方法論記事

MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

DOI：

10.3791/62577

⸱

2021年5月23日

 , 
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法を用いて、ゲノム的に配列された病原性細菌によって産生されるタンパク質を迅速に同定するためのプロトコルを、社内で開発したソフトウェアを用いて提示する。アスパラギン酸効果とこの特異性のために、メタスタブルタンパク質イオン断片は、タンパク質同定のために利用されます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、抗生物質誘導を使用して病原性 大腸菌 株によって産生されるコリシンE3およびバクテリオシンの殺菌酵素の免疫タンパク質を同定し、MALDI-TOF-TOFタンデム質量分析法およびトップダウンプロテオミクス分析によって社内で開発されたソフトウェアで同定される。アシシンE3(Im3)の免疫タンパク質とバクテリオシン(Im-Bac)の免疫タンパク質は、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン残基のC末端側のポリペプチド骨格切断(PBC)によって生成された顕著なb-および/またはy型断片イオンから同定された。このソフトウェアは、細菌株の全ゲノムシーケンシングに由来する インシリコ タンパク質配列を迅速にスキャンします。また、このソフトウェアは、成熟タンパク質配列が切り捨てられた場合にタンパク質配列のアミノ酸残基を繰りつ離します。1つのタンパク質配列は、各免疫タンパク質について検出されたものと一致する質量およびフラグメントイオンを有する。候補シーケンスを手動で検査し、検出されたすべてのフラグメントイオンが割り当てられることを確認しました。Im3のN末端メチオニンは翻訳後に除去されたのに対し、Im-Bacは完全な配列を持っていた。さらに、正しいタンパク質配列を同定するためにPBCによって形成された非相補性フラグメントイオンは2~3個しか必要でないことがわかりました。最後に、プロモーター(SOSボックス)を、細菌株のプラスミドゲノム中の抗菌遺伝子および免疫遺伝子の上流で同定した。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

質量分析法による未消化タンパク質の分析および同定は、トップダウンプロテオーム解析1、2、3、4と呼ばれる。エレクトロスプレーイオン化(ESI)5と高解像度質量分析計6を利用した技術として確立され、高度な解離技術、例えば電子転写解離(ETD)、電子捕捉解離(ECD)7、紫外線光解離(UV-PD)8、等を利用する技術が確立されている。

他のソフトイオン化技術は、マトリックスアシストレーザー脱離/イオン化(MALDI)9、10、11であり、主に飛行時間(TOF)質量分析装置と結合されているため、トップダウン分析にはあまり広く利用されておらず、他の質量分析装置と比較して分解能が限られている。これらの制限にもかかわらず、MALDI-TOFおよびMALDI-TOF-TOFの装置は、純粋なタンパク質の迅速なトップダウン分析と、タンパク質の分画および未分化混合物のために利用されてきました。純粋なタンパク質の同定のために、インソース崩壊(ISD)は、ISD断片イオンの質量分析(MS)分析、ならびに標的のN-およびC末筋からしばしば配列特異的断片を提供するタンパク質イオン断片のタンデム質量分析(MS/MS)を可能にするため、特に有用な技術である。.ISD アプローチの欠点は、エドマンシーケンシングと同様に、サンプルに含まれているタンパク質が 1 つだけである点です。1つのタンパク質要件は、前駆体イオンへのフラグメントイオンの明確なアトリビューションの必要性によるものです。サンプルに複数のタンパク質が存在する場合、どのフラグメントイオンがどの前駆物質に属しているかは、割り当てが難しい場合があります。

フラグメントイオン/前駆体イオンアトリビューションは、MALDI-TOF-TOF-MS/MSを使用して対処することができます。従来のMS/MS実験と同様に、前駆体イオンは断片化の前に質量選択/単離され、検出されたフラグメントイオンは特定の前駆体イオンに起因する可能性があります。しかしながら、このアプローチで利用可能な解離技術は、主に高エネルギー衝突誘発解離(HE-CID)14またはポストソース崩壊(PSD)15,16に限定される。HE-CIDおよびPSDは、ペプチドおよび小タンパク質の断片化に最も効果的であり、配列被覆範囲は、場合によっては制限される可能性がある。また、PSDは、アスパラギン酸効果17、18、19、20と呼ばれる現象によって、主にアスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基のC末端側にポリペプチド骨格切断(PBC)をもたらす。

MALDI-TOF-MSはまた、微生物の分類学的同定におけるニッチな用途を発見しました: 細菌21、 真菌22、およびウイルス23.例えば、MSスペクトルは、比較のためにパターン認識アルゴリズムを用いて既知の細菌のMSスペクトルの参照ライブラリーと比較して未知の細菌を同定するために使用される。このアプローチは、その速度とシンプルさのために非常に成功していますが、分離物の一晩の培養が必要です。このアプローチによって検出されたタンパクイオン(通常は20kDa以下)は、属および種レベルでの分類学的分解能を可能にするMS指紋を含み、場合によってはサブ種24および株レベル25、26で。しかし、病原性の可能性のある微生物を分類的に分類するだけでなく、特定の病原性因子、毒素、抗菌性(AMR)因子を同定する必要があります。これを達成するために、ペプチド、タンパク質、または小分子の質量をMSによって測定し、その後MS/MSによって単離され、断片化されます。

病原性細菌は、しばしばプラスミドと呼ばれるDNAの円形の断片を運ぶ。プラスミドは、プロファージと共に、細菌間の水平遺伝子導入の主要なベクターであり、細菌間で抗菌性および他の毒性因子の急速な広がりを引き起す。プラスミドはまた、抗菌(AB)遺伝子、例えば、コリシンおよびバクテリオシンを運ぶことができる。これらの遺伝子が発現し、タンパク質が分泌されると、それらは、同じ環境ニッチ27を占める隣接細菌のタンパク質翻訳機械を無効にする作用をする。しかし、これらの殺菌酵素は、それらを産生する宿主にリスクをもたらす可能性もある。その結果、遺伝子は、AB酵素の機能を特異的に阻害し、その免疫タンパク質(Im)と呼ばれる宿主によって共発現される。

マイトマイシンCやシプロフロキサシンなどのDNA損傷性抗生物質は、細菌ゲノム28に存在するプロファージゲノム内に滋賀毒素遺伝子(stx)が見つかる滋賀毒素産生大腸菌(STEC)においてSOS応答を誘導するためによく用いられる。我々は、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス分析を使用して、STEC株29、30、31、32によって産生されるStx型およびサブタイプを検出し、同定した。前の研究では、STEC O113:H21株RM7788は、マイトマイシンCを補充した寒天培地上で一晩培養した。しかし、m/z~7816で予想されるStx2aのBサブユニットを検出する代わりに、m/z〜7839で異なるタンパク質イオンが検出され、未知の機能33のプラスミドコード化された仮説タンパク質として同定された。今回の研究では、全ゲノムシーケンシング(WGS)由来のインシリコタンパク質配列を処理およびスキャンするために開発されたスタンドアロンソフトウェアを用いて、抗生物質誘導、MALDI-TOF-TOF-MS/MS、およびトップダウンプロテオミクス解析を用いて、この株によって産生される2つのプラスミドコード化AB-Imタンパク質を同定した。さらに、シーケンス切り捨てを伴う翻訳後改変(PTM)の可能性がソフトウェアに組み込まれました。免疫タンパク質は、アスパラギン酸効果によって引き起こされたPBCからの成熟タンパク質イオンおよび配列特異的フラグメントイオンの測定質量からこのソフトウェアを使用して同定され、MS/MS-PSDによって検出された。最後に、この株がDNA損傷性抗生物質にさらされたときにこれらの遺伝子の発現を説明することができるプラスミドゲノム中のAB/Im遺伝子の上流にプロモーターが同定された。この作品の一部は、2020年8月17-20日の仮想会議&博覧会(2020年8月17-20日)34で発表された。

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プロトコル

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1. 微生物学的サンプル調製

  1. 無菌1 μLループを使用してグリセロールストックから50 mL円錐管に25 mLのルリアスープ(LB)を大 腸菌 O113:H21株RM7788(または別の細菌株)を接種します。チューブをキャップし、4時間振る(200rpm)で37°Cで前培養します。
  2. アリコート100 μLの前培養ブロスを400または800 ng/mLのミトマイシンCを補ったLB寒天プレートに広げる。培養寒天プレートを37°Cのインキュベーターで一晩静に培養する。
    注意:STEC株は病原性微生物です。BSL-2バイオセーフティキャビネットで、培養を超えたすべての微生物学的操作を行います。
  3. 滅菌1 μLループを使用して単一の可視コロニーから細菌細胞を収穫し、300 μLのHPLCグレードの水を含む2.0 mL Oリング裏地付きスクリューキャップマイクロ遠心チューブに移します。チューブをキャップし、渦を短時間、遠心分離機を11,337 x g で2分間ペレットにします。

2. 質量分析

  1. サンプル上清の0.75 μLアリコートをステンレス鋼MALDIターゲットにスポットし、乾燥させます。乾燥したサンプルスポットを、33%アセトニトリル、67%の水、0.2%トリフルオロ酢酸のシナピエン酸の飽和溶液の0.75 μLアリコートでオーバーレイします。スポットを乾燥させます。
  2. MALDI-TOF-TOF質量分析計を使用して、乾燥したサンプルスポットを分析します。
    1. MALDI ターゲットを質量分析計にロードした後、取得ソフトウェアで MS リニア モード取得のボタンをクリックします。取得方法ソフトウェアのそれぞれのフィールドに下限と上限のm/z(例えば、2 kDa から20 kDa)を入力して、分析するm/z範囲を入力します。
    2. ソフトウェアの MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押下し、サンプルスポット上にマウスカーソルをドラッグして、レーザーアブレーション/イオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。マウスボタンを放すと、取得が開始されます。各サンプルスポットに対して1,000枚のレーザーショットを集める。
      メモ:データ取得は、ソフトウェア取得ウィンドウにリアルタイムで表示されます。
    3. イオンが検出されない場合は、ソフトウェアのレーザー強度の下で、タンパク質イオン信号が検出されるまで、レーザー強度の下でスライディングスケールバーを調整してレーザー強度を高めます。これをしきい値と呼びます。
      注:サンプルスポット分析の前に、m / zが分析される範囲にまたがるタンパク質キャリブラント(例えば、タンパク質キャリブラントの+1および+2の電荷状態)でMSリニアモードで機器を外部キャリブレーションします:シトクロムC、リソチーム、ミオグロビンは2kDa〜20 kDaの質量範囲をカバーします。指定された質量範囲内の中間質量は、例えば9 kDaの焦点質量として使用されます。焦点質量は、リニアモード検出器による検出のためにm/zが最適に焦点を合わせているイオンです。
    4. MS リニア モードの取得が完了したら、取得ソフトウェアで MS/MS 反射モード取得のボタンをクリックします。解析する前駆体質量を 前駆体質量 フィールドに入力します。次に、 前駆体質量 の低質量側と高質量側の分離幅(Da)を前駆体質量の側面(例えば、±100 Da)に入力します。
    5. CID オフボタンをクリックします。メタスタブルサプレッサーONボタンをクリックします。ソフトウェアのレーザー強度の下のスライドスケールバーを調整して、レーザー強度を最大値の90%以上に調整します。
    6. ソフトウェアの MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押し下げ、サンプルスポット上にマウスカーソルをドラッグして、レーザーアブレーション/イオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。マウスボタンを放すと、取得が開始されます。各サンプルスポットに対して10,000枚のレーザーショットを集める。
      注:サンプルスポット分析の前に、器具は、アルキル化チオレドキシン35の+1電荷状態のポストソース崩壊(PSD)からのフラグメントイオンを使用してMS / MS反射体モードで外部較正する必要があります。
  3. 生の MS データは処理しません。高度なベースライン補正(32、0.5、0.0)、次のノイズ除去(2標準偏差)、続いてガウス平滑法(31ポイント)の順にMS/MS-PSDの生データを処理します。
  4. PBC19,20で生成された顕著なフラグメントイオンの存在を MS/MS-PSD データを手動で検査します。
  5. フラグメントイオンの絶対量と相対量と、そのシグナル対雑音(S/N)に関してMS/MSデータを評価します。MS/MS-PSDデータが騒々しい場合は特に、タンパク質同定のために最も豊富なフラグメントイオンのみを使用してください。

3.インシリコ タンパク質データベース構築

  1. 細菌株 のインシリコ タンパク質配列を含むテキストファイルを生成し、タンパク質の同定のためにタンパク質バイオマーカーSeekerソフトウェアによってスキャンされます。タンパク質配列は、分析対象の株(または密接に関連する株)の全ゲノムシーケンシング(WGS)に由来する。
  2. NCBI/PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)のウェブサイトにアクセスして、分析中の特定の細菌株(例えば、大腸菌 O113:H21株RM7788)の約5,000個のタンパク質配列をダウンロードします。最大ダウンロード サイズは 200 シーケンスです。
    1. 結果として、25 のダウンロードをコピーして、1 つのテキスト ファイルに貼り付けます。ダウンロードごとに FASTA (テキスト) 形式を選択します。

4. 操作タンパク質バイオマーカーシーカーソフトウェア

  1. タンパク質バイオマーカーシーカー実行可能ファイルをダブルクリックします。グラフィカル・ユーザー・インターフェース (GUI) ウィンドウが表示されます (図 1、上部パネル)。
  2. タンパク質バイオマーカーの質量(MS-リニアモードで測定)を 成熟タンパク質質量 フィールドに入力します。次に、質量測定誤差を [質量公差 ]フィールドに入力します。標準的な質量測定誤差は、10,000 Daタンパク質の場合±10 Daです。
  3. 必要に応じて、補完的な相補フラグメントイオンペア(CFIPまたはb/y)からタンパク質量を計算するために、 相補b/yイオンタンパク質量計算 ボタンをクリックします。ポップアップ ウィンドウのタンパク質量計算ツールが表示されます (図 1、下部パネル)。
    1. 推定CFIPの m/z を入力し、 ペアを追加 ボタンをクリックします。計算されたタンパク質量が現れます。
    2. この数値をコピーして [成熟したタンパク質量 ]フィールドに貼り付け、[ タンパク質量計算ツール] ウィンドウを閉じます。
  4. N末端シグナルペプチド長を選択するには、[残留制限の設定]ボックスをクリックします。スライドスケールとカーソルを含むポップアップが表示されます。カーソルを目的のシグナルペプチド長(最大50)に移動します。シグナルペプチド長が選択されていない場合、無制限のシーケンス切り捨てがソフトウェアによって実行されます。
  5. GUIの フラグメントイオン条件 下で、ポリペプチド骨格切断(PBC)の残基を選択する。D、E、N、P の 1 つまたは複数の残基のボックスをクリックします。
    1. [ フラグメントイオン入力(+1)検索対象 ]ボタンをクリックします。ポップアップ フラグメントページ が表示されます。次に、入力する フラグメントイオン の数に対応する[フラグメントイオンの追加]ボタンをクリックします。入力するフラグメントイオンごとにドロップダウンフィールドが表示されます。
    2. フラグメントイオンの m/z と、関連する m/z 許容値を入力します。完了したら、[ 保存して閉じる ] ボタンをクリックします。
      注: 妥当な m/z 許容値は ±1.5 です。
    3. [照合する必要があるフラグメントイオンの数] ボックスの右側にある目的の数までスクロールして、識別に一致する 必要があるフラグメントイオンの最小数を選択します。
      注: 3 つの試合が適切なはずです。
    4. システイン残基を、対応する円をクリックして酸化状態にするを選択します。検索後にタンパク質の同定が見つからない場合は、システインを減少させた状態で検索を繰り返します。検索後に識別が見つからない場合は、フラグメントイオン許容値を±3 に広げ、検索を繰り返します。
  6. [ ファイル設定] で 、[FASTA ファイルの選択 ] ボタンをクリックして、プロトコルステップ 3.1 ~ 3.2 で以前に構築された細菌株の インシリコ タンパク質配列を含む FASTA (テキスト) ファイルを参照して選択します。次に、出力フォルダーを選択し、出力ファイル名を作成します。
  7. [ファイル エントリで検索を実行 ] ボタンをクリックします。ポップアップ ウィンドウが表示され、「 検索パラメータの確認 」(図 1、下のパネル)、検索が開始される前に検索パラメータが表示されます。
  8. 検索パラメータが正しい場合は、[検索の 開始 ]ボタンをクリックします。検索パラメータが正しくない場合は、[ キャンセル ]ボタンをクリックして、正しいパラメータを再入力します。検索が開始されると、パラメータ ウィンドウが閉じ、新しいポップアップ ウィンドウが表示され、進行状況バー (図 1、下部パネル) に検索の進行状況と、検出された ID の数の集計が表示されます。
  9. 検索が完了すると (数秒)、プログレスバーが自動的に閉じ、検索の概要がGUIの[ログ]フィールド(図2、上部パネル)に表示されます。また、新しいポップアップウィンドウが表示され、タンパク質の同定が表示されます(図2、下のパネル)。
    注:認識されない残基を有する シリコ タンパク質配列では、例えば、UまたはXは、分析から自動的にスキップされ、これらの配列は、検索の完了時にどの(もし)配列がスキップされたかオペレータに警告するために、別のポップアップウィンドウで報告されます。

5. タンパク質配列の探索後確認

  1. 手動分析により候補シーケンスの正確性を確認します。
    注: プロテインバイオマーカー Seeker ソフトウェアの目的は、明らかに間違ったタンパク質配列を考慮から排除し、成熟タンパク質に可能な PTM として配列切り捨てを組み込むことにより、タンパク質配列を高精度に同定することです。返される候補シーケンスの数が少ないほど、手動確認は管理可能です。
  2. そのような機能性を有する任意の質量分析法またはプロテオミクスソフトウェアを用いて、候補配列のb-およびy型フラグメントイオンの平均m/zの表を生成する。D-、E-、N残基のC末端側(およびP残基のN末端側)の シリコ 断片イオンの平均m/zを、MS/MS-PSDデータからの顕著な断片イオンのm/zと比較します。
    注:最も顕著なMS/MS-PSDフラグメントイオンは、 インシリコ フラグメントイオンのD-E-およびN-関連と容易に一致する必要があります。しかし、アスパラギン酸効果断片化機構は、タンパク質配列36のN-またはC末語付近で効率が悪い。

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結果

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図3(上パネル)は、400 ng/mLミトマイシン-Cを補充したLBA上で一晩培養したSTEC O113:H21株RM7788のMSを示す。m/z 7276、7337、および7841のピークは、以前はコールドショックタンパク質C(CspC)、コールドショックプロテインE(CspE)、および未知の機能を有するプラスミド媒介タンパク質と同定されていた。m/z 9780[M+H]+におけるタンパク質イオンを、図3(下パネル)に示すようにMS/MS-PSDで分析した。前駆体イオンは、時間イオンセレクタ(TIS)ウィンドウ±100 Da.フラグメントイオンは、m/zおよびタイプ/数によって同定される。m/z 2675.9のフラグメントイオン(星で強調)は、図3(上パネル)に示すm/z 9655におけるメタスタブルタンパク質イオンの解離から波及する。各フラグメントイオンの理論平均m/zは、上に示したコリ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルに関する考慮事項
現在のプロトコルの主な強みは、その速度、サンプル調製のシンプルさ、および操作が比較的容易で、訓練され、維持される楽器の使用です。液体クロマトグラフィー-ESI-HR-MSによるボトムアップおよびトップダウンプロテオミクス分析は、MALDI-TOF-TOFによるトップダウンに対して多くの点で普及していますが、より多くの時間、労力、専門知識が必要です。機器の複雑さは、質量分析で正式に訓練されていない科学者によって特定の機器プラットフォームが採用される可能性があるかどうかに影響を与えることがよくあります。MALDI-TOF-TOFのトップダウンアプローチは、MALDI-TOF-MSの分析を、臨床微生物学ラボにおける細菌の分類学的同定に使用する現在の使用を超えて拡張することを目的としており、分析に必要な労働力、複雑さ、または専門知識を劇的に増加させないようにすることを目的としている。

このプロトコルは、機械的(または電気的)細胞のライシスステップを採用していません。分泌されたタンパク質または細胞外タンパク質はプロトコルを使...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者には利益相反はありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロテインバイオマーカーシーカーソフトウェアは、clifton.fagerquist@usda.gov でクリフトンK.Fagerquistに連絡することで、無料で(無料で)自由に利用できます。我々は、ARS、USDA、CRIS助成金によるこの研究の支援を認めてほしい:2030-42000-051-00-D。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
4000シリーズエクスプローラーソフトウェアAB Sciexバージョン3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOFアナライザーAB Sciex
アセトニトリルオプティマ LC/MSグレードフィッシャーケミカルA996-1
BSL-2 バイオハザードキャビネットベーカーカンパニーSG403A-HE
シトクロム-CシグマC2867-10MG
データエクスプローラーソフトウェアAB Sciexバージョン4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kitG-Biosciences786-231
GPMAW softwareLighthouse DataVersion 10.0
IncubatorVWR9120973
LB AgarInvitrogen22700-025
Luria BrothInvitrogen12795-027
リゾチームSigmaL4919-1G
微量遠心チューブ、2 mL、スクリューキャップ、O リングフィッシャー サイエンティフィック02-681-343
MiniSpin Plus 遠心分離機エッペンドルフ22620207
マイトマイシン-C (ストレプトマイセス由来)Sigma-AldrichM0440-5MG
ミオグロビンΣM5696-100MG
シェーカー MaxQ 420HP モデル 420Thermo Scientificモデル 420
シナピン酸Thermo Scientific1861580
滅菌 1 uL ループフィッシャーサイエンティフィック22-363-595
チオレドキシン (大腸菌、組換え体)SigmaT0910-1MG
トリフルオロ酢酸Sigma-Aldrich299537-100G
水オプティマLC/MSグレードフィッシャーケミカルW6-4

参考文献

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