磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

Summary

この論文では、固定密度の捕捉ビーズの浮上高さの変化を定量化することによって、可溶性または膜結合性の抗原の存在を特異的に検出できる磁気浮上ベースの方法について述べる。

Abstract

この方法は、密度と磁気特性に基づいて細胞と粒子を分離する磁気浮上の原理に基づいて開発されました。密度は細胞型識別性であり、その代謝率、分化、および活性化状態に直接関連する。磁気浮上により、循環血液細胞を分離し、画像化、特徴付け、密度や磁気特性に基づいて貧血、鎌状赤血球病、循環腫瘍細胞を検出するワンステップアプローチが可能になります。このアプローチは、それぞれ、捕獲および検出抗体でコーティングされた低密度および高密度ビーズのセットを使用して、溶液中に存在する可溶性抗原を検出するのに適しています。抗原が溶液中に存在する場合、それはビーズの2つのセットを橋渡しし、抗体コーティングされたビーズの列の間に浮上する新しいビーズ複合体を生成します。溶液中の標的抗原の濃度の増加は、より低い濃度の抗原と比較してより多くのビーズビーズ複合体を生成し、したがって標的抗原の定量的測定を可能にする。磁気浮上は、サンプル調製時間の短縮と古典的な読み出し方法への依存性の欠如のために他の方法に有利である。生成された画像は、スマートフォンやタブレットなどの標準的な顕微鏡やモバイルデバイスを使用して簡単にキャプチャおよび解析できます。

Introduction

磁気浮上は、細胞タイプ^1、2、3、タンパク質^4、5、オピオイド⁶を分離、分析、同定するために開発された技術であり、その特異的な密度と常磁特性のみに基づいて開発された技術です。細胞密度は、その代謝率および分化状態^{7、8、9、10、11、12、13、14}に直接関連する各細胞型の固有^の固有の性質である。定常状態の間、そして様々な細胞プロセスの間に、細胞密度の微妙で一過性の変化を定量化することは、細胞生理学および病理生理学に対する比類のない洞察を与えることができる。細胞密度の変化は、細胞分化^15、16、細胞周期進行^{9、17、18、19、}アポトーシス20、21、22、23、および悪性変換^24、25、26に関連付けられる.したがって、細胞密度の特定の変化の定量化は、異なるタイプの細胞間で区別するとともに、異なる活性化プロセスを経て同じタイプの細胞を区別するために使用することができる。これにより、密度の動的変化が変化した細胞代謝の指標となる特定の細胞サブ集団を標的とする実験が可能^になる。変化する環境⁷に応じて細胞の密度を変化させる可能性が確立されたので、その密度に関連して細胞の運動を完全に理解することが不可欠であり、現在の方法では¹²を提供しない可能性がある。一方、磁気浮上は、細胞およびその特性²⁸の動的評価を可能にする。

細胞は、永久的な磁気双極子モーメントを持たないという対磁性の意味です。しかし、外部磁場にさらされると、適用された磁場の反対方向に、弱い磁気双極子モーメントが細胞内に生成されます。したがって、細胞が常磁性溶液に懸濁され、強い垂直磁場にさらされると、磁源から離れて浮上し、主に個々の密度に依存する高さに停止します。不均一磁場の最小値に限定された物体の直径磁気浮上は、次の2つの基準が満たされている場合に可能です:1)粒子の磁気感受性は周囲の媒体よりも小さくなければならない、そして2)磁力は粒子の浮力のバランスを取るのに十分な強さでなければならない。両方の基準は、磁気バッファー内のRBCsを懸濁させることによって、および小さく、安価で、市販の永久磁石¹を用いて強い磁場勾配を作成することによって満たすことができる。重力の方向に沿った軸上の磁気的に閉じ込められた粒子の平衡位置は、その密度(バッファの密度に対する相対)、磁気感受性(バッファの磁気感受性に対する相対)、および適用された磁場の署名によって決定されます。溶液の密度と磁気特性はシステム全体で一定なので、細胞の固有密度特性は細胞の浮上高さを決定する主要な要因となり、密度の低い細胞と比較してより密度の高い細胞が低くなります。このアプローチでは、密度測定に正確な比比分析を使用できる 2 つの密度参照ビーズ(1.05 および 1.2 g/mL)のセットを使用します。磁気溶液の濃度を変更することで、循環細胞の密度が細胞特異的であるため、細胞特異的であるため、BVCからRbcsなどの異なる細胞集団を分離することができ、分離プロトコルやその他の細胞操作の必要性が取り除かれます。

生物学研究で使用される検出方法の大半は、線形信号を定量化しやすい特定の結合事象の外挿に依存しています。これらの読み出し方法は複雑な場合が多く、特殊な機器や専門の科学担当者が関与します。細胞または細胞外小胞の形質膜上に見出される抗原の検出を目的としたアプローチ、または血漿に可溶性である、1つまたは2つの抗体被覆ビーズのいずれかを使用して、本明細書に記載される。ビーズは、互いに異なる密度で、尋問対象のビーズとは異なる密度でなければなりません。任意の特定の生体流体中の標的抗原の存在は、検出ビードに結合している抗原陽性細胞の浮上高さの特異的で測定可能な変化に翻訳される。可溶性抗原または細胞外小胞の場合、それらは捕捉および検出ビーズの両方に結合し、ビーズ細胞複合体ではなくビーズ複合体を形成する。浮上高さの変化は、ビーズ細胞またはビーズの複合体の新しい密度に依存します。生体流体中の抗原の存在を示す複合体の浮上高さの変化に加えて、複合体の数も標的の量に依存し、磁気浮上も抗原検出²⁴のための定量的アプローチを行う。

Protocol

この研究で使用される実験的なプロトコルは、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター機関審査委員会(IRB)によって承認されました。

1. 機器のセットアップ

注:細胞を浮上させるイメージングでは、Z軸上に磁化された2つの希土類ネオジム磁石を、同じ極を向けて磁場を発生させる必要があります。磁石間の距離は、磁場の強さとターゲットの密度に応じてカスタマイズすることができます。この場合、磁石は長さ50mmの1×1mmのガラス毛管管を挿入するのに十分な1mm空間で分離される。デバイスは、AutoCAD デザインを使用して 3D 印刷されました。

1. 顕微鏡を横に、完全に水平に置きます。
   注:標準的な直立位置に置かれた顕微鏡は、凝縮器および目的に関する磁石の位置による浮上物の撮像には直接適していません。この制限は、顕微鏡を横に置くことによってバイパスすることができ、完全に水平に凝縮器は、キャピラリーに光を集中させることができ、そして、対物レンズはケーラーの照明要件を維持しながら、磁石の間に浮上する細胞をイメージする。
2. 2または3のラボジャックを使用して、ブレッドボードテーブルの上にスタンドをサポートし、レベルを付けます。
3. 振動を抑えるために、ゴム製の湿らせた足でブレッドボードテーブルを支えます。
4. ステージを取り外し、浮上装置(y軸)と2つの単軸の移動段階の高さを調整するためのコンパクトなラボジャックに置き換えます。焦点(z軸)を調整するための1つ、および毛細管管をスキャンするための2番目の1。
5. 2つのミニシリーズ光ポストを使用して、磁気浮上装置をラボジャックに取り付けます。

2. 抗体のカーボキシミクロ粒子/ビーズへの結合(PolyAnによるプロトコルから改変)

注: Rh(+)検出には低密度ビーズ(1.05 g/mL)のみをコーティングする必要がありますが、細胞外小胞の検出のために高密度および低密度ビーズの両方をコーティングします。

1. 1 mg 相当のビーズ懸濁液を取り出し、0.5 mLの活性化バッファー(50 mM MES(MW195.2、9.72 mg 1 mL))pH 5.0および0.001%ポリソルベート-20に加えます。
2. 12 μLの新鮮な1.5 M EDC(MW 191.7、0.28755 g 1 mL)、0.3 Mスルフォ-NHS(MW 217.14、0.0651 g 1 mL)の12 μLを氷冷水に加えます。
3. 軌道シェーカーにチューブを置き、室温で1時間激しく振ってビーズ上のカルボキシル基を活性化します。
4. カップリングバッファー(10x PBS、または0.1 Mリン酸pH 7-9)を0.5 mL添加して1時間後に活性化を停止します。
5. ペレットは、10分間20,000 x g で遠心分離機でビーズをペレット化するか、ビーズをペレット化できない場合は0.45 μm遠心管フィルターを使用します。上清またはフロースルーを吸引する。
6. ステップ2.5の場合と同様に、10倍PBSの1mLでビーズを3回洗浄します。
7. mgビーズ当たり25μgの抗体を計算し、必要な抗体と活性化ビーズを混合して、10X PBSで0.7〜1.0 mg/mLの最終抗体濃度を得ます。
8. 低速でセットチューブロッカーにチューブを配置します。カップリングのために一晩室温で穏やかにチューブをロールします。
9. ステップ2.5を繰り返し、10倍PBSの1mLでビーズを2回洗います。
10. 緩衝液pH 8.0で0.5mLの1 Mエタノールアミン(98%ストック=16.2 M)で、穏やかに振りながら室温で1時間ポリソルベート-20で洗浄します。
11. ステップ2.5を繰り返し、DPBSの1mLに1回ビーズを洗います。ビーズは必要になるまで4°Cで200 μLのDPBSに貯蔵することができます。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

3. Rh(+)検出のための血液の採取と準備

1. ワンクリックランシングデバイスを使用して、Rh(+)ドナーの指を刺し、10 μLの血液を1mLのDPBSに集めます。
2. 蛍光性形質膜染色でRh+細胞を染色する。必要に応じて、Rh+細胞の1 mL懸濁液に1μLの蛍光色素を加えます(1:1000希釈)。
3. 蛍光色素を37°Cで15分間インキュベートします。
4. ペレット細胞を15sで5,600xgで紡糸し、1mLのDPBSを用いて3回洗浄した。 カルシウムとマグネシウム(HBSS++)を使用してHBSSの1 mLで再中断します。
5. ワンクリックランシング装置を使用して、Rh(-)ドナーの指を刺し、2μLの血液を採取します。
   注:2つ以上の条件を準備する場合は、各チューブにRh(-)血液の1 μLを追加するのに十分な血液を収集します。
6. 必要な実験チューブを準備する:ビーズのみ、IgGコントロール、サンプル。
   1. ビーズ単独:HBSS++174 μL、IgGコントロールビーズ1 μL、高密度ビーズ1 μL(1.2 g/mL)、24 μLの500 mM Gd³⁺⁽⁶⁰ mM)を追加します。
   2. IgG制御:HBSS++172 μL、IgGコントロールビーズ1μL、高密度ビーズ1μL、Rh-血液1μL、染色Rh+血液懸濁液1μL、500 mM Gd³⁺の24 μLを加える。
   3. サンプルチューブは、HBSS++の172 μL、抗RhDコーティングビーズ1 μL、高密度ビーズ1 μL、Rh-血液1μL、染色されたRh(+)血液懸濁液の1 μL、500 mM Gd³⁺の24 μLを加えます。
      注: 高密度ビーズは、参照用に Rh サンプルに追加されます。

4. 細胞分離デモ用PMNの分離

1. 好中球の分離
   1. クエン酸ナトリウム/クエン酸6mL(0.15M、pH 5.5)と6%デキストラン-70の14 mLを含む60 mLシリンジに静脈血の40 mLを引き込む。
   2. 血液が沈み出るのを50分待ちます。
   3. フィコル・パケの20mLの上にバフィーコート細胞をゆっくりと重ね、血液採取チューブを通して50mLチューブに押し込み、沈積したRbCsによる汚染を避けます。元の採血管に残存するRBCによる汚染を最小限に抑えるために、新鮮な採血セットを使用することをお勧めします。
   4. ペレットは、3,000 x gで20分間遠心分離によってバフィーコート細胞をコーティングする。好中球および汚染されたRBCsは管の底にペレットをする。PBMCはフィコル・パクの上に白い層を形成します。
   5. 好中球を新しい50 mLチューブに移します。
   6. 20 mLの0.2%の冷たいNaCl溶液を25秒間インキュベートし、さらに20 mLの1.6%NaClを続けて、残留性RbCを溶解します。NaClの最後の協奏は0.9%(等張)でなければなりません。
   7. 3,000 x gで 10 分間のサスペンションを遠心分離します。
   8. 上清を取り除き、好中球を所望の濃度に再懸濁する。
2. リンパ球の分離
   1. 6ウェル培養プレートに5%の熱不活化血清を用いて、RPMIにPBMCをプレートします。
   2. 37°Cでプレートを1時間インキュベートします。 単球はプレートに付着し、リンパ球は自由に浮遊する。
   3. リンパ球を含む緩衝液を取り出し、RPMIで2回洗浄します。
   4. 所望の濃度でリンパ球を再中断する。
3. ラベルRBCs、PMN、リンパ球。
   1. 各細胞タイプに異なる蛍光色素を付けます。各色素が異なるチャネルで蛍光を発していることを確認します。選択した各色素に対して、製造元の指示に従います。

5. 補体活性化によるRBC細胞外小胞の生成

1. EDTAチューブを使用して静脈穿刺を通して全血を得る。
2. 白血球フィルターを通過し、次いで500 x g で3回遠心分離し、それぞれ10分間赤血球を単離する。HBSS++を洗浄バッファとして使用します。
3. 1.5 mLチューブに100 μLパックされたRBCのアリコートを作り、HBSS++を追加して体積を1 mLにします。
4. HBSS++で0.18 μg/mLの最終濃度にC5b,6を加え、次に渦を加えます。
5. 室温で15分間ゆっくりとしたシェーカーを着ます。
6. 0.2 μg/mLの最終濃度にC7タンパク質を加えます。チューブを数回やさしく反転して混ぜます。この時点から前方にボルテックスしないでください。
7. チューブを、室温で5分間低速にセットしたチューブシェーカーに置きます。
8. 0.2 μg/mL の最終濃度に C8 タンパク質を加え、0.45 μg/mL に C9 タンパク質を加えます。チューブを数回やさしく反転して混ぜます。
9. 37°Cで30分間インキュベートします。
10. チューブを10,000 x g で10分間遠心します。
11. EV含有上清を新しいチューブに集めます。上清を細胞ペレットに近づけすぎないようにしてください。

6. 磁気浮上装置上の細胞の解析

1. メーカーの指示に従って機器の起動を実行します。
2. チューブがいっぱいになるまで、サンプル50 μLをキャピラリーチューブに積み込みます。キャピラリーチューブの端部をキャピラリーシーラントで密封し、気泡がないことを確認します。
3. 上部磁石と底部磁石の間のホルダーにキャピラリーチューブを積み込みます。最適な表示のためにステージとフォーカスを調整します。
   注:セル/ビーズは、密度とGd³⁺の濃度に基づいて磁気平衡位置に到達するために5〜20分の任意の場所を取ることができます。Gd³⁺の濃度が高いほど、時間が短くなります。

Results

磁気浮上は、物体の密度、磁気シグネチャ、常磁性溶液の濃度、および2つの強い希土類磁石によって生み出される磁場の強さに応じて、異なる浮上高さで異なる密度の物体に焦点を当てます。2つの磁石が互いの上に置かれると、浮上サンプルは、ケーラーの照明を維持したまま、その側面に向けられた顕微鏡を使用することによってのみ見ることができる(図1)。各細胞型が到達した最終的な浮上高さは、常磁性溶液の濃度を変えることで簡単に修正できます。図2は、ガドリニウムの種々の濃度を用いて異なる循環血液細胞の分離を示す。密度が異なる 2 つのビード タイプ(1.05 および 1.2 g/mL)は、密度浮上高さとサイズ参照を提供するために使用されました。特定の細胞型の浮上高さは、その固有の密度に依存するので、磁気浮上は、重要な操作²⁴を伴わずに目的の細胞を単離する直接的な手段を提供する。このプロトコルの主な目的は、循環赤血球上の膜結合抗原(この場合はRh因子)の存在を検出する磁気浮上の能力を実証することであ...

Discussion

勾配遠心分離は、現在、そのユニークな密度に基づいて細胞下の成分を単離するための標準的な技術です。しかし、このアプローチでは、特殊な勾配媒体と遠心分離機装置を使用する必要があります。ここで提示される磁気浮上アプローチは、循環細胞の形態学的および機能的特性の詳細な調査を可能にし、細胞の操作を最小限に抑え、循環細胞への近く in vivo アクセスを提供する。

しかし、磁気浮上を使用する場合、いくつかの点は言及する価値があります。まず、イメージングに使用される顕微鏡は、セットアップに時間がかかるため、顕微鏡を部分的に分解し、磁石とキャピラリーチューブと正確に整列した光学系と完全に水平に配置する必要があります。第二に、毛細血管ガラスと焦点の動きを調整するために使用されるラボジャックと並進ステージは、3つの軸のそれぞれで正確な位置と自由な動きを必要とします。セットアップ全体の最も重要なアライメントは、トップとボトムの磁石が重力ベクトルと完全に水平になるように、移動段階で磁気浮上装置を取り付けることです。これらの要件からの逸脱は、磁力と重力の間に角度を作り出し、細胞を毛細管の...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸水和物	シグマアルドリッチ	M-2933	(MES)活性化バッファーの成分
、50x2.5x1mm磁石、ニッケル(Ni-Cu-Ni)メッキ、グレードN52、厚さ5mm(0.197インチ)で磁化	K&J Magnetics		の磁気浮上装置に使用する注文の磁石
毛細管の密封剤(Critoseal)	Leica Microsystems	267620	毛細管の端を覆うのに使用
遠心分離管フィルター(Corning Costar Spin-X)	シグマAldrich	CLS8163	ビーズを洗うのに使用
コンパクトラボジャック	Thorlabs	LJ750	磁気浮上装置の調整に使用
DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし	Gibco	14190-144	ビーズ懸濁液用溶液
エタノールアミン	Sigma Aldrich	E9508-100ML	ビーズの洗浄ステップ中に使用
蛍光原形質膜染色 (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	Rh+細胞の染色に使用
ガドテリドール注射	ProHance	NDC 0270-1111-03	ガドリニウム(Gd3+);細胞を懸濁するために使用される磁気溶液
HBSS++	Gibco	14025-092	サンプル調製用溶液
ヒトC5b,6複合体	補体技術株式会社	A122	RBC Evs
ヒトC7タンパク質	補体技術株式会社	A124	RBC Evs
ヒトC8タンパク質	補体技術株式会社	A125	RBCを生成するために使用されますEvs
Human C9 protein	Complement Technology, Inc	A126	RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	磁気浮上装置をラボジャックに固定するために使用
N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N′-エチルカルボジイミド塩酸塩	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); 抗体カップリング反応に使用
正常なウサギIgGコントロール	R&D Systems	AB-105-C	制御条件としてビーズのコーティングに使用
リン酸緩衝生理食塩水 (10X Solution, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	カップリング緩衝液の成分、洗浄ステップに使用
ポリソルベート 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	活性化緩衝液の成分
ポリスチレン カルボキシルポリマー	Bangs Laboratories	PC06004	抗体カップリングに使用されるトップ密度ビーズ(1.05 g/mL)
RhDポリクローナル抗体	Invitrogen	PA5-112694	赤血球中のRh因子のデクテクション用ビーズのコーティングに使用
研究用顕微鏡	オリンパス	プロビスAX-70	顕微鏡 磁気浮上装置の取り付けと浮上細胞の表示に使用
ゴム製減衰脚	Thorlabs	RDF1	ブレッドボードテーブルを支えるために使用
スクエアボロチューブ	VitroTubes	8100-050
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	抗体カップリング反応に使用
トランスレーショナルステージ	Thorlabs	PT1	キャピラリーチューブのフォーカシングとスキャンに使用