磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

Summary

この論文では、固定密度の捕捉ビーズの浮上高さの変化を定量化することによって、可溶性または膜結合性の抗原の存在を特異的に検出できる磁気浮上ベースの方法について述べる。

Abstract

この方法は、密度と磁気特性に基づいて細胞と粒子を分離する磁気浮上の原理に基づいて開発されました。密度は細胞型識別性であり、その代謝率、分化、および活性化状態に直接関連する。磁気浮上により、循環血液細胞を分離し、画像化、特徴付け、密度や磁気特性に基づいて貧血、鎌状赤血球病、循環腫瘍細胞を検出するワンステップアプローチが可能になります。このアプローチは、それぞれ、捕獲および検出抗体でコーティングされた低密度および高密度ビーズのセットを使用して、溶液中に存在する可溶性抗原を検出するのに適しています。抗原が溶液中に存在する場合、それはビーズの2つのセットを橋渡しし、抗体コーティングされたビーズの列の間に浮上する新しいビーズ複合体を生成します。溶液中の標的抗原の濃度の増加は、より低い濃度の抗原と比較してより多くのビーズビーズ複合体を生成し、したがって標的抗原の定量的測定を可能にする。磁気浮上は、サンプル調製時間の短縮と古典的な読み出し方法への依存性の欠如のために他の方法に有利である。生成された画像は、スマートフォンやタブレットなどの標準的な顕微鏡やモバイルデバイスを使用して簡単にキャプチャおよび解析できます。

Introduction

磁気浮上は、細胞タイプ^1、2、3、タンパク質^4、5、オピオイド⁶を分離、分析、同定するために開発された技術であり、その特異的な密度と常磁特性のみに基づいて開発された技術です。細胞密度は、その代謝率および分化状態^{7、8、9、10、11、12、13、14}に直接関連する各細胞型の固有^の固有の性質である。定常状態の間、そして様々な細胞プロセスの間に、細胞密度の微妙で一過性の変化を定量化することは、細胞生理学および病理生理学に対する比類のない洞察を与えることができる....

Protocol

この研究で使用される実験的なプロトコルは、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター機関審査委員会(IRB)によって承認されました。

1. 機器のセットアップ

注:細胞を浮上させるイメージングでは、Z軸上に磁化された2つの希土類ネオジム磁石を、同じ極を向けて磁場を発生させる必要があります。磁石間の距離は、磁場の強さとターゲットの密度に応じてカスタマイズすることができます。この場合、磁石は長さ50mmの1×1mmのガラス毛管管を挿入するのに十分な1mm空間で分離される。デバイスは、AutoCAD デザインを使用して 3D 印刷されました。

1. 顕微鏡を横に、完全に水平に置きます。
   注:標準的な直立位置に置かれた顕微鏡は、凝縮器および目的に関する磁石の位置による浮上物の撮像には直接適していません。この制限は、顕微鏡を横に置くことによってバイパスすることができ、完全に水平に凝縮器は、キャピラリーに光を集中させることができ、そして、対物レンズはケーラーの照明要件を維持しながら、磁石の間に浮上する細胞をイメージする。
2. 2または3のラボジャックを使用して、ブレッドボードテーブルの上にスタンドをサポートし、レベルを付けます。
3. 振動を抑えるために、ゴム製の湿らせた足でブレッドボードテーブルを支えます。
4. ステージを取り外し、浮上装置(y軸)....

Results

磁気浮上は、物体の密度、磁気シグネチャ、常磁性溶液の濃度、および2つの強い希土類磁石によって生み出される磁場の強さに応じて、異なる浮上高さで異なる密度の物体に焦点を当てます。2つの磁石が互いの上に置かれると、浮上サンプルは、ケーラーの照明を維持したまま、その側面に向けられた顕微鏡を使用することによってのみ見ることができる(図1)。各細胞型が到達した最終的な浮上高さは、常磁性溶液の濃度を変えることで簡単に修正できます。図2は、ガドリニウムの種々の濃度を用いて異なる循環血液細胞の分離を示す。密度が異なる 2 つのビード タイプ(1.05 および 1.2 g/mL)は、密度浮上高さとサイズ参照を提供するために使用されました。特定の細胞型の浮上高さは、その固有の密度に依存するので、磁気浮上は、重要な操作²⁴を伴わずに目的の細胞を単離する直接的な手段を提供する。このプロトコルの主な目的は、循環赤血球上の膜結合抗原(この場合はRh因子)の存在を検出する磁気浮上の能力を実証することであ.......

Discussion

勾配遠心分離は、現在、そのユニークな密度に基づいて細胞下の成分を単離するための標準的な技術です。しかし、このアプローチでは、特殊な勾配媒体と遠心分離機装置を使用する必要があります。ここで提示される磁気浮上アプローチは、循環細胞の形態学的および機能的特性の詳細な調査を可能にし、細胞の操作を最小限に抑え、循環細胞への近く in vivo アクセスを提供する。

しかし、磁気浮上を使用する場合、いくつかの点は言及する価値があります。まず、イメージングに使用される顕微鏡は、セットアップに時間がかかるため、顕微鏡を部分的に分解し、磁石とキャピラリーチューブと正確に整列した光学系と完全に水平に配置する必要があります。第二に、毛細血管ガラスと焦点の動きを調整するために使用されるラボジャックと並進ステージは、3つの軸のそれぞれで正確な位置と自由な動きを必要とします。セットアップ全体の最も重要なアライメントは、トップとボトムの磁石が重力ベクトルと完全に水平になるように、移動段階で磁気浮上装置を取り付けることです。これらの要件からの逸脱は、磁力と重力の間に角度を作り出し、細胞を毛細管の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸水和物	シグマアルドリッチ	M-2933	(MES)活性化バッファーの成分
、50x2.5x1mm磁石、ニッケル(Ni-Cu-Ni)メッキ、グレードN52、厚さ5mm(0.197インチ)で磁化	K&J Magnetics		の磁気浮上装置に使用する注文の磁石
毛細管の密封剤(Critoseal)	Leica Microsystems	267620	毛細管の端を覆うのに使用
遠心分離管フィルター(Corning Costar Spin-X)	シグマAldrich	CLS8163	ビーズを洗うのに使用
コンパクトラボジャック	Thorlabs	LJ750	磁気浮上装置の調整に使用
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし	Gibco	14190-144	ビーズ懸濁液用溶液
エタノールアミン	Sigma Aldrich	E9508-100ML	ビーズの洗浄ステップ中に使用
蛍光原形質膜染色 (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Rh+細胞の染色に使用
ガドテリドール注射	ProHance	NDC 0270-1111-03	ガドリニウム(Gd3+);細胞を懸濁するために使用される磁気溶液
HBSS++	Gibco	14025-092	サンプル調製用溶液
ヒトC5b,6複合体	補体技術株式会社	A122	RBC Evs
ヒトC7タンパク質	補体技術株式会社	A124	RBC Evs
ヒトC8タンパク質	補体技術株式会社	A125	RBCを生成するために使用されますEvs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	磁気浮上装置をラボジャックに固定するために使用
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); 抗体カップリング反応に使用
正常なウサギIgGコントロール	R&D Systems	AB-105-C	制御条件としてビーズのコーティングに使用
リン酸緩衝生理食塩水 (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	カップリング緩衝液の成分、洗浄ステップに使用
ポリソルベート 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	活性化緩衝液の成分
ポリスチレン カルボキシルポリマー	Bangs Laboratories	PC06004	抗体カップリングに使用されるトップ密度ビーズ(1.05 g/mL)
RhDポリクローナル抗体	Invitrogen	PA5-112694	赤血球中のRh因子のデクテクション用ビーズのコーティングに使用
研究用顕微鏡	オリンパス	プロビスAX-70	顕微鏡 磁気浮上装置の取り付けと浮上細胞の表示に使用
ゴム製減衰脚	Thorlabs	RDF1	ブレッドボードテーブルを支えるために使用
スクエアボロチューブ	VitroTubes	8100-050
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	抗体カップリング反応に使用
トランスレーショナルステージ	Thorlabs	PT1	キャピラリーチューブのフォーカシングとスキャンに使用