マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用

サマリー

硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。

要約

神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。

概要

蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です^1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています¹、^2、3、⁴、⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、¹³、^14、15、16。最初の小型化された一光子蛍光顕微鏡(ミニスコープ)は、2011年にMark Schnitzerらによって設計されました⁵。このミニスコープにより、研究者は自由に行動する動物⁵の小脳細胞の蛍光ダイナミクスをモニターできます(つまり、動物への身体的拘束、頭部拘束、鎮静、または麻酔なし)。現在、この技術は、皮質6,8,15,16などの表在脳領域を監視するために適用することができる。背海馬8,11,13,14および線条体^6,17などの皮質下領域。腹側海馬¹⁴、扁桃体10,18、視床下部^8,12などの脳深部領域。

近年、いくつかのオープンソースのミニスコープが開発されています^{4,5,6,7,11,13,17,19}.ミニスコープは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームが提供する段階的なガイドラインに従っていれば、研究者が経済的に組み立てることができます。^4,7,11,13.神経活動の光学的モニタリングは光透過の限界によって制限されるため⁷ 関心のあるニューロン集団との間で、リレーGRINレンズ(またはリレーレンズ)から中継される視野を拡大するために、対物レンズ勾配屈折率(GRIN)レンズ(または対物レンズ)をミニスコープの下部に事前に固定する必要があるミニスコープが設計されました。^{6,7,8,10,16,17}.このリレーレンズは、標的脳領域の蛍光活動がリレーレンズの表面に中継されるように、標的脳領域に埋め込まれる。^{6,7,8,10,16,17}.正弦波周期の約1/4の光が対物レンズ(~0.25ピッチ)を通過します(図 1A1)、拡大蛍光画像が得られます^6,7.対物レンズは必ずしもミニスコープの下部に固定されているわけではなく、リレーレンズの埋め込みも必要ありません。^6,7,11,13,15.具体的には、ミニスコープに固定された対物レンズと脳に埋め込まれたリレーレンズの2つの構成があります。^{8,10,12,14,16} (図 1B1)と取り外し可能な対物レンズだけの別のレンズ^6,7,11,13,15 (図 1B2).固定対物レンズと埋め込み型リレーレンズの組み合わせに基づく設計では、脳からの蛍光信号がリレーレンズの上面に運ばれます(図 1A1)^{7,8,10,12,14,16}.その後、対物レンズは、リレーレンズの上面から視野を拡大して透過させることができます(図 1A2).一方、取り外し可能な対物レンズGRINレンズの設計はより柔軟であるため、脳へのリレーレンズの事前埋め込みは必須ではありません(図 1B2)^6,7,11,13,15.取り外し可能な対物レンズ設計に基づくミニスコープを使用する場合、研究者はターゲットの脳領域にレンズを埋め込む必要がありますが、対物レンズを埋め込むこともできます^6,7,11,13,15 または脳内のリレーレンズ^6,7.移植用の対物レンズまたはリレーレンズの選択によって、研究者が使用しなければならないミニスコープの構成が決まります。たとえば、V3 UCLAミニスコープは、取り外し可能な対物レンズGRINレンズ設計に基づいています。研究者は、関心のある脳領域に対物レンズを直接埋め込み、「空の」ミニスコープを対物レンズに取り付けるかを選択できます。^6,7,11,13,15 (一眼システム; 図 1B2)または、脳にリレーレンズを埋め込み、対物レンズで事前に固定されたミニスコープを取り付ける^6,7 (2レンズシステム; 図 1B1).次に、ミニスコープは蛍光カメラとして機能し、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターによって生成されたニューロン蛍光のライブストリーム画像をキャプチャします^1,2,3.ミニスコープをコンピュータに接続すると、これらの蛍光画像をコンピュータに転送し、ビデオクリップとして保存できます。研究者は、いくつかの分析パッケージで蛍光の相対的な変化を分析することにより、ニューロン活動を研究できます^20,21 または、将来の分析のためにコードを記述します。

V3 UCLAミニスコープは、ユーザーが1レンズまたは2レンズシステムでニューロン活動を画像化するかどうかを決定できる柔軟性を提供します⁷。記録システムの選択は、ターゲット脳領域の深さとサイズに基づいています。簡単に言うと、1レンズシステムは、メーカーが特定のサイズの対物レンズしか製造していないため、表面的(深さ約2.5 mm未満)で比較的大きい(約1.8 x 1.8 mm²より大きい)領域しか撮像できません。対照的に、2レンズシステムは、任意のターゲット脳領域に適用できます。しかし、地板を接着するための歯科用セメントは、対物レンズとリレーレンズの距離が変わるとズレが発生しやすく、画質が低下します。2レンズシステムを使用する場合、最適な画像品質を達成するために、2つの作動距離を正確にターゲットにする必要があります(図1A)。これらの2つの臨界作動距離は、ニューロンとリレーレンズの底面の間、およびリレーレンズの上面と対物レンズの底面の間です(図1A1)。レンズの位置がずれたり、作動距離外にずれたりすると、イメージングに失敗します(図1C2)。対照的に、ワンレンズシステムは1つの正確な作動距離しか必要としません。しかし、対物レンズのサイズは、脳深部領域のモニタリングへの用途を制限します(ミニスコープに適合する対物レンズは約1.8~2.0mm^です6,11,13,15)。したがって、マウス11、¹³における皮質^6、15および背角アンモニス1(^CA1)などの表面および比較的大きな脳領域の観察のための対物レンズの移植は制限される。さらに、背側CA1を標的とするために皮質の広い領域を吸引する必要があります^11,13。脳深部領域のイメージングを妨げる1レンズ構成の制限により、市販のミニスコープシステムは対物レンズ/リレーレンズ(2レンズ)を組み合わせた設計のみを提供します。一方、V3 UCLAミニスコープは、対物レンズが取り外し可能であるため、1レンズまたは2レンズのいずれかのシステムに変更することができます6,11,13,15。つまり、V3 UCLAミニスコープのユーザーは、脳の表面観察(深さ2.5 mm未満)を含む実験を行うときに、脳に埋め込む(ワンレンズシステムを作成する)、またはミニスコープに事前に固定してリレーレンズを脳に埋め込む(2レンズシステムを作成する)ことで、取り外し可能なレンズを利用できます。 脳深部観察を含む実験を行う場合。2レンズシステムは脳の表面観察にも適用できますが、研究者は対物レンズとリレーレンズの間の正確な作動距離を知っている必要があります。1レンズシステムの主な利点は、2レンズシステムで最適な画像品質を達成するために正確にターゲットを絞る必要がある2つの作動距離があることを考えると、2レンズシステムよりも作動距離を逃す可能性が低いことです(図1A)。したがって、表面的な脳の観察にはワンレンズシステムを使用することをお勧めします。ただし、実験で脳深部でのイメージングが必要な場合、研究者は2つのレンズのずれを回避することを学ぶ必要があります。

実験用ミニスコープの2レンズ構成の基本プロトコルには、レンズの埋め込みとベースメッキ^{が含まれます}8,10,16,17。ベースプレーティングとは、ベースプレートを動物の頭に接着して、ミニスコープを最終的に動物の上に取り付け、ニューロンの蛍光信号をビデオテープに収めることです(図1B)。この手順では、歯科用セメントを使用してベースプレートを頭蓋骨に接着しますが(図1C)、歯科用セメントの収縮は、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離に許容できない変化を引き起こす可能性があります^8,17。2つのレンズ間の距離が大きすぎると、セルに焦点を合わせることができません。

ミニスコープを用いた脳深部カルシウムイメージング実験の詳細なプロトコルはすでに公開されています^8,10,16,17.これらのプロトコルの作成者は、Inscopixシステムを使用しています^8,10,16 または他のカスタマイズされたデザイン¹⁷ ウイルスの選択、手術、およびベースプレートの付着に関する実験手順について説明しました。ただし、それらのプロトコルは、V3 UCLAミニスコープシステム、NINscopeなどの他のオープンソースシステムに正確に適用することはできません。⁶、およびフィンチスコープ¹⁹.2つのレンズのミスアライメントは、ベースプレートを頭蓋骨にセメントで固定するために使用される歯科用セメントの種類が原因で、UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成での記録中に発生する可能性があります。^8,17 (図 1C).本プロトコルが必要なのは、埋込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離が、ベースプレーティング手順中の歯科用セメントの望ましくない収縮のためにシフトする傾向があるためです。ベースプレーティングでは、ミニスコープとリレーレンズの上部の間の距離を調整して、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の最適な作動距離を見つける必要があり、この理想的な位置にベースプレートを接着する必要があります。対物レンズと埋め込みリレーレンズの正しい距離を設定すると、セル分解能(図 1B; in vivo 録音)。リレーレンズの作動距離の最適範囲が小さいため(50〜350μm)^4,8、硬化中の過度のセメント収縮は、対物レンズと埋め込みリレーレンズを適切な範囲内に保つことを困難にする可能性があります。このレポートの全体的な目標は、収縮の問題を減らすためのプロトコルを提供することです。^8,17 ベースプレーティング手順中に発生し、2レンズ構成での蛍光信号のミニスコープ記録の成功率を高めます。成功したミニスコープ記録は、自由に行動する動物における個々のニューロンの蛍光の顕著な相対的変化のライブストリームの記録として定義されます。歯科用セメントのブランドが異なれば収縮率は異なりますが、研究者は以前にテストされたブランドを選択できます^{6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22}.ただし、一部の国/地域では、医療材料の輸入規制により、すべてのブランドを簡単に入手できるわけではありません。したがって、利用可能な歯科用セメントの収縮率をテストする方法を開発し、重要なことに、収縮の問題を最小限に抑える代替プロトコルを提供します。現在のベースプレーティングプロトコルに対する利点は、実験室で簡単に入手できるツールとセメントを使用したカルシウムイメージングの成功率の向上です。例としてUCLAミニスコープが使用されますが、プロトコルは他のミニスコープにも適用できます。このレポートでは、最適化されたベースメッキ手順について説明し、UCLAミニスコープ2レンズシステム(図 2A).UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成の移植成功例(n=3匹)と移植失敗例(n=2匹)を、成功と失敗の理由について議論とともに紹介します。

プロトコル

この研究で実施されたすべての手順は、国立台湾大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号:NTU-109-EL-00029および NTU-108-EL-00158)。

1. 歯科用セメントの体積変化の評価

注意: 歯科用セメントの量の変化は、硬化プロセス中に発生します。移植とベースメッキの前に、歯科用セメントの体積変化をテストします。研究者は、あらゆるブランドの歯科用セメントをテストし、体積変化が最も少ないブランドを使用して地板をセメントで固めることができます。 図 3 に例を示します。

1. 各歯科用セメント粉末0.5 gを計量し、適切な溶液(1 mL)と混合します。
   注意: 歯科用セメントの説明書で推奨される粉末/液体の比率は、固体の形を得るために0.5 gの粉末と0.25 mLの溶液です。この試験プロトコルは、ピペットチップの容量変化を測定するために混合物を液体の形で吸引できるように、比率を0.5 g/mLに希釈します。
2. 0.1〜10 μLのピペットチップを使用して2.5 μLの歯科用セメント混合物を除去し、次にピペットチップを光硬化型接着剤で密封します。
3. チップをラックに置き、歯科用セメント混合物の最上位レベルをマークし、40分後に歯科用セメント混合物のレベルを測定します(補足ビデオS1)。
4. チップの歯科用セメント硬化中のレベル変化を監視することに加えて、残りの乾燥歯科用セメント密度を測定します。密度を計算するには、歯科用セメントの重量を測定し、アルキメデスの原理で体積を測定します。
   1. 簡単に言えば、残りの乾いた歯科用セメントを水で満たされたカップに入れ、あふれた水を量ります。
5. 以下に詳述するすべてのプロトコルで収縮が最も少ない歯科用セメントを使用してください。

2.麻酔、外科的移植、ウイルス注入、およびダミーベースメッキ

1. 麻酔
   注:本レポートは、UCLAミニスコープの手術とベースメッキ手順を最適化することを目的としています。したがって、標的脳領域に感染するための最適なウイルス力価が既知であると仮定した。最適なウイルス力価を見出すための方法は、Resendezらのステップ1〜5に見出すことができる。⁸.ウイルス希釈が最適化されると、外科的移植を開始できます。
   1. マウスを誘導容器に入れ、酸素を供給します(0.2 L / minの空気流量で100%)。マウスを5〜10分間予備酸素化します。
   2. マウスがバランスを崩し始め、最終的に麻酔されるまで、100%酸素(気流速度:0.2 L / min)と混合した5%イソフルランを投与します。
   3. マウスを誘導室から取り出し、アトロピン(0.04 mg / kg;皮下注射)を注射して、唾液と鎮痛剤としてのブプレノルフィン(0.03 mg / kg;皮下注射)の蓄積を防ぎます。
   4. マウスの頭を剃ります。
   5. マスク、滅菌ガウン、手袋を着用してください。手術用の無菌空間と無菌手術器具を準備します。脳定位固定装置でマウスの頭を安定させます(このステップの間、3〜2.5%のイソフルランで麻酔を維持します)。鎮痛および麻酔処置の後、イヤーバーが頭をしっかりと安定させていることを確認してください。熱サポートを提供します。
   6. 頭がまっすぐな位置にセットされていることを確認し、剃った頭をベタジンで滅菌してから、局所鎮痛剤であるキシロカイン(10%)を頭にスプレーします。
   7. 乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を塗ります。
      注意: 眼の損傷を防ぐために、すべての麻酔イベント中に目の保護のために眼科用軟膏を使用してください。
   8. 後ろ足をつまんで動物の深い痛みの反射をテストします。動物が足の離脱反射を示さなくなったら、外科的処置に進みます。
   9. 頭蓋骨の矢状面の中央に沿って小さな切開を行います(ブレグマの約2 mm前方から始まり、ブレグマの約6 mm後方で終わります)。次に、頭蓋骨の結合組織をきれいにし、3本のステンレス鋼のネジを左前頭骨と頭頂間骨に固定します。
      1. この時点で、イソフルランを1〜2%に減らす。外科手術全体を通して呼吸数を監視します。呼吸数が遅すぎる場合(動物によって異なりますが、約1 / s)、イソフルランの濃度を下げます。.
   10. 手術用顕微鏡または実体顕微鏡下でリレーレンズ移植の開頭術は、先端直径0.7mmのバリドリルを使用して実行します。マイクロドリルを使用してバリドリルビットをつかみ、目的の円領域の輪郭を描きます(頭蓋骨の全厚さを貫通する必要はありません)。
       注:本プロトコルで使用されているリレーレンズは、直径1.0 mm、長さ~9.0 mm、ピッチ1、作動距離範囲は~100 μm〜300 μmでした。したがって、開頭術の直径は1.2 mmでした。
       1. 硬膜が露出するまで輪郭をゆっくりと深くします。
       2. 3 mLシリンジで3 mLの滅菌生理食塩水を調製し、アイスバケットで冷却します。注射器から0.1mLの生理食塩水で露出部分を頻繁にすすぎ、その領域を冷却し、熱による損傷や出血を防ぎます。
   11. 27Gの針で硬膜を軽く摘み取り、はがします。
   12. 先端から1mmのところにある27Gの鈍い針にマーキングを付け、それを使用して脳の皮質を注意深く吸引し、水晶体移植用の窓を作成します8,11,13,17(図2B1)。必要に応じて、27 Gの注射針の先端をサンドペーパーで削って鈍い針を作ります。次に、針を注射器に接続し、注射器をチューブに接続し、チューブを吸引源に接続して真空を作ります。
       注意: リレーレンズは鈍く、脳深部に配置すると脳組織を圧迫します。したがって、皮質の吸引は、リレーレンズ移植による組織損傷を減少させる。マウスの皮質の厚さは約1 mmですが、実体顕微鏡で視覚化することは困難です。マークは、実体顕微鏡のみの場合よりも正確に針の深さを決定できるランドマークを作成します。さらに、抵抗に応じて皮質領域に到達したか通過したかを判断できます。皮質の上部は比較的柔らかく感じられますが、皮質下領域は密に感じます。したがって、テクスチャが濃く感じられたら、吸引を停止します(図2B3)。
   13. 3 mLシリンジで3 mLの滅菌生理食塩水を調製し、アイスバケットで冷却します。生理食塩水でその領域をすすぎ、出血を止め、脳浮腫の可能性を減らします。
2. アデノ随伴ウイルス(AAV)注射
   注:本実験ではAAV9-syn-jGCaMP7s-WPREを使用しました。jGCaMP7sは、緑色蛍光を発する遺伝的にコードされたカルシウム指示薬です³。本研究では野生型マウスを対象としたため、緑色蛍光カルシウム指標遺伝子をニューロンにトランスフェクトし、発現を可能にするためにウイルスベクターが必要でした。緑色蛍光カルシウムインジケーターを発現するトランスジェニックマウスを被験者として使用する研究者は、プロトコル2.2をスキップできます。
   1. 20 Gの静脈内(i.v.)カテーテルの内側の針を脳固定装置アームに取り付け、適切な座標(リレーレンズ移植時と同じ座標)で脳をゆっくりと穿刺します(~100〜200 μm/分)(図2B3)。
   2. マイクロインジェクション針を100-200 μm/minの速度で腹側CA1に下げ、200 nLのウイルスベクターを標的領域に注入(~25 nL/分)します(ブレグマから-3.16 mm AP、3.25 mm ML、および-3.50 mm DV)。
   3. ウイルスが拡散し、逆流を最小限に抑えるまで10分間待ちます。
   4. マイクロインジェクションニードルを引き抜く(~100-200μm/分)。
3. リレーレンズ埋め込み
   1. リレーレンズを75%アルコール^10,16で消毒してから、パイロジェンフリーの生理食塩水ですすいでください。移植されるまで、レンズを冷たいパイロジェンフリーの生理食塩水に浸します。
      注:コールドレンズは、脳に入れたときの脳浮腫を最小限に抑えます。
   2. 歯が熱収縮チューブで覆われているマイクロブルドッグクランプ(図2B3)を使用してリレーレンズを保持します。
      注意: ブルドッグクランプは、レンズを損傷することなくしっかりと保持できます。チューブで覆われたブルドッグクランプの作成方法については、Resendezら⁸ を参照してください。
   3. リレーレンズをターゲット領域(ブレグマから-3.16 mm AP、3.50 mm ML、-3.50 mm DV)の上にゆっくりと置き(~100 - 200 μm/min)、歯科用セメントで安定させます。
4. ダミー下地めっき
   注:移植手術中の「ダミーベースメッキ」の目的は、数週間後の実際のベースメッキ手順中に塗布する必要のある歯科用セメントの量を減らすために、歯科用セメントベースを作成することです。このようにして、歯科用セメントの体積の変化のリスクが最小限に抑えられます。
   1. 対物レンズをミニスコープの下部に固定し、ベースプレートをミニスコープに組み立てます(このステップでは、固定された対物レンズ、ベースプレート、およびミニスコープのアセンブリはまだマウスの頭蓋骨の上に配置されていません)。
   2. 地板の外側に10cmのパラフィンフィルムを巻き付けます(図4A)。
   3. 再利用可能な接着粘土を使用して、脳定位固定装置アームプローブでミニスコープを保持します。
   4. 対物レンズをリレーレンズの上に合わせ、レンズ間のスペースをできるだけ小さくします(図4B)。
   5. 歯科用セメントを使用して、ベースプレートの位置を固定します(セメントがパラフィンフィルムにのみ接触するように)。
   6. 歯科用セメントが乾いたら、フィルムを取り除きます。
   7. ベースプレートとミニスコープを取り外します。歯科用セメントベースは中空です(図4B)。
   8. リレーレンズを日常の活動やマウスによる引っかき傷から保護するために、リレーレンズが覆われるまでリレーレンズを成形シリコーンゴムで密封し、シリコーンゴムを歯科用セメントの薄層で覆います(図4B)。
   9. マウスを定位固定装置から外し、マウスを回収チャンバーに入れます。
   10. 鎮痛にはカルプロフェン(5 mg / kg;皮下注射)またはメロキシカム(1 mg / kg;皮下注射)を注射し、感染を防ぐためにセフタジジム(25 mg / kg;皮下注射)を注射します。.
       注:抗生物質の使用は、無菌技術に代わるものではありません。周術期の抗生物質(すなわち、セフタジジム)は、長期間の手術や慢性インプラントの配置など、特定の状況で適応となる場合があります。.
   11. 胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。
   12. マウスを個別に飼育し、メロキシカム(1 mg / kg、皮下注射、q24h)を1週間注射して、術後の痛みを和らげます。手術後、毎日動物をチェックして、正常に食べたり、飲んだり、排便したりしていることを確認してください。
   13. 3週間以上後にベースプレーティングを行います。

3.ベースメッキ

注:通常、ベースプレーティング手順(図5)は、回収とウイルスのインキュベーション時間のために、最初の手順から2〜3週間以内に実行できません。ベースプレーティングの誘導手順は、手順2.1.1〜2.1.8で説明した手順と同様です。しかしながら、ベースプレーティングは侵襲的な手順ではなく、動物は軽い鎮静のみを必要とする。したがって、動物が定位固定装置フレーム上を移動できない限り、0.8〜1.2%のイソフルランで十分である。加えて、比較的軽いイソフルラン麻酔はまた、モニタリング⁸ (補足ビデオS2)の間のニューロンの蛍光過渡性の発現を促進するのを助け得る。

1. 歯科用セメント屋根の薄層を骨ロンジャーで慎重に切断し、シリコーンゴムを取り除きます。リレーレンズの表面を75%アルコールで清掃します。
2. ベースプレートの横にある止めネジを締めて、ミニスコープの下部に固定します(図5A1)。
   注意: ベースプレートは、締め付けたベースプレートと軽く固定したベースプレートの違いにより、距離に一貫性がなくなる可能性があるため、ミニスコープの下部の下でしっかりと締める必要があります。
3. フォーカススライドをメインハウジングから約2.7〜3mmになるように調整します(図5A2)。
   注:ベースメッキ手順中に長さをさらに調整できますが、ミニスコープの長さと、埋め込まれたリレーレンズと事前に固定された対物レンズの間の最適な長さを同時に調整すると非常に混乱するため、約2.7mmに固定してください。
4. ミニスコープをデータ収集ボードに接続し、コンピュータのUSB 3.0(またはそれ以降のバージョン)ポートに接続します。
5. UCLAチームが開発したデータ集録ソフトウェアを実行します。
6. 露出を255に、ゲインを64倍に、励起LEDを5%に調整します。これらの設定は、初期ベースメッキに推奨されます。特定の設定は、脳領域および遺伝的にコードされたカルシウム指標の発現レベルによって異なります。
7. [接続]ボタンをクリックして、ミニスコープをデータ収集ソフトウェアに接続し、ライブストリームを視聴します。
8. ミニスコープの対物レンズをリレーレンズに手で合わせ、蛍光信号の検索を開始します(図5B₁)。
   注:最初に、蛍光シグナルを手動で検索すると、調整が容易になります。遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現するためにAAVシステムが使用されたため、プロモータータイプとAAV血清型の両方がトランスフェクションの効率に影響を与えました^23,24。研究者は、将来の実験に進む前に、蛍光の変化を示す個々のニューロンを見つけることによって、カルシウムインジケーターの発現を確認する必要があります。
9. ミニスコープを塞ぐ場所に歯科用セメントをドリルで開けます(オプション)。
10. データ収集ソフトウェアのライブストリームを視聴し、リレーレンズの余白を目印として使用します(補足ビデオS2)。リレーレンズの余白は、モニター上で月のような灰色の円として表示されます(図5B1、白い矢印)。
11. リレーレンズが見つかったら、蛍光信号が見つかるまでミニスコープのさまざまな角度と距離を慎重に調整します。
    注:ニューロンの画像は背景よりも白くなっています。正確なニューロンの形状は、ニューロンがリレーレンズの焦点面に完全に横たわっていることを示します。丸いニューロンは、それらが焦点面の近くにいたことを示唆しています。脳全体で神経細胞の形状が異なるが、ここでは腹側CA1が一例として示されている。
12. 個々のニューロンが時間の関数として蛍光の変化を示さない場合は、ベースをシリコーンゴムで再シールします。潜伏期間はウイルス²³、²⁴の性質にも依存するため^、蛍光は観察されない。さらに1週間後に手順3.1〜3.12を実行します。(これはオプションです)。
13. ミニスコープを最適な位置に保持し、再利用可能な接着粘土を備えた定位固定装置アームをミニスコープに向かって動かします(図5B2)。ミニスコープを再利用可能な粘着粘土で定位固定装置アームに接着します。
14. x、y、zアームを少し調整して、最適なビューを検索します(補足ビデオS2)。次に、イヤーバー、歯バー、または再利用可能な接着粘土をz軸で回して、対物レンズとリレーレンズの表面間の角度を調整します。ウイルス発現および水晶体移植は、少なくとも1つの細胞が蛍光トランジェントを示す場合に成功する(図6A;補足ビデオS2)ベースプレーティング中(CA1などの脳の領域にも依存する)。
    メモ: モニタに白いセルのみが表示され、トランジェントが表示されない場合は、別の原因があります(図6B、C、補足ビデオS4、S5、結果セクション、およびトラブルシューティングセクションを参照)。
15. ベースプレート(図5B2)を歯科用セメントでセメントで固めます。
16. セメンチング中に関心領域を監視して、最適な位置が変化しないことを確認します。
17. ベースプレートを歯科用セメントベースにしっかりと接着しながら、可能な限り最小限の量のセメントを使用します(図5B2)。地板の周りに2層目と3層目のセメントを塗布しますが、GRINレンズに影響を与えないように注意してください。
    注意: ダミーメッキ手順中にベースプレートのベースが形成されているため、このステップではベースプレートにセメントを塗布する方が簡単です。
18. セメントが硬化したら、ミニスコープをベースプレートから慎重に取り外します。次に、保護キャップをねじ込みます。
19. 動物を回復ケージに移動します。胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物を観察します。
20. ハウスマウスを個別に。毎日普通に食べたり、飲んだり、排便したりしていることを確認してください。マウスが完全に回復するまで5日間待ってから、カルシウムイメージングを確認します。
    注意: ベースプレートを保持している歯科用セメントはごくわずかです。したがって、ベースメッキ手順以降、ベースプレートが大幅にずれている場合は、ドリルで歯科用セメントを取り除き、再度ベースメッキ手順を実行してください。
21. 麻酔をかけ(ケタミン(87 mg / kg)/キシラジン(13 mg / kg)混合物の腹腔内注射による)、すべての実験が完了したら動物に²⁵ を灌流します。.

結果

歯科用セメントの体積変化の評価
歯科用セメントの体積は硬化プロセス中に変化するため、GRINレンズの作動距離が約50〜350μmであることを考えると、画像品質に大きな影響を与える可能性があります^4,8。したがって、この場合、移植および下地めっき手順の前に、2つの市販の歯科用セメント、テンプロンとトクソがテストされました(図5)。最初にビデオを評価してセメントが収縮したかどうかを確認し、次に完全に乾燥したときのセメントの体積を比較しました。歯科用セメントの初期混合物の同じ濃度および量をピペットチップに装填し、ビデオテープを貼った(補足ビデオS1)。ビデオS1は、両方のセメントが乾燥プロセス中に収縮したことを示しました。特捜はテンプロンよりも優れた性能を発揮しました(つまり、縮小後もテンプロンよりも体積が大きかった):図3B;テンプロ...

ディスカッション

本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上させるために、ミニスコープシステムの他のバージョンにも使用できます。ウイルス注入に関する一般的な問題、およびミニスコープのバージョンに関係なく修正する必要があるレンズ埋め込みの他に、UCLAベースプレートの構造は位置シフトを引き起こす可能性があり、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離の不一致につながる可能性があります(図1C)。2つのレンズの位置シフトを最小限に抑えるために、修正された実験プロトコルが開発されました(図2、図 4、 図5)。カルシウムイメ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.7 mmドリルビット	#19008-07	ファインサイエンスツール;手術	のための
0.1–10 μlピペットチップ	104-Q;QSP	フィッシャーサイエンティフィック;歯科	用セメント
20 G IVキャター	#SR-OX2032CA	テルモコーポレーション;東京、日本	、手術用
27 G ニードル	AGANI、AN*2713R	テルモ株式会社;東京、日本	外科用
AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#	104487-AAV9; 1.5*10^13	Addgene viral prep;マサチューセッツ州、ウイルス	注射用
米国アトロピン硫酸塩		アスタート;台湾・新竹	市、手術用/ダミーベースメッキ/ベース
メッキ ベースプレート	V3	http://miniscope.org	ダミーベースメッキ/ベースメッキ用
BLU TACK	#30840350	Bostik;米国マサチューセッツ州チェルシー	再利用可能な接着粘土; 手術用/ダミーベースメッキ/ベースメッキ
ボーンロンガーフリードマン	13 cm	ディーナー;ドイツ、トゥットリンゲン、
ブプレノルフィン		INDIVIORのベースメッキ。手術	のための
Carprofen	Rimadyl	Zoetis;ペンシルベニア州エクストン	鎮痛剤
Ceftazidime		台湾バイオテクノロジー;台湾	感染を防ぎます
UCLAミニスコープのデータ収集PCB	https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq		でベースメッキのために
歯科用セメントセット	Tempron	GC Corp;東京、	日本、歯科用セメントの試験用
歯科用セメントセット	Tokuso Curefast	Tokuyama Dental Corp.;東京、日本、	歯科用セメント/手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティングのテスト用
ラボスタンダードとマウスとラットアダプター#	51673	Stoelting Co;米国イリノイ州	手術用/ダミーベースメッキ/
デュラテア軟膏		アルコンのベースプレーティング。ジュネーブ、スイス	、手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング
Ibuprofen		YungShin;台湾	鎮痛剤
イソフルラン		パニオン&BFバイオテック株式会社;台湾桃園、	手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング
Inscopix	nVistaシステム	Inscopix;カリフォルニア州パロアルト	V3 UCLA Miniscope
Ketamine		Pfizerとの比較用)NY、	NY安楽死手術
のための	通常の生理食塩水
マイクロブルドッグクランプ#	12.102.04	Dimedo;Tuttlingen、レンズ	移植のための
リットルマイクロシリンジ、2.0 µL、25ゲージ	#88400	ハミルトン;ボナドゥーツ、ウイルス
射出成形シリコーンゴム	ZA22 Thixo	Zhermackのためのスイス。Badia Polesine、ダ	ミーベースプレーティング
Objective Gradient index(GRIN)レンズ	#64519	Edmund Optics;ニュージャージー州、	米国、ダミーベースメッキ/ベースメッキ
パラフィルム	#PM996	ベミス。ニーナ、ダ	ミーベースメッキ用
米国ポータブル吸引	#DF-750	Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc.、台中、台湾	手術用
リレーGRINレンズ	#1050-002177	Inscopix;パロアルト、カリフォルニア州、米国	、ダミーベースメッキ用、
ステンレス鋼アンカーネジ	直径1.00mm、手術用全長3.00mm
顕微鏡	#SL720	セージビジョン;台湾の新北市、	手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング
Stereotaxic apparatus	#51673	Stoelting;イリノイ州、手術	用/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング
UV硬化接着剤	#3321	ロックタイト;Düドイツ、セルドルフ、	歯科用セメント
V3 UCLAミニスコープ	手術/ダミーベースメッキ/ベースメッキのために	https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components
キシラジン	X1126	Sigma-Aldrich; 安	楽死のために
キシロカインポンプスプレー10%		アストラゼネカ;Södertälje, スウェーデン	手術用