Method Article

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

DOI:

10.3791/62576

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April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

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ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。

Abstract

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タンパク質凝集は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)などの神経変性疾患の特徴である。可溶性または拡散性タンパク質オリゴマーまたは凝集体を検出および分析するために、単一分子感度で単一粒子の拡散速度および明るさを検出できる蛍光相関分光法(FCS)が使用されている。しかし、タンパク質凝集検出のための適切な手順とノウハウは広く共有されていません。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞における凝集しやすいタンパク質の拡散特性に関するFCS測定の標準的な手順を示す:ALS関連25 kDaカルボキシル末端断片のTAR DNA/RNA結合タンパク質43kDa(TDP25)およびスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)を示す。代表的な結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きTDP25の凝集物の一部が、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞溶解物の可溶性画分にわずかに含まれていたことを示している。さらに、ALS関連変異を運ぶGFPタグ付きSOD1は、生細胞における拡散が遅い。そこで、FCSを用いた拡散特性を介してタンパク質凝集を検出する手順を紹介します。

Introduction

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筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含むタンパク質凝集は毒性 が知られており、細胞や臓器のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)を乱し、その後老化につながる可能性がある。タンパク質凝集のクリアランスは、治療戦略として期待されています;しかし、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質凝集体(例えば、小分子や薬物)を分解する化学物質はまだ確立されていません。さらに、タンパク質凝集が毒性を発揮する方法は、依然として不可解です。したがって、タンパク質凝集に関する研究プロジェクトを推進するためには、単にタンパク質凝集を検出する高スループット手順を導入することが重要です。タンパク質凝集および凝集特異的蛍光色素の立体構造を認識する抗体を用いたタンパク質凝集検出は広く用いられている3。しかし、このような古典的な手順を用いた生細胞において特に、凝集を検出することは困難である。

フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質凝集および構造変化を検出する手順である。しかし、FRETはタンパク質のダイナミクス(例えば、生細胞におけるタンパク質の拡散およびオリゴマー化)を分析することができない3。そこで、ここでは、単一分子感度

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Protocol

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1. 材料・試薬

  1. 細胞培養用の発熱性フリー溶液および培地を使用する(表1)。
  2. 超純水を用いた生化学実験用のソリューションを準備し、DNase/RNaseフリーとして使用します。
  3. ロットチェックプロセスで細胞培養に適したFBSを選択します。選択した FBS ロットは定期的に変更されるため、FBS のカタログとロット番号はここでは表すことができません。
  4. プラスミドDNA
    1. eGFP モノマー発現用の pmeGFP-N15を準備します。GFP-TDP25 表現のための pmeGFP-C1-TDP256;SOD1-G85R-GFP 発現のための pmeGFP-N1-SOD1-G85R7;キャリアとしてpCAGGS8。
      注:meGFPは、強化されたGFP(eGFP)のA206K突然変異を運ぶ単量体変異体です。TDP25は、TDP-43のALS関連C末端フラグメントである。SOD1-G85Rは、SOD1のALS関連変異体である。
  5. 細胞株
    1. マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞を使用してください。
      注意:Neuro2a細胞はトランスフェクション効率が高く、外因....

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Results

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細胞ライセートとSOD1-G85R-GFPのFCS測定を生細胞で行いました。どちらの場合も、正の振幅と滑らかなADFを獲得することができました。Neuro2a細胞で発現したGFP-TDP25の一部が、示された条件6の下で可溶性分率で回収されたことを示した。細胞溶解液の可溶性分率では、FCSを用いた光子カウント率記録において極めて明るい蛍光分子が検出された(図2A、上、矢印)。このような「スパイク(バーストとも呼ばれる)」は、GFPモノマーおよび単分散化学蛍光色素溶液では認められず、スパイクがオリゴマータンパク質9を示していることを示唆している。三重項状態の2成分3D拡散を想定したモデルを用いた曲線フィッティング解析は、高速拡散分子(DTFast = 186 μs)が〜90%、残りの10%が2.3ms(図2A、底部、表 2)であることを示した。

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Discussion

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測定前のシステム校正に関しては、サンプルを測定するために使用されたものと同じガラス製品を使用する必要があります(例えば、8ウェルは、細胞のライセートのためのガラスチャンバーと生細胞用の35mmガラスベースディッシュをカバーする)。ガラス上のRh6Gの吸着のために、その有効濃度が低下することがあります。その場合は、1 μMのような高濃度のRh6G溶液をピンホール調整のためだけに使用する必要があります。非常に高い光子数率は、検出器を保護するために避ける必要があります(例えば、1000 kHz以上)。また、濃縮溶液は自己相関関数の獲得には適さない(100kHz未満を維持する)。ピンホール位置のキャリブレーションは重要です。光学系が頻繁に使用される場合、ピンホールの劇的な脱臼はまれです。したがって、最初に「ファイン」を使用することは、多くの場合、適切な位置を見つけるのに問題ありません。「ファイン」を使用してカウント率のピーク位置が見つからない場合は、「粗い」を使用して、動きの範囲の一方の端から「ファイン」を使用して位置を見つける前にピンホールを移動します。ACFの振幅が平坦であった場合は、焦点と位置が適切かどうかを確認してください。

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Disclosures

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これらの著者には利益相反はありません。

Acknowledgements

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A.K.は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成(C)(#18K06201)の支援を受け、中谷財団の新しいコロナウイルス感染対策助成金、北海道大学未来研究リーダー事務所(Lステーション)からの助成金、ホアンシャ財団からの助成によって支援されました。M.K.は、革新的領域に関する科学研究のためのJSPS助成援助「多分子混雑バイオシステムのための化学」(#20H04686)と、革新的分野に関する科学研究のためのJSPS助成助成「生き物の情報物理学」(#20H05522)によって部分的に支援されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25%(w / v)トリプシン-1 mmol / L EDTA·フェノールレッド(トリプシン-EDTA)配合4Na溶液富士フイルム和光純薬(株)201-16945
100 mm プラスチック皿CORNING430167
35 mm ガラスベース皿岩城3910-035生細胞測定用
35 mm プラスチック皿サーモフィッシャーサイエンティフィック150460
アルミプレートBio-BikAB-TC1
C-アポクロマート 40x/1.2NA Korr.UV-VIS-IR M27カールツァイス対物
セルスクレーパー住友ベークライト(株)MS-93100
酢酸セルロースフィルターメンブレン (0.22 mm)アドバンテック トーヨー25CS020AS
カバーガラスチャンバー 8ウェル岩城5232-008溶液測定用
ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM)Sigma-AldrichD5796基礎培地
ウシ胎児血清 (FBS)バイオセラロットチェックが必要
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS system
マウス神経芽腫 Neuro2a 細胞ATCCCCL-131細胞株
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGS理研RDB08938トランスフェクションキャリア用プラスミドDNA
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(×100 )富士フイルム和光純薬(株)168-23191
モノマーeGFPでタグ付けされたTDP25用プラスミドDNA
pmeGFP-N1eGFPモノマー発現用プラスミドDNA
pmeGFP-N1-SOD1-G85RモノマーeGFPプロテアーゼ阻害剤カクテルでタグ付けされたSOD1のALSリンクG85R変異体用プラスミドDNA
Sigma-AldrichP8304

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

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