方法論記事

マウスのストレスを軽減する取り扱い技術

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DOI：

10.3791/62593

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2021年9月25日

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1Campbell Family Mental Health Research Institute of CAMH, 2Department of Psychiatry, University of Toronto, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto, 4Departamento de Investigación, Universidad Central de Queretaro, 5Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5287, Institut de Neurosciences Cognitives et Intégratives d'Aquitaine, Université de Bordeaux

この記事について

サマリー

本論文では、不安のような行動を軽減してルーチン処理を容易にする3Dハンドリング技術であるマウスの取り扱い技術について述べ、既存の2つの関連技術(トンネルおよびテールハンドリング)の詳細を提示する。

要約

実験動物は、科学者や動物のケア提供者によって複数の操作を受けます。このストレスは、動物の幸福に深い影響を与えることができ、また、不安対策などの実験変数の交核要因となり得る。長年にわたり、取り扱い関連のストレスを最小限に抑える取り扱い技術は、ラットに特に焦点を当てて開発され、マウスにはほとんど注意を払っていません。しかし、マウスはハンドリング技術を用いて操作に慣れることができることを示している。マウスの取り扱いを習慣化することで、ストレスを軽減し、日常的な取り扱いを容易にし、動物の幸福度を向上させ、データの変動性を低下させ、実験信頼性を向上させます。取り扱いの有益な効果にもかかわらず、特にストレスの多いテールピックアップアプローチは依然として広く使用されています。本論文では、人間の相互作用中に動物が経験するストレスを最小限に抑えることを目的として、新たに開発されたマウス処理技術の詳細な説明とデモンストレーションを提供する。この手動技術は3日間(3Dハンドリング技術)にわたって行われ、実験者に慣れる動物の能力に焦点を当てています。本研究は、(ポリカーボネートトンネルを用いた)トンネル処理技術とテールピックアップ技術の効果も示している。具体的に研究されているのは、行動検査(上昇プラス迷路およびノベルティ抑制給餌)、実験者との自発的相互作用および生理学的測定(コルチコステロンレベル)を用いた、不安様行動への影響である。3Dハンドリング技術とトンネル処理技術は、不安のような型を減少させた。最初の実験では、生後6ヶ月の雄マウスを用いて、3Dハンドリング技術は実験者の相互作用を有意に改善した。2番目の実験では、生後2.5ヶ月の女性を用いて、コルチコステロンレベルを低下させた。そのため、3D 処理は、実験者との対話が必要または好ましい場合や、実験中にトンネル処理ができない場合に役立ちます。

概要

マウスおよびラットは、内分泌、生理学的、薬理学的または行動学的研究2を含む複数の目的のための前臨床試験1、2に不可欠な資産である。動物を含む研究の増加から、人間の相互作用を含む制御されていない環境変数が生物医学研究3、4、5における様々な成果に影響を与えることが生じた。これは、実験や研究所4、5で観察される大きな変動性を担い、動物研究において大きな注意点を示しています。

環境ストレッサーの影響を抑え、人間との相互作用に対する反応性を低減することを目的として、さまざまなアプローチが実施されています。例えば、環境ストレスの影響を抑えるために、住宅条件や自動住宅システム6、7の標準化が実験室全体で実施されています。人間との相互作用に関しては、動物の扱いや運搬に一般的に使用されるアプローチは、動物の不快感やストレスをほとんど考慮していなかった。例えば、尾で動物を拾うか、鉗子8を使用すると、ベースライン不安9、10、11が増加し、探査9、12を減少させ、研究13、14の中および全体の個人間変動に大きく寄与する。その結果、マウスやラットに適用可能なカップハンドリング技術など、他のアプローチが開発された。このアプローチでは、動物はケージから「カップ」され、実験者が手でカップ9、10、11を形成します。尾の取り扱いに対するもう一つの有用な代替手段は、マウス9、10、15を移すポリカーボネートトンネルの使用を含む。この方法により、マウスと実験者の直接的な相互作用が排除されます。カップとトンネルの両方のアプローチは、不安のような行動を減らす効果を示し、尾のピックアップ/テールハンドリング9、10などの回避的な取り扱い技術によって誇張することができる実験者の恐怖を軽減する。

したがって、証拠の増加は、個人9,11,及び動物福祉の改善に対する適切なマウス処理の有用性を示す。ただし、上記の手法は依然として制限に直面しています。カップハンドリング技術は、10日間(2週間10回のセッション)から15週間17までのスケジュールで実施されており、これは施設スタッフと実験者にとってかなりの時間です。さらに、カップハンドリングの有効性は、ひずみ9およびオープンハンドでの従来のカップ処理によって異なり、ナイーブマウスまたは特にびくびくした株が手9,18からジャンプすることにつながる可能性がある。トンネル処理の結果、より一貫性が高く、一般的に迅速に19が得られます。トンネルはホームケージの濃縮としても使用されます。彼らは動物が迅速に取り扱うことを習慣化し、豊かさの付加的な利点を提供するのを助ける。しかし、トンネル処理には、装置間で動物を移送する際に制限があります。興味深いことに、ハーストとウェスト9、ヘンダーソンら20は、穏やかで短い手動処理を使用してトンネルから装置に動物を移しても、その表現型に影響を与えないことを実証した。

既存の方法に代わるものを提供し、短期間での慣用化を短期間で行うため、カップハンドリング技術を拡張する新しい技術を紹介し、特に設備を必要としない。このアプローチでは、マイルストーンを使用して、マウスがハンドリングプロセスで持っている快適さのレベルを測定します。これは、マウスの反応性とストレスの低下(行動およびホルモンレベル)での有効性を示し、日常的な取り扱いを促進し、動物間の変動を減らすことに寄与する。この技術の詳細は、ここで提供され、不安様行動の低減、実験者との相互作用の改善、末梢ストレスホルモン(コルチコステロン)放出の制限におけるその有効性は、トンネル処理(陽性対照)および尾処理技術(陰性対照)と比較して、2つの別々の研究(雄マウスと女性マウス)で実証されている。

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プロトコル

動物の被験者に関する手続きは、CAMH動物ケア委員会によって承認され、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って実施されました。

注:本明細書に記載の取り扱い方法は、非トランスジェニック(C57/BL6、BalbC、CD1、SV129など)およびトランスジェニックラインを含む様々なマウス株で使用することができる。また、若いまたは古いマウスと一緒に使用することができ、特に1日目には、若年成人(生後4〜6週齢)のマウスが成人または古いマウスよりもわずかに活発である傾向があることを示す。

1. 実験準備

  1. 開始を研究する前に、ARRIVEガイドライン21に従って、各ハンドリンググループ(3Dハンドリング、トンネルハンドリングまたはテールハンドリング)にマウスをランダムに割り当てます。
  2. 取り扱いを実行する部屋を特定します。それは、住宅室、または別の部屋で行うことができます。取り扱いが移動カート上で移動する必要がある別の部屋で処理を行う場合、扱いプロトコルの開始前に20〜30分間、動物が新しい部屋に慣れることができるようにします。
  3. グループ収容動物の場合は、最初のホームケージでマウスをすべて再グループ化する前に、取り扱い後に一時的なケージを使用してマウスを収容します。これは、取り扱い前に動物間の潜在的な戦いを減らします (特に男性で).
  4. カウンター(好ましくはクリアされたカウンタートップ)またはバイオセーフティキャビネットで、ハウジングケージを取り扱う動物から離れて作業します。ハウジングケージに近い場合は、ジャンプのリスクが高まります。動物がグループ収容されている場合、マウスが操作されているマウスをホームケージに飛び込むと、ケージメイトにストレスを与える可能性があります。
    注:バイオセーフティキャビネットで作業すると、マウスが床に飛び乗るリスクが制限され、特定の施設で必要になる可能性があります。この技術は、バイオセーフティキャビネットで使用することができ、常にバイオセーフティキャビネット内のすべてのステップを実行し、ハンドラーの前腕の上を歩くマウスを避けます。

2. 1日目:マウス1個あたり5分

  1. ケージを静かに開けて蓋を側面に置き、ネスティング材料や、ランニングホイールやシェルターなどの濃縮物を取り除きます。
  2. 手袋をはめた開いた手をホームケージに導入し、ゆっくりとケージの壁の片側(ハンドラに最も近い壁、 図1A)に沿って手を置きます。
    1. マウスをすぐに拾おうとしないでください。
  3. 不動のままで、動物が約30のケージの中に手の存在に慣れることができるようにします。
  4. 手のひらでマウスを拾おうとします(すなわち、その尾で動物を拾うのを避けてください)。
    1. 3回試みた後にマウスが手に入らない場合は、マウスを両手で隅に導き、両手でカップを取ります。
    2. カップの手をマウスに向かってそっと動かして拾おうとします。
    3. 両手で最大3回試行した後に失敗した場合は、尾の付け根でマウスをそっと拾い、前腕または平らな手に移します。
  5. マウスを手にして、手を平らにして、できるだけ開いてください。
    注: これはマウスが踏み込む平らなプラットフォームを提供し、咬傷のリスクを制限します。
  6. 手を開けて平らにして手のひらを上にして、もう一方の手をマウスを持つ手に隣接して置き、マウスを手から手へ自由に動かしながら、手から手へ自由に動かします(図1B)。
  7. マウスを探索し、1分間手の間を移動してみましょう。
    1. この時点でマウスは飛び降りようとするかもしれません。マウスがジャンプした場合、それは床ではなくカウンターの上に着陸するように手を配置します。
    2. マウスがジャンプの準備をしているように見える場合(手の端に向かって移動し、後ろ足で飼育する)、ゆっくりとその前にもう一方の手を置き、この手の上を歩くように導こうとします。ジャンプのリスクが高まるので、突然の動きを避けてください。
    3. マウスがジャンプする場合は、テールハンドリングを避けてマウスを拾い、処理セッションを再開します。マウスが床や手の外に10以上離れている場合は、マウスが手から出ていたときはいつでも補うために、ハンドリングセッションに時間を追加します。
    4. ジャンプのノートを取ります。ジャンプの合計数は、動物間の潜在的な変動性を評価するために使用することができます。
  8. 平らな手でハンドリングを1分後、手のひらを緩め、手の中でマウスを少しカップに入れて、マウスを手の間でそっと転がす前に(図1C)。
    1. 「ロール」するには、マウスを手のひら、平らな手、指に垂直に置きます。
    2. 手をゆっくりと閉じ、指をマウスの背面に置きます。
    3. マウスを保持している手の下にフリーハンドを置きます。
    4. マウスでゆっくりと手を回したり回転させたりして、マウスをもう一方の手にそっと移動させます(180°フリップ)。
    5. このやり返しを手の間で繰り返します。
  9. 手の間の穏やかなローリングと60 sのためのオープンハンドでの自由な探検から、約20 sの技術の間で交互に。
  10. 「シェルターテスト」(図1D)を実施します。
    1. マウスを手の端に移動させ、2つの手を一緒に持って行きます。
    2. 非常にゆっくりと、マウスが手で形成された「避難所」の中に収まるようにカップします。マウスが必要に応じてエスケープできるように、開口部を残します。
    3. 拘束することなく、5-10 sの避難所にマウスを保つことを目指してください。
    4. 避難所のテストの間で交互に、手の間を転がり、別の60 sのための開いた手の自由な探査は、避難所のステップ3以上を実行することを確認する。
  11. 2.10 で説明されているすべての手順では、プロセスを急いでしないでください。マウスがストレスを感じている場合(すなわち、脱出する暫定的な、手からジャンプする、手との接触を避けるなど)、手の間を転がり、20sの自由な探検を続け、それから再試行してください。
  12. マイルストーン: 1 日目の完了に向けて、10 s のシェルター テストに成功した 1 回以上実行します。
    1. マウスが手に留まったときに、避難所のテストが成功したことを考えてみましょう。マウスが頭を飛び出して避難所に戻った場合、それはまだ成功したテストです。動物が完全に避難所から出た場合、それは失敗です。
  13. 30 sのための手で自由な探検を許可します。
  14. ケージ内のマウスをそっと取り替えます。グループが収容されている場合は、すべてのケージ合致が処理されるまで、マウスを一時的なケージに入れます。手のひらでマウスを拾って、マウスを元のケージに戻します。テールピックアップは使用しないでください。
  15. 70%エタノールで潜在的な便と尿のベンチトップをきれいにしてください。
  16. 手袋を70%エタノール(または適切な洗浄液)で十分に洗い流すか、次のマウスを取り扱う前に手袋を交換します(ケージの合体のために同じ手袋を保つことが可能です)。
    メモ:ハンドラからの疲労を避けるために、適切な数の動物で処理を行うことをお勧めします。24匹のマウスの取り扱いは約2時間かかり、ハンドラあたり24匹を超えないようにすることをお勧めします。さらに多くの動物を扱う必要がある場合は、複数のハンドラを持つか、処理手順を複数日にわたってサブグループに分割することをお勧めします。

3. 2日目:マウス1個につき3~5分

  1. 手のひらでマウスを拾おうとします。この段階では、それはすでに実現可能であり、マウスは手から飛び出すべきではありません。
  2. 1日目のように手のひらを開いて開始し、マウスが20sのために自由に探索できるようにします。
  3. その後、マウスを手の間に数回(4-5回)巻きます。
  4. 5 sの「シェルターテスト」を行います。
  5. 2~3分の間に、避難所のテストを数回(〜5~6)繰り返します。
  6. 同じ2〜3分の期間中に、慣れ慣れを改善するために、1日目から手の間のロールとオープンハンドステップの自由な探査と交互に。
    1. マウスの頭と背中(図1E)を5~6回タッチします。習慣の兆候は、マウスが脱出しようとせずに触れることができる場合です。
    2. 「鼻突き」を実行する:マウスの鼻を2〜3回タッチしてみてください(図1F)。
      1. マウスが噛み付こうとしたり、触れられた時に明らかなストレスの兆候を示したりする場合は、すぐに鼻を突っ込んではいけません。代わりに、平らな手の探査とロールと交互に。「習慣」は、人間と接触した場合に逃げたり頭を回したりしない動物によって反映されます。
  7. 3.4-3.6 で説明されているすべての手順では、プロセスを急いでしないでください。マウスが手の中に閉じ込められていることによって強調されているように見える場合、または触られたくない場合は、20〜30 sの手の間で転がり続けてから再試行してください。
  8. マイルストーン: 2 日目の完了に 2-3 s のノーズポークを 1 回以上実行します。
  9. 動物が「避難所」、「頭ふれあい」、「鼻突き」にうまく反応し、マウスがストレスの兆候なしに手を探索する意思があるように見える場合は、約3分後に取り扱いを停止します。
  10. マウスがストレスの徴候を示し続けるか、「シェルターテスト」または「鼻突き」テストにうまく反応していない場合は、1日目のように5分に達するまでセッションを続けます。
  11. ケージの中でマウスを交換し、1日目のようにベンチトップと手袋を清掃します。

4. 3日目:マウス1個につき約3分

  1. 3日目は、2日目と同じステップを2~3分間進めます。
    1. 手のひらでマウスを拾います。
    2. マウスを手の間で移動して転がす
    3. 避難所のテストを実行します。
    4. 背中と頭にマウスをペットしてみてください。
  2. これらのステップを約1〜2分で交互に行います。
  3. マウスが逃げようとせずに手のひらに座るのに十分なほどリラックスするまで手順を続けます。
  4. 3日目の終わりまでに、居住のテストとして避難所のテストと鼻の突きテストを繰り返します。
    1. 両方のテストを最初の試行で完了できる場合は、慣れプロセスが完了します。マウスを30sから1分間軽く取り扱い続けます。
    2. マウスが最初にいずれかのテストに耐性がある場合は、ノーズポークとシェルターテストを再試行する前に、20〜30 sのステップ4.1-4.3を繰り返します。
    3. マウスが3分後にこれらの試験に耐性を保つ場合、3日目を繰り返してもよい。
  5. マイルストーン:10 sの少なくとも2つの成功したシェルターテストを実行し、3日目の完了と3D処理手順全体の完了のための2つの成功した鼻の突きテストを行います。
  6. マウスをケージに戻し、ベンチトップと手袋を清掃します。

5. 注射またはギャバジの拘束を受ける動物のためのオプションのアプローチ

注:3日目に、実験目的(口腔ギャージ、腹腔内注射など)のために動物が拘束される場合、マウスは首ピンチテストを受けることができます。

  1. 親指と人差し指の間で首のうなじをつかむ(図1G)。
  2. マウスを手の上に3~5cm持ち上げて2~3sにします。
    注:これは通常、成体マウスにとって非自然な位置であり、マウスが不動の近くに残っている場合、彼らは取り扱いに慣れているし、実験目的のために拘束することが容易になります。
  3. マウスを平らな手に戻すか、マウスが首のピンチに反応する場合は、実験者の袖、ケージの蓋またはカウンタートップに置くことを検討してください
    注:バイオセーフティキャビネットで作業している場合は、袖の上にマウスを置かないか、歩いてバイオセーフティキャビネットを出る可能性があります。バイオセーフティキャビネット内のカウンタートップにマウスを置くことを好みます。
  4. マウスを離して実験者の手を1分間自由に探索します。

6. 追加の処理日数のオプションアプローチ

  1. ストレスの多いマウスラインの結果として、2/3日目に説明した方法を使用して、動物の反応性とストレスレベルを低下させる日数を追加します。
    注:多くの要因は、株、トランスジェニック修飾の存在、年齢、性別および住宅条件を含む動物のベースラインストレスに影響を与える可能性があります。これらの要因が、若いコントロールに対してテストされる老化動物や遺伝子導入動物が野生型コントロールに対してテストされるなどのグループ間で一貫していない場合は、各グループに同じ日数の習慣化を使用することをお勧めします。

7. トンネル処理

注: この方法は、トンネル処理マウスにのみ適用されます。トンネルは、長さ約13cm、直径5cmのポリカーボネートチューブです。

  1. トンネルをマウスのケージに入れます。
  2. 取り扱いの前に7日間ケージにトンネルを残します。
  3. ケージを開け、蓋を側面に置きます。
  4. マウスをポリカーボネートトンネル(ケージ内)にそっと導きます。
  5. トンネルをケージから水平に持ち上げます。必要に応じて、動物がトンネルから飛び降りたり落ちたりするのを防ぐためにトンネルの端をゆるやかに覆い、ケージや床に落ちる可能性があります。
  6. 家のケージから離れてトンネル内の動物を移動し、30 sの任意の表面から離れて保持します。
  7. トンネルをホームケージに戻し、マウスがチューブから出るようにします。
  8. 60 s を待ってから、ステップ 7.4 ~ 7.7 を 1 回繰り返します。
  9. 手袋を70%エタノールで十分に洗い換えたり、次のマウスを習慣化する前に手袋を交換してください。
  10. この手順を 10 日連続で繰り返します。

8. テールハンドリング

注: この方法は、Tail 処理マウスにのみ適用できます。これは、マウスをケージから装置に移すために使用され、その逆もまた同様である。

  1. ケージを開け、蓋を側面に置きます。
  2. 親指と人差し指の間の尻尾の付け根でマウスをつかみます。
  3. ケージからマウスを持ち上げます。
  4. 2-3 sでは、マウスがぶら下がらないように、尾部のグリップを維持しながら、実験者の反対側の前腕にマウスを移します。
  5. この実験の実施で尾の取り扱いが必要な場合(例えば、コルチゾール検査のために血液が引き出される前に)動物は尾の取り扱いによって実験者の前腕に移され、ケージに戻される前に15分間保持される。

9. 高架プラス迷路

  1. 部屋の設定
    1. 部屋の真ん中に、メモリカードを搭載したデジタルカメラの下に迷路を置きます。
    2. 迷路の後ろに置かれた2つの立っているランプを使用して、〜60ルクスで部屋の光を設定します。
    3. 反射を作成し、迷路内の動物の検出を妨害する迷路に直接光を避けるために、任意のオーバーヘッド照明をオフにします。
    4. すべての機器が設定されたら、動物を部屋に移し、光の設定と新しい環境に30分間順応させます。
  2. テスティング
    1. 70%エタノールで迷路を洗浄し、ほこりや以前にテストした動物の臭いを防ぎます。
    2. カメラを起動します。
    3. 動物を迷路に入れる前に、動物IDを持つ紙を使用して、ビデオにIDを記録します(これは、各ビデオで撮影されているマウスの適切な識別を容易にします)。
    4. 迷路に移す各動物に適切な取り扱い技術を使用します。
    5. 開いた腕に向けて中央のプラットフォームにマウスを置きます。
    6. マウスが10分間、邪魔されずに装置を探索できるようにします。
    7. 10分後、カメラを停止します。
    8. 迷路からマウスを取り出し、ケージに戻します。
    9. 70%エタノールで迷路からきれいな便と尿。
    10. すべてのマウスでテストが完了したら、ビデオをメモリカードからコンピュータに転送してビデオ追跡を行います。
    11. 自動動物追跡ソフトウェアを使用して、開いた腕と閉じた腕へのエントリー数、および開いた腕または閉じた腕に費やされた時間を追跡します(ここではEthovision XT 14)。

10. 実験者の相互作用 (ハーストと西9から派生)

  1. 部屋の設定
    1. メモリカードを搭載したデジタルカメラの下のテストルームの中央にテーブルを置きます。
    2. 天井に面した部屋の隅に配置された4電球で50-70ルクスでライトを設定します。反射を作成し、アリーナでの動物の検出を中断迷路に直接光を避けるために、頭上の照明をオフにします。
    3. 動物を部屋に連れて行け。
    4. 彼らは30分間部屋に順応してみましょう。
  2. 実験
    1. ホームケージをデジタルカメラの下に置きます。
    2. 蓋を取り外します。
    3. 動物の追跡を妨げる可能性のある入れ子材料やその他の濃縮を削除します。
    4. カメラを起動します。
    5. 動物IDとケージカードを使用して、ビデオ上の動物を識別します。
    6. 右側の右側にあるケージの壁に沿って、ホームケージに手を置きます。
      1. ハンドラーのヘッドがマウスを撮影するためにカメラをブロックしていないことを確認します。
    7. タイマーを開始します。
    8. 手を2分間動かさないようにし、マウスが手を探し出さないようにします。
    9. 15 sのケージから手を取り外します。
    10. カップの手を使用してマウスをピックアップし、マウスが逃げるかどうかを記録しようとします。
    11. 最後のステップを 5 回、5 秒ごとに、またはマウスが自身を拾い上げることができるまで繰り返します。
    12. マウスのピックアップに必要な試行回数を記録します。
    13. ケージに入れ子の材料と濃縮を返します。
    14. 次の動物に進む前に、70%エタノールで手袋を清掃するか、手袋を交換してください。
    15. テスト後、ビデオをメモリカードからコンピュータに転送します。
    16. 自動ビデオトラッキングソフトウェアを使用して、ケージを4つの同じ象限に分割し、各象限(ここでは、Ethovision XT 14)でマウスが費やした時間を記録します。

11. 新規性抑制供給

  1. 食糧不足
    1. 試験の3日前に、完全なケージ交換を行い、動物をシングルハウス(単一のハウジングは、ホームケージ試験を行うことが好ましい)。
      注:新鮮な寝具を提供すると、最後のケージの変更以来、寝具に蓄積される潜在的なほこりや食べ物の小片を取り除きます。
    2. テストの前日は、午後6時頃にすべての動物の重量を量ります。
    3. 食物ホッパーからすべての食物を取り出し、ケージや寝具に食べ物がないことを確認します。
  2. 部屋の設定
    1. NSFチャンバーをテーブルの上に置きます。
    2. トウモロコシの寝具の薄い層(または動物のホームケージで使用される寝具とは異なる他の寝具)でチャンバーを埋めます。
    3. チャンバーが立っているテーブルの隅に4つの電球を置き、天井に向けて70ルクスでライトを設定します。低い部屋の照明を維持するために、オーバーヘッドライトをオフにします。
    4. 施設で使用される標準的なチャウのペレットを、実験者に面したチャンバーの側(壁から10cm≈)に置きます。
  3. テスティング
    1. 食糧欠乏の翌朝、動物を試験の30分前に部屋に連れて行き、光の設定と新しい環境に順応させます。
    2. 前日に測定された体重に基づいて体重減少を測定するために、すべての動物の体重を量る。動物は、タスクを適切に実行できるように一晩で8〜12%を失う必要があります。
    3. 体重減少ごとに動物をソートし、最も体重を減らしたマウスに最も失ったマウスから始めてそれらをスクリーニングします。
    4. チャンバーが寝具と単一のペレットで満たされていることを確認します。
    5. 動物をチャンバーの反対側に置き、食品ペレットから離します。
    6. タイマーをすぐに開始します。
    7. マウスは、最大12分間チャンバーを探索してみましょう。
    8. 食物ペレットに近づき、餌を与える待ち時間(動物は噛んで食べる必要があります)を測定します。
      1. 動物がペレットの近くに来て、それを嗅ぎ、噛まないときにアプローチであると考えてください。
      2. 動物がペレットを消費し始めるときのように一口を定義します。
    9. 数秒でペレットにアプローチし、餌を与える待機時間を記録します。
    10. マウスが食品ペレットに供給されたら、チャンバーからマウスを取り出します。
    11. 寝具を捨てるが、マウスホームケージで食欲ドライブをテストするために使用されるペレットを保存します。
    12. 次の動物のためにチャンバーをリセットし、次の動物に進みます。
    13. チャンバー内の試験終了後15分、試験中に使用したペレットを、マウスのホームケージ内に、ケージの前面の壁に当てはめます。
    14. ペレットがホームケージに入っているときにペレットを供給するレイテンシを測定します。これは食欲のドライブのための尺度です。
      1. 巣の材料を取り除き、そのケージに落とされるペレットをマウスが見るようにすることが好ましい。

12. 血清採取およびコルチコステロン測定

  1. 採血の15分前に割り当てられた技術を使用して1分間動物を扱う(これは、マウスを再グループ化するときの戦いのリスクを念頭に置いて、グループ収容動物または単一の収容動物で行うことができる)。
    1. トンネルで取り扱ったマウスの場合は、マウスをトンネルに案内し、トンネルをケージから1分間持ち上げ、ケージ内のマウスを交換します。
    2. 尾の処理マウスの場合は、マウスの尾部のベースをつかみ、そのケージからマウスを取り外します。マウスを実験者の袖に1分間移動し、マウスを尾部処理でケージに戻します。
    3. 3D 処理マウスの場合は、カップを使用してケージからマウスを取り外します。カップに入ったマウスを1分間手に持ち、ケージに戻します。
  2. 取り扱い後15分、顎下静脈22から採血を進める。
  3. マウスの頭部がしっかり固定化される様に、マウスをしっかりと擦り切る。
  4. 穿刺の部位を見つけます。
    1. 穿刺部位を見つけるためのランドマークとして使用できる顔の下顎に沿って小さな無毛のディンプルがあります。顎の基部とこのディンプルの間に線を引く穿刺部位は、顎のヒンジのすぐ後ろにある約5mmで耳に向かってこのディンプルの後ろにあります。
  5. 穿刺部位に垂直にきれいな23 Gの針を保持し、速いしっかりした傾斜運動を使用する。針の先端は1〜2mmの深さまで浸透する必要があり、静脈が穿刺されるとすぐに血液が流れます。
  6. EDTA被覆の集金管に約150μLの血液を採取し、氷の上に保管してください。
  7. 滅菌ガーゼパッドでわずかな圧力を穿刺部位に5s以上塗布し、血液を凝固させます。
  8. 血液が凝固したら、マウスを自宅のケージに戻します。
  9. 遠心分離機血液を4°C3,500 x gで10分間用いた。
  10. 上清をデカントします。
  11. 下流解析のために上清を-20 °Cで保管してください。
  12. メーカーのプロトコルに従ってコルチコステロンELISAキットを使用してコルチコステロンレベルを測定します。
  13. 分光光度計を使用してELISAの結果を読み取ります。

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結果

2つの別々の研究をC57BL/6マウスで行った。研究#1には生後6ヶ月の男性が含まれており、研究#2にはジャクソン研究所(猫#000664)の生後2.5ヶ月の女性(N=36/研究)が含まれていました。マウスは2ヶ月の年齢で施設に到着しました。研究#2女性は到着の2週間後に処理され、テストされましたが、研究#1男性は6ヶ月(世界的なパンデミックシャットダウンによる遅延)で処理され、テストされました。この間、試験#2のマウスが1本死亡し、実験の処理を開始した。研究は、雄のマウスが動物施設のスタッフによって世話されたことを#1しました。すべてのマウスは、食料と水のアドリビタムへのアクセスを与えられた12時間の明暗サイクル(7:00 ON、19:00 OFF)で維持されました。彼らのホームケージは、寝具材料としてリサイクルされた新聞だけでなく、ネスティング材料で満たされていました。マウスは、取り扱いセッション中または採血または行動検査などの処置後にグループ収容の雄の潜在的な苦痛行動を制限するために、個別に収容された。マウスは、尾の取り扱い、トンネル処理、3Dハンドリングの3つのグループに無作...

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ディスカッション

この研究と方法の開発は、マウスの取り扱い技術は依然として科学界によって見落とされており、実験前に動物のストレスや反応性を軽減するための習慣や取り扱い技術を実装することに消極的であるという観察に基づいています。時間の約束を表しながら、動物の取り扱いは、実施される実験の成功に寄与する可能性のある動物に有益な効果を提供し、データ変動性または動物の過剰反応性のために実験を複数回行わなければならないことを防ぎます。3Dハンドリング技術の使用は、マウスの脱出の試みを減少させた。また、実験者との相互作用が増加し、6ヶ月齢の雄マウスにおける不安様型の減少も起きました。さらに、3D処理は、わずか3日間の取り扱い後、生後2.5ヶ月の雌マウスにおけるデータ変動性の低下とコルチコステロンレベルの低下を示した。このアプローチは、よりスムーズな輸送と容易な介入を促進する実験者による取り扱いにマウスを習慣化するために穏やかな操作に依存しています。

3Dハンドリング技術から強調する価値のある何かは、上記および 表1で説明したマイルストーンの達成に応じて、マウスの反応性に応じて処理...

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開示事項

著者らは開示する利益相反を持っていません。

謝辞

著者らは、この作業を支援してくれたCAMHの動物ケア委員会と、手順の有用性に関する広範なフィードバックを提供したCAMHの動物介護者に感謝し、説明された実験の実行を動機づけ、他のユーザーのための詳細なプロトコルを提出する。この作品は、TPに授与されたCAMHブレイクスルーチャレンジとCAMHからの内部資金によって資金提供された部分でした。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
23 G x 1 インチBD PrecisionGlideは、一般的な滅菌皮下注射針です。レギュラーウォールタイプとレギュラーベベル。BD2546-CABD305145採血用針
BD Vacutainer®ラベンダーBDヘモガード&貿易と静脈採血EDTAチューブ;クロージャー、2.0ml(13x75mm)、100個入りBD367841EDTA採血用コーティングチューブ
ベッドo COBS ¼”トウモロコシの穂軸実験用動物寝具Bed-O-CobsBEDO1/4新規性のための新しい寝具 抑制された摂食
遠心分離機EppendorfCentrifuge 5424 R血液の遠心分離用。
コルチコステロンELISAキットアーバーアッセイK003-H1W
デジタルカメラパナソニックHC-V770カメラ EPM/エクスペリメンターの相互作用を記録するカメラ
エレベーテッドプラス迷路ホームメイド/aカスタム迷路 4つの黒いプレキシガラスアーム(2本の開いたアーム(2本の開いたアーム(長さ29cm×幅7cm、高さ16cm))で作られたカスタム迷路で、2本の開いたアームが互いに反対側にある十字形を形成しています床から55 cm上に保持
エタノールMedstore ハウス ブランド39753-P016-EA95蒸留水で70%に希釈し、
Ethovision XT 15Noldusn/a自動動物追跡ソフトウェア
実験室 げっ歯類ダイエットLabDietげっ歯類ダイエット 5001標準げっ歯類ダイエット
メモリーカードキングストーンテクノロジーSDA3/64GBビデオ録画用そしてファイル転送
ノベルティ抑制給餌室自家製n/a透明な床と壁を持つカスタムテストプレキシガラステストチャンバー 長さ62cm、幅31cm、高さ40cm。
Parlycarbonate自家製n / a長さ13cm、直径5cm
ピュリナ昨日sニュースリサイクル新聞寝具ピュリナn / a標準寝具
分光光度計Biotekポックマイクロプレートリーダー
nチューブのエ

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