蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

Summary

ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。

Abstract

タンパク質凝集は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)などの神経変性疾患の特徴である。可溶性または拡散性タンパク質オリゴマーまたは凝集体を検出および分析するために、単一分子感度で単一粒子の拡散速度および明るさを検出できる蛍光相関分光法(FCS)が使用されている。しかし、タンパク質凝集検出のための適切な手順とノウハウは広く共有されていません。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞における凝集しやすいタンパク質の拡散特性に関するFCS測定の標準的な手順を示す:ALS関連25 kDaカルボキシル末端断片のTAR DNA/RNA結合タンパク質43kDa(TDP25)およびスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)を示す。代表的な結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きTDP25の凝集物の一部が、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞溶解物の可溶性画分にわずかに含まれていたことを示している。さらに、ALS関連変異を運ぶGFPタグ付きSOD1は、生細胞における拡散が遅い。そこで、FCSを用いた拡散特性を介してタンパク質凝集を検出する手順を紹介します。

Introduction

筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含むタンパク質凝^集は毒性 が知られており、細胞や臓器のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)を乱し、その後老化につながる可能性がある^。タンパク質凝集のクリアランスは、治療戦略として期待されています;しかし、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質凝集体(例えば、小分子や薬物)を分解する化学物質はまだ確立されていません。さらに、タンパク質凝集が毒性を発揮する方法は、依然として不可解です。したがって、タンパク質凝集に関する研究プロジェクトを推進するためには、単にタンパク質凝集を検出する高スループット手順を導入することが重要です。タンパク質凝集および凝集特異的蛍光色素の立体構造を認識する抗体を用いたタンパク質凝集検出は広く用いられている^3。しかし、このような古典的な手順を用いた生細胞において特に、凝集を検出することは困難である。

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質凝集および構造変化を検出する手順である。しかし、FRETはタンパク質のダイナミクス(例えば、生細胞におけるタンパク質の拡散およびオリゴマー化)を分析することができない^3。そこで、ここでは、単一分子感度⁴で蛍光分子の拡散特性と明るさを測定する蛍光相関分光法(FCS)を用いて、溶液中のタンパク質凝集(例えば、細胞溶解物)および生細胞を検出する簡単なプロトコルを紹介する。FCSは、レーザースキャン共焦点顕微鏡(LSM)を用いた光子計法である。高感度光子検出器と光子到着時間の自己相関関数(ACF)の計算を用いて、検出体積中の蛍光分子の通過時間と明るさが測定される。拡散は分子量の増加と共に遅くなる。従って、FCSを用いて分子間相互作用を推定することができる。さらに強力に、蛍光分子の明るさの増加は、分子のホモオリゴマー化を示す。したがって、FCSは、このようなタンパク質凝集を検出するための強力なツールである。

Protocol

1. 材料・試薬

1. 細胞培養用の発熱性フリー溶液および培地を使用する(表1)。
2. 超純水を用いた生化学実験用のソリューションを準備し、DNase/RNaseフリーとして使用します。
3. ロットチェックプロセスで細胞培養に適したFBSを選択します。選択した FBS ロットは定期的に変更されるため、FBS のカタログとロット番号はここでは表すことができません。
4. プラスミドDNA
   1. eGFP モノマー発現用の pmeGFP-N1⁵を準備します。GFP-TDP25 表現のための pmeGFP-C1-TDP25^6;SOD1-G85R-GFP 発現のための pmeGFP-N1-SOD1-G85R^7;キャリアとしてpCAGGS^8。
      注:meGFPは、強化されたGFP(eGFP)のA206K突然変異を運ぶ単量体変異体です。TDP25は、TDP-43のALS関連C末端フラグメントである。SOD1-G85Rは、SOD1のALS関連変異体である。
5. 細胞株
   1. マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞を使用してください。
      注意:Neuro2a細胞はトランスフェクション効率が高く、外因性タンパク質を高発現しています。TDP25発現の場合、Neuro2aやHEK293細胞などの高い発現効率を有する細胞株が必要である。HeLa細胞では、TDP25は効率的に発現できなかった。

2. 細胞培養とトランスフェクション

1. Neuro2a細胞を通常の成長培地で半流暢に成長させる100mmプラスチック皿を準備する。
   注:半合流に達するまで、前の播種後約48〜72時間、37°Cでインキュベートする必要があります。
2. メディアを取り外します。
3. 0.5 mLのトリプシン-EDTA溶液を細胞培養皿に加え、37°Cで1分間インキュベートします。
4. 通常の成長培地を9.5mLを皿に加え、剥離した細胞を一時停止します。
5. Trypan blueを使用して死んだセルを染色し、セルカウンターを使用するか手動でセル数をカウントします。次いで、培養培地中の細胞を希釈する(1.0×10 5/mL)。
6. 細胞のリシスのための35のmmのプラスチック皿またはライブ細胞測定のためのガラスベース皿に細胞懸濁液の2 mLを加える。
7. 37°Cで1日インキュベートします。
8. トランスフェクションの1日の15分前に、次の準備を開始します。
9. 2つの1.5 mLチューブを準備し、各チューブにオプティ-MEM Iの100 μLを追加します。
10. 最初のチューブに、プラスミドDNA(溶液A)を1.0μg混合します。第2の管に、リポフェクトアミン2000(溶液B)の2.5 μLを混合する。
    注:トランスフェクション効率を維持するために、DNAの総量は同じに保ちます。生細胞におけるFCS測定の発現量を減らすには、タンパク質発現に対するプラスミドDNAの割合が減少するはずです(例えば、pmeGFP-N1-SOD1-G85Rの0.2 μgおよびpCAGGS混合物の0.8 μg)。さらに、リポフェクトアミン2000の体積とプラスミドDNAの量との比率を同じに保つ。
11. 溶液AとBをいずれかのチューブに加えて穏やかに混合し、室温(溶液C)で1分間インキュベートします。
12. ソリューション C を培地に追加します。37°Cで24時間培養した。

3. 細胞のリシスと中程度の交換

1. 日常的な顕微鏡を使用してGFP表現を確認します。
2. 皿の中の媒体を取り除きます。
3. 25°Cで2mLのPBSを加え、培地を洗い流します。PBS を取り出します。
4. 砕いた氷の上にアルミニウム板の上に皿を置きます。
   注:私たちは、日曜日のツールストアまたは市販の1つの実験室機器としてカット1ミリメートル厚いアルミニウム板を使用しています。
5. 4°Cで200μLのリシスバッファーを加えます。 皿の底にバッファーが均等に分配されるように、皿を穏やかに振ります。
6. セルスクレーパーを使用して皿を削り、新しい1.5 mLチューブに未溶解細胞の破片で溶解物を回収します。
7. 4°Cで5分間20,400 x g で溶液を遠心分離する。
8. 新しい1.5 mLチューブに上清を回収し、4°Cまたは氷上に保管してください。
   注:ライセートを凍結しないでください。
9. ライブセル測定の場合は、測定前に培地を交換してください。位相コントラスト顕微鏡を使用して細胞の取り付けを確認します。蛍光顕微鏡で発現を確認します。

4. 蛍光相関分光法(FCS)キャリブレーション

1. システムを起動し、操作ソフトウェアを実行します。アルゴン⁺ レーザー(458/477/488/514 nm)をオンにします。少なくとも30分間システムを安定させます。
2. 光路を設定する:メインビームスプリッター:HFT488;ディクロイックミラー:NFT600;蛍光バリアフィルター:バンドパスフィルタ505-540(BP505-540);検出器:雪崩フォトダイオード(APD)。
3. 値を直接入力してピンホールサイズを設定します(66 μm;1風通しのユニット)。
4. ローダミン6G(Rh6G)溶液をステージ上のカバーガラスチャンバーの井戸に加えます。
5. 目的に浸漬超純水を追加します。浸漬油は使用しないでください。
6. 顕微鏡のステージにチャンバーをセットします。ステージを適切な位置に移動します。
7. ガラス表面からの散乱光を測定することで、ガラス上面に焦点を当てます。対物レンズを底面に下げた後、フォーカスノブを時計回りに回して調整します。
   注意:フォーカスノブの旋回方向は日本とドイツの間で反対なので確認してください。
8. 焦点を上げて上ガラス表面の上に200μm上げて、溶液の内部を観察します。
9. [カウント] レートをクリックし、フォトン数を監視します。
10. 徐々にカウント率値が10 kHz以上になるようにアクースト視チューナブルフィルタ(AOTF)値(例えば、励起レーザー伝送)を増加させます。
11. [ピンホール調整]をクリックし、ピンホール調整ウィザードを開きます。x 軸と y 軸の両方で、フォトンの最大数 (ピーク) を持つピンホール位置を見つけます。
12. 対物レンズの補正リングを、分子あたりの数(CPM)値が最も高くなるようにします。
    注:ここで指定したチャンバのカバーガラスの厚さは0.12-0.17ミリメートルであるため、補正リングは、CPMが最大である、その最小値またはそれからほんの数ターンの周りにあります。
13. AOTF 値を徐々に小さくして、CPM 値が 2 ~ 3 kHz になるようにします。
14. 90 s の Rh6G の自己相関関数 (ACF) を取得します。
15. 計測が完了したら、[ フィット ]をクリックしてカーブフィッティング解析を実行します。
16. トリプレット状態の 1 成分 3 次元 (3D) 拡散のモデルを選択します。
    注: Rh6G は単分散型であり、1 成分拡散はトリプレット状態です。
17. 赤い線を動かしてフィッティング開始時間を設定します。[ すべてフィット] をクリックし、適合偏差を確認します。カーブフィッティングを行った後、拡散時間(DT)と構造パラメータ(SP)がそれぞれ20〜30μsと4-8の範囲であることを確認します。
18. 構造パラメータ値を覚えておいてください。同じ日に測定されたすべてのAMFのカーブフィッティング分析に、同じ光学条件下で、顕微鏡ステージにセットされた同じタイプのガラスベースディッシュまたはチャンバーカバーガラスを使用して、SP値を使用します。

5. 細胞のリセートのFCSの測定

1. 細胞のライセートを準備します(上記参照)。
2. カバーガラスチャンバーにライセートを置きます。乾燥を避けるために蓋をし、薄いシェーディング用のステージふたを置きます。
3. 取得条件、レーザーパワー、測定時間、繰り返しを設定します。
4. [カウント]をクリックし、レーザーの AOTF 値を調整して、CPM 値が 1 kHz を超える値になるようにします。
5. 1分間の試験測定を行います。計算された ACF が正の振幅と滑らかな減衰を示しているかどうかを確認します。
6. 5分間の主な測定を行います。
   メモ:測定時間が増えてもACFの形状が変わらないまで、合計測定時間は徐々に増加します。
7. カーブ フィット解析を実行するには、[フィット]をクリックします。
8. トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを選択します。SP値を入力し、設定を「すべて調整」をクリックする前に「Free」ではなく「固定」に変更することを忘れないでください。
9. 適合テーブルをタブ区切りテキストファイルとしてエクスポートします。
10. 必要に応じて、ACF および Count レート レコードをタブ区切りのテキスト ファイルとしてエクスポートします。

6. 生細胞におけるFCS測定

1. 測定前に、新鮮な媒体に交換してください。
2. ヒートステージインキュベーターを使用します。顕微鏡ステージに細胞培養皿をセットします。
3. 共焦点マイクロペを使用して焦点と位置を確認します。測定セルを選択します。セルの位置を拡大して調整します。低速走査速度モードを使用して、GFP発現セルの蛍光画像を取得します。
4. 「FCS」セクションの位置を使用してFCS測定 位置 を選択します。
5. 十字線を使用して少なくとも 1 つの FCS 測定ポイントを選択します (図 1)。
6. ACFを1分間測定します。
   注:蛍光タンパク質は、溶液に比べて動きが遅いため、生細胞で光漂白される傾向があるため、測定時間は最小限に抑える必要があります。長時間の測定は蛍光タンパク質の光化につながるため、一般に、溶液測定と同じくらいスムーズに細胞内のACFを得ることは困難です。
7. [ フィット] をクリックして、トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを使用してカーブ フィット解析を実行します。
   注: ライブセルの測定では、1成分3D拡散モデルでは、生細胞にさまざまな移動成分が存在するため、カイ二乗値を減少させることが経験的に困難であるため、三重項状態の2成分3D拡散のモデルの方が良いでしょう。しかし、3成分3D拡散のモデルを使用しても、拡散成分は通常、2成分のモデルを使用する場合と比較して分離されません。

Results

細胞ライセートとSOD1-G85R-GFPのFCS測定を生細胞で行いました。どちらの場合も、正の振幅と滑らかなADFを獲得することができました。Neuro2a細胞で発現したGFP-TDP25の一部が、示された条件⁶の下で可溶性分率で回収されたことを示した。細胞溶解液の可溶性分率では、FCSを用いた光子カウント率記録において極めて明るい蛍光分子が検出された(図2A、上、矢印)。このような「スパイク(バーストとも呼ばれる)」は、GFPモノマーおよび単分散化学蛍光色素溶液では認められず、スパイクがオリゴマータンパク質⁹を示していることを示唆している。三重項状態の2成分3D拡散を想定したモデルを用いた曲線フィッティング解析は、高速拡散分子(DT_Fast = 186 μs)が〜90%、残りの10%が2.3ms(図2A、底部、表 2)であることを示した。

Discussion

測定前のシステム校正に関しては、サンプルを測定するために使用されたものと同じガラス製品を使用する必要があります(例えば、8ウェルは、細胞のライセートのためのガラスチャンバーと生細胞用の35mmガラスベースディッシュをカバーする)。ガラス上のRh6Gの吸着のために、その有効濃度が低下することがあります。その場合は、1 μMのような高濃度のRh6G溶液をピンホール調整のためだけに使用する必要があります。非常に高い光子数率は、検出器を保護するために避ける必要があります(例えば、1000 kHz以上)。また、濃縮溶液は自己相関関数の獲得には適さない(100kHz未満を維持する)。ピンホール位置のキャリブレーションは重要です。光学系が頻繁に使用される場合、ピンホールの劇的な脱臼はまれです。したがって、最初に「ファイン」を使用することは、多くの場合、適切な位置を見つけるのに問題ありません。「ファイン」を使用してカウント率のピーク位置が見つからない場合は、「粗い」を使用して、動きの範囲の一方の端から「ファイン」を使用して位置を見つける前にピンホールを移動します。ACFの振幅が平坦であった場合は、焦点と位置が適切かどうかを確認してください。

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Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25%(w / v)トリプシン-1 mmol / L EDTA·フェノールレッド(トリプシン-EDTA)配合4Na溶液富士	フイルム和光純薬(株)	201-16945
100 mm プラスチック皿	CORNING	430167
35 mm ガラスベース皿	岩城	3910-035	生細胞測定用
35 mm プラスチック皿	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150460
アルミプレート	Bio-Bik	AB-TC1
C-アポクロマート 40x/1.2NA Korr.UV-VIS-IR M27	カールツァイス		対物
セルスクレーパー	住友ベークライト(株)	MS-93100
酢酸セルロースフィルターメンブレン (0.22 mm)	アドバンテック トーヨー	25CS020AS
カバーガラスチャンバー 8ウェル	岩城	5232-008	溶液測定用
ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	基礎培地
ウシ胎児血清 (FBS)	バイオセラ		ロットチェックが必要
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher Scientific	11668019
LSM510 META + ConfoCor3	Carl Zeiss		FCS system
マウス神経芽腫 Neuro2a 細胞	ATCC	CCL-131	細胞株
Opti-MEM I	Thermo Fisher Scientific	31985070
pCAGGS	理研	RDB08938	トランスフェクションキャリア用プラスミドDNA
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(×100 )	富士フイルム和光純薬(株)	168-23191
モノ			マーeGFPでタグ付けされたTDP25用プラスミドDNA
pmeGFP-N1			eGFPモノマー発現用プラスミドDNA
pmeGFP-N1-SOD1-G85R			モノマーeGFPプロテアーゼ阻害剤カクテルでタグ付けされたSOD1のALSリンクG85R変異体用プラスミドDNA
	Sigma-Aldrich	P8304