必要があります。注:鎮痛はグルコース9に応答してインスリン分泌に影響を与える。鎮痛の選択とタイミングは、実験目的のために個別化されなければならない。 ケージにマウスを付着し、十分な寝具で、窓がケージに接触するのを避ける。窓の手術なしでマウスで家を収容しないでください。 3. 生体内イメージング レーザーパワーを含む生体内顕微鏡をオンにします。 加熱パッドをオンにし、家庭温の調節を37°Cに設定します。注:または、ホーム熱調節がない場合は、頻繁に制御するパッシブ加熱パッドまたはランプを使用してください。 タイルアミン/ゾラゼパム(30 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)の混合物で筋肉内麻酔を行います。注: 高血糖の悪影響のため、ケタミンの代わりにタイルタミン/ゾラゼパムの使用をお勧めします。最適な麻酔は、実験9、27の目的のために選択されるべきです。 注射のために血管カテーテルを挿入します。 止血帯アプリケーションの代替として、人差し指と3本目の指で尾の近位側に圧力をかけます。必要に応じて、ランプで尾部を熱します。 70%エタノールスプレーで尾静脈を殺菌する。 30Gカテーテルを横尾静脈に挿入します。血液の逆流は、PE10チューブで可視化されます。 カテーテルに絹のテープを貼って安定させる。 FITC/TMRデキストランまたは他の蛍光プローブ(25μgの抗CD31をAlexa 647と共役)を適宜注入し、蛍光プローブ18の組み合わせに従って注入する。注:蛍光共役抗体プローブの場合は、イメージングセッションの前に2時間注入します。 手術用プラットフォームからイメージング段階にマウスを移します。 直腸プローブを挿入して、家庭温熱パッドシステムで体温を自動的に制御します。 膵臓イメージングウィンドウを、生体内顕微鏡のセットアップ中に準備したウィンドウホルダーに挿入します(図2)。逆顕微鏡の場合、窓ホルダーは必要ない場合があります。 インビタルイメージングを行います。 膵臓のイメージングの場合、膵臓イメージングウィンドウ(推奨視野:2500 x 2500 μm)で膵臓の全視をスキャンするための低倍率対物レンズ(例えば、4x)から始めます。 対象領域を決定した後、より高い拡大倍率の対物レンズ(20xまたは40x)に切り替えて、細胞レベルイメージング(推奨視野:500 x 500 μmまたは250 x 250 μm)を実行します。この実験では、横方向と軸方向の分解能はそれぞれ約0.5μmと3μmであった。 Zスタックまたはタイムラプスイメージングを実行して、細胞移動などの3D構造または細胞レベルのダイナミクスを観察します。注:トランスジェニック動物(MIP-GFP)の蛍光タンパク質発現細胞をイメージングするため、0.43mWまでの電力での間欠的な488 nmレーザー露光の30秒は、目立つ光の切り落としや組織損傷なしに許容可能であった。Alexa 647で標識された蛍光タンパク質をイメージングするために、640 nmレーザーパワーは0.17mWまで、目立つ光漂白や組織損傷を伴わずに許容可能でした。この設定を上回るパワーで長時間の励起レーザー露光は、光毒性による光の漂白または組織の損傷につながる可能性があります。適切なゲインと電力を調整して、対象領域を適切に画像化します。インビタル顕微鏡検査におけるパラメータの詳細設定は、研究所で作成された各インビタル顕微鏡検査に個別化する必要があります。

Representative Results

生体内顕微鏡検査と統合された膵臓内イメージングウィンドウを組み合わせることで、マウス内の膵臓の縦方向の細胞レベルのイメージングが可能になります。膵臓のイントビタルイメージングウィンドウを備えたこのプロトコルは、高解像イメージングの取得を可能にする長期組織安定性を提供し、個々の膵島を最大3週間追跡します。その結果、視野の拡大、zスタックイメージングの3次?…

Discussion

ここで説明するプロトコルは、腹部イメージングウィンドウから修飾された新しい支持基盤統合膵臓イントコールイメージングウィンドウを用いた膵臓の生体内画像化から構成される。上記のプロトコルの中で、第1の重要なステップは、マウスにおける膵臓内イメージングウィンドウの移植である。窓の接着剤の塗布のためには、窓の余白とカバーガラスの間に接着剤を塗布することが重要…

Materials

Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (NHS esters)	Invitrogen	A20006	Fluorescent probe for conjugate with antibody
BALB/C Nude	OrientBio	BALB/C Nude	BALB/C Nude
BD Intramedic polyethylene tubing	BD Biosciences	427401	PE10 catheter for connection with needle
C57BL/6N	OrientBio	C57BL/6N	C57BL/6N
Cover glasses circular	Marienfeld	0111520	Cover glass for pancreatic imaging window
FITC Dextran 2MDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	FD200S	For vessel identification
IMARIS 8.1	Bitplane	IMARIS	Image processing
Intravital Microscopy	IVIM tech	IVM-C	Intravital Microscopy
IRIS Scissor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	S-1107-10	This product can be replaced with the product from other company
Loctite 401	Henkel	401	N-butyl cyanoacrylate glue
Micro Needle holder	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	H-1126-10	This product can be replaced with the product from other company
Micro rectractor	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	17004-03	This product can be replaced with the product from other company
Microforceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1034	This product can be replaced with the product from other company
MIP-GFP	The Jackson Laboratory	006864	B6.Cg-Tg(Ins1-EGFP)1Hara/J
Nylon 4-0	AILEE	NB434	Non-Absorbable Suture
Omnican N 100 30G	B BRAUN	FT9172220S	For Vascular Catheter, Use only Needle part
PANC-1 NucLightRed	Custom-made	Custom-made	Made in laboratory
Pancreatic imaging window	Geumto Engineering	Custom order	Pancreatic imaging window – custom order
Physiosuite	Kent Scientific	PS-02	Homeothermic temperature controller
Purified NA/LE Rat Anti-Mouse CD31	BD Biosciences	553708	Antibody for in vivo vessel labeling
Ring Forceps	JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD	F-1090-3	This product can be replaced with the product from other company
Rompun	Bayer	Rompun	Anesthetic agent
TMR Dextran 65-85kDa	Merck (Former Sigma Aldrich)	T1162	For vessel identification
Window holder	Geumto Engineering	Custom order	Window holder – custom order
Zoletil	Virbac	Zoletil 100	Anesthetic agent