質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製

Summary

スフィンゴ脂質は、ヒトの疾患において十分に確立された役割を有する生理活性代謝物である。質量分析で組織の変化を特徴づけることで、疾患の病因における役割を明らかにしたり、治療標的を特定したりすることができます。しかし、バイオリポジトリでの凍結保存に使用されるOCT化合物は、質量分析を妨害します。OCTに包埋したヒト組織中のスフィンゴ脂質をLC-ESI-MS/MSで解析する方法を概説する。

Abstract

スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患において十分に確立された役割を有する細胞成分である。質量分析は、スフィンゴ脂質が疾患において変化しているかどうかを決定し、スフィンゴ脂質が臨床的に標的化できるかどうかを調べるために使用することができる。ただし、手術室から直接組織を取得する適切な検出力の前向き研究は、時間がかかり、技術的、ロジスティック的、および管理的に困難な場合があります。対照的に、後ろ向き研究は、組織バイオリポジトリですでに入手可能な、通常は大量に凍結保存されたヒト検体を利用することができます。バイオレポジトリーから組織を調達する他の利点には、組織学、病理学、および場合によっては臨床病理学的変数を含む組織標本に関連する情報へのアクセスが含まれ、これらはすべてリピドミクスデータとの相関を調べるために使用することができる。しかしながら、凍結保存および質量分析に使用される最適切断温度化合物(OCT)の非適合性に関連する技術的限界は、脂質の分析のための技術的障壁である。しかし、OCTは、スフィンゴ脂質含有量を変えることなく、洗浄と遠心分離のサイクルを通じて、ヒトバイオリポジトリ標本から簡単に除去できることを以前に示しました。また、OCTで凍結保存されたヒト組織中のスフィンゴ脂質は、最大16年間安定していることを以前に確立しました。本報告では、OCTに埋め込まれたヒト組織検体中のスフィンゴ脂質分析の手順とワークフローについて、組織の洗浄、データ正規化のための組織の計量、脂質の抽出、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)による分析用サンプルの調製、質量分析データ統合、データ正規化、データ解析などについて概説する。

Introduction

スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患における役割で知られている生理活性代謝物です^1,2。それらは、細胞移動、細胞の生存と死、細胞の動き、小胞輸送、細胞の浸潤と転移、血管新生、サイトカインの産生などの複雑な細胞プロセスを調節します1,2,3,4,5,6,7,8,9 .スフィンゴ脂質代謝の調節における欠陥は、癌の開始および進行に寄与し、癌がどれほど攻撃的であるか、および癌がどのように反応し、治療に対する耐性を発達させるかを決定する^3,10。したがって、疾患の病因に対するこれらの広範な影響のために、疾患特異的スフィンゴ脂質の変化を正確に確立できる分析方法は重要なツールです。質量分析(MS)は、スフィンゴ脂質の変化を分析するための最も正確で信頼性の高い方法です。

スフィンゴ脂質の変化の分析に使用できるヒト検体は、手術室から前向きに、または組織バイオリポジトリから遡及的に取得できます。手術からの新鮮な組織は、MSまたは他の分析方法によって直接分析することができるので有利である。ただし、組織を前向きに取得するには、管理上、技術上、およびロジスティック上のハードルがあり、統計的検出力に到達するのに十分な標本を収集することは困難な場合があります。バイオレポジトリーから組織を取得することは、遡及的に大量に取得でき、バイオリポジトリは組織学と病理を確認し、標準的な操作手順を使用して組織を極低温で保存し、相関分析に使用できる臨床病理学的データを提供できるため、有利です。しかし、分子的および構造的特徴を維持するために、バイオリポジトリは組織を最適切断温度(OCT)化合物に埋め込むことによって凍結保存することができ、これはデータ正規化アッセイおよび液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)によるスフィンゴ脂質の定量を妨げることを示しました¹¹。.また、OCT化合物の主成分であるポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが、他のMS分析プラットフォームにおいてイオン抑制をもたらすことも示されている12、^13、14、15。したがって、OCT化合物は、MSによるスフィンゴリピドミック分析の前に組織から除去する必要があります。

以前のレポートでは、LC-ESI-MS/MS分析のためのヒト検体からのOCT化合物の除去プロトコル¹¹ と、データ正規化のための組織の計量に使用される方法論¹¹を検証しました。ここでは、スフィンゴリピドミックOCT化合物除去プロトコル(sOCTrP)の手順を詳述し、ヒト肺腺癌腫瘍および正常な隣接非関与組織からの代表的なデータを示します。

Protocol

匿名化されたヒト肺組織は、内部レビュー委員会(IRB)が承認したプロトコル(#HM2471)に基づいて、バージニアコモンウェルス大学(VCU)の組織およびデータ収集および分析コアから取得されました。マウス組織の研究および収穫のためのマウスの使用は、VCU施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認された。

1.材料の準備

注意: これらの手順は、ティッシュ洗浄の前日に実行する必要があります。

1. 1.5 mLのポリプロピレン製遠心チューブに、翌日処理される各サンプルの簡潔で明確な識別コードを付けて事前にラベルを付け、計量します。繰り返しチューブを取り扱っても色あせしない耐薬品性のある永久マーカー( 材料の表を参照)を使用してください。
2. 電子スプレッドシートを開き、連続する列に次の列ヘッダーを付けます:チューブ識別子(ID)、チューブのみ、組織付きチューブ、および全組織。処理されるチューブ識別子を [チューブ ID] というラベルの付いた列に入力します。
3. 分析スケールを事前に校正し、ゼロにします。清潔な10mL三角フラスコをバランスプレートの中央に置きます(フラスコはチューブホルダーとして機能します)。計量室のドアを閉め、フラスコで体重計を風袋引きします。
4. 1.5 mLの遠沈管の重量を量ります。チューブをフラスコに慎重に置き、計量チャンバーのドアを閉じます。重量を安定させ、カラムラベル付きチューブのみに重量を記録します。
   注意: チューブの重量を量るときは、10mLの三角フラスコを動かさないでください。フラスコを動かした場合は、フラスコを中央に戻し、天びんを風袋引きします。閉じたチューブをラックに入れ、必要になるまで保管します。
5. 13 x 100 mmスクリュートップガラス管とキャップに識別コードを事前にラベル付けし、2 mLのLC-MSグレードメタノールを充填します。それらをチューブラックに入れ、チューブに蓋をして、使用するまで冷蔵庫(4°C)に保管します。
   注意: ボトルトップ溶剤ディスペンサーを使用してください( 材料の表を参照)。利用できない場合は、有機溶剤を分注するときにプラスチックを使用しないようにガラスピペットを使用してください。
6. ラベル付け済みの13 x 100 mmガラス試験管。試験管を覆い、室温で保管します。
7. オートインジェクターバイアルにIDコードを付けて事前にラベル付けします。オートインジェクターバイアルを覆い、使用するまで室温で保管します。
8. 組織乾燥芯を準備します。
   1. まず、外科用はさみをLC-MSグレードのメタノールに5分間浸して洗浄し、次に清潔な実験室グレードの組織で拭きます。
   2. パウダーフリーの手袋を使用して、細かく先細りの30〜40 mmの芯が形成されるまで、実験室グレードの組織( 材料の表を参照)の端を回転させます。
   3. メタノールで洗浄したはさみを使用して、太い端の芯を切ります。芯をきれいな段ボール箱に入れます。すべてのサンプルを処理するために必要な芯の数を2倍にします。
9. 短縮した1 mLピペットチップを準備します。メタノール洗浄した外科用ハサミを使用して、1 mLピペットチップの先端から4〜5 mmを切り取り、チップホルダーに戻します。処理するサンプルの2倍のチップを準備します。
   注:これらは、チューブから洗浄された組織の回収に使用されます。先端の端には触れないでください。
10. 分子生物学グレードのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を4°Cにプレチルします(0.5 Lで十分です)。これは標本を回収するために使用されます。処理する各サンプルについて、60 mLの超高純度脱イオン水をプレチル(4°C)します。
11. 質量分析の内部標準を準備します。以下の脂質をエタノール:メタノール:水(7:2:1;v / v / v)に25 nmol / mLの濃度で溶解します:d17:1-スフィンゴシン、(2S,3R,4E)-2-アミノヘプタデカ-4-エン-1,3-ジオール;D17:1-スフィンゴシン-1-リン酸、ヘプタデカスフィン-4-エニン-1-リン酸;C12-セラミド (d18:1/C12:0), N-(ドデカノイル)-スフィン-4-エニン;C12-スフィンゴミエリン(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-スフィン-4-エニン-1-ホスホコリン;C12-グルコシルセラミド(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-1-β-グルコシル-スフィン-4-エイネ;C12-ラクトシルセラミド(d18:1 / C12:0)、N-(ドデカノイル)-1-β-ラクトシル-スフィン-4-エン。

2.ティッシュ洗浄

注:セクション1のすべてのステップを1日前に完了すると、熟練した研究者は1日あたり最大40サンプル、初心者は1日あたり~10〜15サンプルを処理できます。早朝から始めて、セクション2.1〜3.8のすべてのステップが完了するまで停止しないでください。

1. 組織が処理される日に、ボルテクサー、完全に充電された血清学的ピペッター、および製氷皿を装備して、バイオセーフティキャビネットの作業エリアを準備します。このセクションのすべての手順で、白衣、二重層の手袋、保護眼鏡など、適切なPPEを着用してください。注意: 人間の組織や体液は、バイオハザード物質と見なし、扱う必要があります。
2. スイングバケット遠心分離機、15 mL 円錐形遠心分離管を保持するために必要なアダプター、および遠心分離機の生物学的封じ込め蓋をプレチル(4°C)します。1.5 mLの遠沈管を保持できる固定角度遠心分離機をプレチル(4°C)します。
3. 組織が15 mLポリプロピレン遠心チューブに分注されていない場合は、メタノールで洗浄したスパチュラ(新しい組織サンプルごとに洗浄)を使用して、事前にラベル付けされた15 mLポリプロピレンチューブに移します。15 mLキャップにもラベルを付けます。
   1. 15 mLの遠心チューブを保持できるチューブラックを製氷皿に入れ、トレイに氷を入れます。その日に処理されるティッシュを氷上のラックに入れて解凍します。
      注:組織の洗浄と計量のプロトコルがこれらの重量で正確で信頼できることが以前に示されているため、処理のためにバイオリポジトリから最低3〜4 mgの組織を要求する必要があります¹¹。
4. サンプルの入った製氷皿をバイオセーフティキャビネットに移動します。
5. 以下で説明するように、sOCTrPサイクル¹¹ を3回実行します(つまり、手順2.5.1〜2.5.5を3回実行します)。
   1. 氷冷した超高純度脱イオン水10mLを各チューブに加え、しっかりと蓋をします。チューブを10分間インキュベートします。
   2. 各チューブを10〜20秒間、またはチューブの壁に堆積したすべての組織または組織ペレットが完全に再懸濁されるまで、激しくボルテックスします。
      注:sOCTrPサイクル2〜3では、ペレット内のOCTが洗浄液に希釈されるように、ペレットを再懸濁することが重要です。
   3. チューブを事前に冷却された(4°C)スイングバケット遠心分離機に移します。サンプルを4,000-5,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
      注意: 遠心分離機キャリアを生物学的封じ込め蓋で密封することにより、遠心分離中に発生するバイオハザードエアロゾルの生成と曝露を回避します(材料の表を参照)。
   4. 遠心分離機からサンプルを取り出し、製氷皿に移します。トレイをバイオセーフティキャビネットに入れ、チューブのキャップを外します。キャップを保存します。
   5. 洗浄液を慎重に吸引します。チューブ内に~0.5 mLの上清を残して、ペレット内の組織材料を吸引しないでください。チューブにキャップをし、ラベルの付いたキャップとチューブを一致させることで相互汚染を回避します。
      注意: ステップ2.5.5の洗浄液(上清)はバイオハザード物質です。人間由来の標本に適したバイオセーフティガイドラインに従って取り扱い、廃棄してください。

3.組織計量(データ正規化用)

1. 最後のsOCTrP洗浄サイクルの後、洗浄液の大部分を注意深く吸引しますが、ペレットを乱さないようにしてください。チューブに~0.5 mLの洗浄液を残します。
2. 短縮したピペットチップ(ステップ1.9で調製)を使用して、500 μLの氷冷PBSを採取し、チューブに加えます。
   1. 同じチップを使用して、ペレットを静かに再懸濁し、すべての組織を取り出します。チューブとピペットの先端壁への付着による組織の損失を減らすために、乱流ピペッティングを避けてください。
3. 再懸濁した組織を、対応する事前にラベル付けされ、事前に計量された1.5 mL遠心チューブに追加し、チューブを氷上に置きます。データセット内のすべての組織に対して繰り返します。
4. 1.5 mLチューブを事前に冷却した遠心分離機に入れ、組織を7,000 x g で5〜7分間、4°Cでペレット化します。
   1. チューブを回収し、ペレットを乱すことなくできるだけ多くのPBSを注意深く吸引します。チューブを氷の上に戻します。
5. 遠心分離管を7,000 x gでさらに3分間使用して、組織が適切にペレット化されていることを確認します。チューブを氷に移します。
   注意: 追加の遠心分離ステップは、すべての洗浄液と吸湿発散液を除去する際の組織の損失を防ぐために重要です。5つ以上のサンプルを処理する場合、5つのサンプルが処理されるごとに3分間、7,000 x g の遠心分離ステップを繰り返して、組織がペレットのままであることを確認する。
6. 手順1.8で準備した芯を使用して、残っている洗浄液をそっと取り除きます。サンプルごとにきれいな芯を使用してください。芯でティッシュを軽くたたくことは許容されます、それは洗浄液の大部分を取り除くのを助けますが、芯への付着によって組織を失うことを避けます。チューブを閉じて氷の上に置きます。
7. 最近校正、風袋引き、ゼロにした分析天びんの各チューブの重量を量ります。
   1. 各チューブをガラス製の三角フラスコに入れ、チャンバーのドアを閉じます。体重が安定したら、ティッシュ付きのチューブというラベルの付いた電子スプレッドシートの列に記録します。
   2. 計量後、チューブを氷上に戻します。
8. 300 μLの氷冷PBSを加えます。短くしたピペットチップ(ステップ1.9)を使用して、すべての組織を注意深く取り出し、2 mLの氷冷LC-MSグレードのメタノールを含む事前にラベル付けされたスクリュートップガラスチューブ(ステップ1.5で調製)に堆積させます(組織をチューブの側面ではなくメタノールに追加します)。
9. チューブからチューブだけを差し引いて洗浄した組織の量を計算します。この数を全組織列に記録します。総組織値は、ステップ6.12で質量分析データを正規化するために使用されます。
10. 手順4.1〜4.15を実行する準備ができるまで、サンプルを-80°Cで保管します。
    注:これは良い停止点であり、サンプルは-80°Cで数週間安全に保管できます。 タンパク質濃度や脂質リン酸含量などの他の組織正常化方法については、Rohrbach et ^al.11を参照してください。

4.脂質抽出

注:特に多くのサンプルが処理される朝にこれらの手順を開始することが重要です。開始する前に、水浴またはインキュベーターを48°Cに予熱します。

1. ステップ3.8で調製したサンプルとMS脂質標準物質(ステップ1.11で調製)を冷凍庫から取り出します。室温に20分間平衡化させます。
2. 内部標準液を超音波水浴( 材料の表を参照)に2〜3分間、またはMS脂質標準が完全に溶解するまで渦巻き、浸してからサンプルに分注します。これにより、データの正規化のエラーを回避できます。
3. 繰り返しピペットを使用して、250 pmol(ステップ1.11で調製した25 nmol/mL溶液から10 μL)の内部質量分析標準物質を各チューブに加えます。チューブを軽くキャップし直します。
4. 均質化を容易にするために、メタノール容量を2mLに調整します。LC-MS/MSグレードのメタノールのみを使用してください。
5. 一度に1本のチューブを作業し、ホモジナイザーを使用して、塊が見えなくなるまで組織を粉砕します(通常は5〜20秒)。ホモジナイザーの先端を円を描くように動かし、チューブの壁をそっと押して粉砕を支援します。チューブをキャップし直します。
   注:すべての組織が細かく粉砕されていることを確認すると、脂質抽出が最大になります。使い捨てホモジナイザーの先端はクロロホルムを含む溶液に溶解するプラスチックでできているため、均質化前にサンプルにクロロホルムを追加しないでください。
6. チューブを超音波水浴に45°の角度で5〜10秒間浸します。
   1. 超音波浴に浸しても組織の塊が形成されない場合は、キャップをして次のチューブに進みます。
   2. チューブを超音波浴に浸したときに組織の塊が形成された場合は、再均質化し、塊を標的にします。
   3. このプロセス(均質化/超音波浴への浸漬)を、すべての大きな組織塊が破壊されるまで繰り返し繰り返します。
7. ヒュームフードで、LC-MSグレードのクロロホルムとメタノールを各チューブに追加し(ボトルトップディスペンサーを使用)、メタノール:クロロホルム:水の比率を2:1:0.1にします。清潔なキャップを使用して、チューブをしっかりと密封し、一日の終わりまでベンチトップに置いておきます。
   1. 重量が50 mg以下の組織の場合、総抽出量4 mLを使用し、より大きな標本の場合はこの比率(50 mg:4 mL抽出溶液)を使用して調整します。
8. その夜出発する前に、しっかりと蓋をしたチューブを48°Cの水浴またはインキュベーターに入れ、一晩インキュベートします。
   注意: 蒸発によって溶媒比が変化しないように、チューブにしっかりと蓋をすることが重要です。
9. 翌朝、48°Cの水浴からサンプルを取り出し、4,000-5,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、溶媒不溶性の破片をペレット化します。
10. ヒュームフード内で作業し、上清を事前にラベル付けされた13 x 100 mmホウケイ酸ガラス試験管に慎重にデカントします。デカンテーションを容易にするために、13 x 100 mmのチューブを30〜45°の角度で傾けます。
    注意: 12を超えるサンプルを処理する場合は、ステップ4.10を実行するとペレットが柔らかくなり、不溶性の破片が移動するため、遠心分離チューブを長時間放置しないでください。これを回避するには、一度に12本のチューブを遠心分離機から取り出し、デカントする準備ができるまで他のチューブを遠心分離し続けます。
11. チューブを13 x 100 mmのチューブを保持できる真空濃縮器に移します。最初の1時間の加熱ステップ(40°C)ですべての溶媒を蒸発させ、最大真空下で実行します。
12. 真空濃縮器からチューブを取り外し、各チューブに500 μLのLC-MSグレードのメタノール(ボトルトップディスペンサーを使用)を追加します。
13. 乾燥した脂質抽出物を5〜10秒間ボルテックスして再懸濁し、チューブを回転させながら超音波水浴に45°の角度で2分間浸します。5秒間再ボルテックスし、超音波水浴にさらに1分間浸します。
    注:これは、抽出された脂質の最大回収を確実にするための重要なステップです。チューブの壁にある乾燥した材料がすべて再懸濁されるまで、先に進まないでください。
14. 13 x 100 mmチューブをプレチルド(4°C)遠心分離機に入れ、4,000-5,000 x g で4°Cで20〜30分間遠心分離して不溶性の破片を取り除きます。
15. 清澄化した上清を、事前にラベル付けされたオートインジェクターバイアルに慎重にデカントします。オートインジェクターバイアルを30〜45°の角度で傾けると、デカンテーションが容易になります。13 x 100 mmチューブの内容物全体がオートローダーバイアルにデカントされていることを確認します。
16. チューブにしっかりと蓋をし、LC-ESI-MS/MSで分析するまで-80°Cで保管してください。

5. LC-ESI-MS/MS 分析

注意: 次の手順では、トリプル四重極モードで動作するオートインジェクター、デガッサー、およびLC-MS / MSシステムに結合されたバイナリポンプシステムを使用します。カラム温度はカラムオーブンを用いて維持した。使用する機器の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 移動相A1(CH₃OH:H₂O:HCOOH、58:41:1、v:v:v、5 mMギ酸アンモニウムを含む)および移動相B1(CH₃OH:HCOOH、99:1、v:v、5 mMギ酸アンモニウム)を準備します。LC-MSグレードの溶媒、水、試薬のみを使用してください。
2. サンプルセットごとに、500 μLのLC-MSグレードのメタノールを含む4つのブランクオートローダーバイアルを準備します。
3. サンプルのセットごとに、ステップ1.11で調製した内部標準液10 μL(各標準物質の合計250 pmol)を500 μLのLC-MSグレードメタノールで希釈することにより、2つの内部標準(ISとしてラベル付け)オートローダーバイアルを準備します。
4. カラムオーブン温度を60°C、イオン源温度を500°Cに設定します。
5. MS/MS分析には、分光器のトリプル四重極モードを利用します。最初の四重極(Q1)をプリカーサーイオンを通過するように設定し、3番目の四重極(Q3)を分子的に特徴的なプロダクトイオンを通過させる(またはQ1またはQ3の複数のm/zにわたるスキャン)ように設定し、N2を使用してQ1から30〜120 eVオフセットされた四重極2(Q2)の解離を衝突誘導します。
6. 多重反応モニタリングペア(MRM)検出ウィンドウを120秒に設定し、ターゲットスキャン時間を1.0秒に設定します。MRMペア、イオン化エネルギー、および衝突エネルギーのリストについては、 表1 を参照してください。
7. LCステップでスフィンゴ脂質を分離するには、次のパラメータを使用します:0.7 mL/minの流速を使用して、95%移動相A1と5%移動相B1の溶媒混合物で2.1(i.d)x 50 mm C18逆相カラムを0.5分間平衡化します。
   1. サンプル注入後、移動相A1/B1比を95/5で2.25分間維持し、続いて1.5分間にわたって100%B1への線形勾配を維持し、その後100%B1で5.5分間保持した後、0.5分間グラジエントして95/5 A1/B1に戻します。
   2. 実行後、95/5 A1/B1の混合物でカラムを0.5分間再平衡化します。
8. サンプルオートローダーには次の設定を使用します:すすぎ量、500 μL;針ストローク、52 mm(これは各バイアルのバイアルのサイズと容量に応じて調整する必要があります);すすぎ速度、35μL/秒;サンプリング速度、5.0 μL/秒;すすぎ浸漬時間、2秒;吸引前後のすすぎモード。すすぎ時間、2秒。
9. 手順 4.15 で準備したサンプルを次の順序でオートローダ トレイに置きます。です;空砲;ステップ4.15で調製したサンプル;空白、IS、空白。
10. LC-ESI-MS/MS で各サンプルの 5-10 μL を分析し、データセット内のすべてのサンプルについて同じ量を分析します。

6. データ処理、統合、正規化

注:次の手順では、特定のソフトウェア( 材料表を参照)の手順の概要を説明しますが、同等のLC-MS機器およびソフトウェアで同様の手順を使用して、分析された脂質クラスおよび対応する内部標準のMRMペアを統合することができます。

1. 定量ソフトウェアを開きます。 [ 定量]タブで、 定量ウィザードをダブルクリックします。ポップアップウィンドウの左端のワークスペースで、正しいデータセットに移動して左クリックします。使用可能なサンプルは、中央のワークスペースに表示されます。
2. 分析するサンプルを強調表示し、右側の矢印をクリックして、選択したサンプルワークスペースに サンプル を追加します。[ 次へ ]をクリックして、デフォルト設定が通常使用される設定およびクエリ画面に移動します。
3. [ 次へ ]をクリックして、統合方法の選択画面に移動します。分析する脂質のMRM遷移ペアを含む適切な統合方法を選択します。MRM 遷移ペアについては 、表 1 を参照してください。ヒット 終了.
   注意: 保持時間は計装と個々の設定によって異なるため、個々のセットアップごとに確認する必要があります。
4. ナビゲーション バーで、[ ピーク レビュー ] ウィンドウをクリックして、MRM ペアを検査できるようにします。レビューを容易にするには、[ ピーク レビュー ] ウィンドウを右クリックし、[ 自動ズーム] を 最大ピークの 100% に変更し、 ズーム ウィンドウ を 1.00 分から 2.00 分に変更します。
5. 定量表示ウィンドウを右クリックし、分析種と検査するスフィンゴ脂質を選択します。ブランクサンプルにピークがないこと、およびISサンプルに正しいピークが積分されていることを確認します。
6. 未知のサンプルの統合を開始します。一度に1つのスフィンゴ脂質クラスを作業し、内部標準のMRMペアの保持時間を調べます(つまり、C12:0セラミド)を選択し、ソフトウェアが正しいピークを統合していることを確認します。
7. 同じ脂質クラスの分析種(すなわち、C14:0セラミド、C16:0-セラミドなど)、クラスで最も短い鎖長脂質から始めます。各鎖長脂質について、ソフトウェアルーチンが正しいMRMペアピークを内蔵していることを確認します。
8. すべての分析対象物が統合されたら、分析対象のスフィンゴ脂質種(セラミド、スフィンゴミエリンなど)ごとに電子スプレッドシートを作成します。LC-MS/MS定量ソフトウェアで分析対象物の順序と鎖長に一致するように列ヘッダーにラベルを付けます。また、手順 3.9 で決定したサンプル ID とサンプル正規化の重みの列ヘッダーも含めます。
   注:前述の^ように11、他の一般的な正規化尺度には、総リン酸脂質含量またはタンパク質量が含まれる。
9. すべての分析種と内部標準のピーク領域を電子スプレッドシートにエクスポートまたはコピーします。
10. 特定のスフィンゴ脂質クラスの各鎖長種の積分ピーク面積を、対応する内部標準のピーク面積で割ることにより、データを正規化します。たとえば、C14:0セラミド、C16:0セラミド、C18:1セラミドなどは、それぞれC12:0で分割する必要がありますセラミド内部標準ピーク面積。
11. ピーク面積を、正規化されたピーク面積(ステップ6.10で計算)に、ステップ4.3でサンプルに添加した内部標準物質(ピコモール)の量を乗じることによって回収された脂質のモルに変換します。このプロトコルでは、この量は250pmolです。
12. 各サンプル中の脂質の相対量を取得するには、各脂質鎖長のピコモルをステップ3.9で決定された組織重量で割ります。これにより、組織1mgあたりの脂質のピコモルの単位が得られます。

Results

このプロトコルでは、凍結保存されたヒト組織からOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSによる分析のために組織を計量する方法について詳しく説明します。この手順に必要な材料は、材料表にリストされています。図1に示すのは、10個のヒト肺腺癌腫瘍と10個の正常隣接組織を洗浄してOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSで分析した典型的な実験の結果です。 重要なことに、¹¹を以前に示したように、肺腺癌腫瘍では、正常な隣接非関与組織と比較して有意に上昇しているセラミド(図1A)およびモノヘキソシルセラミド(図1B)にはさまざまな鎖長種があります。

セクション4で概説した脂質抽出ステップに対するOCTの効果を評価するための対照実験では、200 mgのマウス肝臓(C57BL6;男性;14〜16週齢)を2 mLのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、...

Discussion

OCTは、バイオリポジトリで使用される一般的な長期凍結保存剤です。しかしながら、OCTは、組織が様々な質量分析プラットフォーム^12、13、14、¹⁵によって分析されるときにイオン抑制をもたらし^、またはサンプルがLC-ESI-MS/^{MS 11}によって分析されるときにシグナルの損失をもたらし得る。凍結保存された組織中のOCTは、ブラッドフォードやBCA¹¹などの計量やタンパク質定量アッセイなどの組織正常化方法にも干渉する可能性があります。ここでは、ヒト組織からOCTを除去し、その後質量分析によって分析するための詳細なプロトコルを提示します。プロトコルは、肺ではない他の組織源を使用するように、または我々が以前に説明したようにマウス組織からのものを使用するように改変され得る

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mLポリプロピレンピペットチップ	NA	NA	検体回収に使用
1.5 mLポリプロピレン遠心チューブ	NA	NA
10 mL 三角フラスコ	VWR	89091-116	チューブと組織の計量に使用
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	MSデータを分析および統合するソフトウェア
ギ酸アンモニウム	フィッシャーScientific	A11550	LC移動相用
分析スケール	NA	0.1mgの精度を持つ	NA
ボトルトップディスペンサー	ザルトリウス	LH-723071	溶媒の分注に使用
C12-セラミド(d18:1/C12:0);N-(ドデカノイル)-スフィング-4-enine	アバンティ極性脂質	LM2212	内部標準
C12-グルコシルセラミド(d18:1/12:0);N-(ドデカノイル)-1-&β;-グルコシルスフィング-4-eine	Avanti極性脂質	LM2511	内部標準
C12-ラクトシルセラミド(d18:1/12:0);N-(ドデカノイル)-1-ß-ラクトシルスフィング-4-エン	アバンティ極性脂質	LM2512	内部標準
C12-スフィンゴミエリン (d18:1/C12:0), N-(ドデカノイル)-スフィング-4-エニン-1-ホスホコリン	Avanti Polar Lipids	LM2312	内部標準
クロロホルム OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal バイオコンテインメント 蓋	Thermo Scientific	75007309	遠心分離中のバイオハザードエアレゾールを防止するため
Conflikt	Decon Labs	4101	除染剤
CTO-20A / 20ACカラムオーブン	島津		NALC
d17:1-スフィンゴシン; (2S,3R,4E)-2-アミノヘプタデク-4-エン-1,3-ジオール	アバンティ極性脂質	LM2000	内部標準
d17:1-スフィンゴシン-1-リン酸; ヘプタデカスフィング-4-エニン-1-リン酸	アバンティ極性脂質	LM2144	内部標準
DGU20A5R脱気装置	島津	製作所NA
ディスポーザブル培養チューブ 13x100mm	VWR	53283-800	13x100 mm スクリュートップチューブ
温水浴	NA	NA	一晩の脂質抽出用
ホモジナイザー 150	フィッシャーサイエンティフィック	15-340-167	トリーツ組織
ホモジナイザー プラスチック使い捨て発電機 プローブ	フィッシャーサイエンティフィ	15-340-177	均質化用
キムワイプ キム	テック	34120	芯を作るために使用される実験室グレードの組織
メタノール LC-MS グレード 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 ADバイナリポンプシステム	島津	NA	LC-MS用
マーカーVWR	52877-310
フェノールねじ閉鎖、キンブルチェイス(使い捨て培養チューブ用キャップ)	VWR	89001-502	13x100 mmスクリュートップチューブキャップ
酸塩バフ加工生理食塩水	Thermo Scientific	10010023	洗浄後にチューブから検体を回収するには
リピーターピペット	エッペンドルフ	4987000118	LC-MSの内部標準液を分注するには
スクリューキャップ、青、赤 PTFE/白 シリコーン	VWR	89239-020	オートインジェクターバイアル
IDパッチ付きスクリュースレッドガラスバイアル	VWR	46610-724	オートインジェクターバイアル
SIL-30ACオートインジェクター	島津	製作所 NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	乾燥溶媒用
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 カラム	Sigma Aldrich	581300-U	LC-MS
用 トリプルクワッド 5500+ LC-MS/MS System	Sciex	NA	LC-ESI-MS/MS用
超音波ウォーターバス	ブランソン	モデル2800	および乾燥脂質の均質化と再懸濁用
ボルテク	サーNA	NA	sOCTrPおよび乾燥脂質の再懸濁用
VWR培養チューブ 使い捨てホウケイ酸ガラス	VWR	47729572	13x100 ガラス培養チューブ
水 Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400