硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。
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この記事について
サマリー
要約
神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。
概要
蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、<....
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プロトコル
この研究で実施されたすべての手順は、国立台湾大学動物管理使用委員会によって承認されました(承認番号:NTU-109-EL-00029および NTU-108-EL-00158)。
1. 歯科用セメントの体積変化の評価
注意: 歯科用セメントの量の変化は、硬化プロセス中に発生します。移植とベースメッキの前に、歯科用セメントの体積変化をテストします。研究者は、あらゆるブランドの歯科用セメントをテストし、体積変化が最も少ないブランドを使用して地板をセメントで固めることができます。 図 3 に例を示します。
- 各歯科用セメント粉末0.5 gを計量し、適切な溶液(1 mL)と混合します。
注意: 歯科用セメントの説明書で推奨される粉末/液体の比率は、固体の形を得るために0.5 gの粉末と0.25 mLの溶液です。この試験プロトコルは、ピペットチップの容量変化を測定するために混合物を液体の形で吸引できるように、比率を0.5 g/mLに希釈します。 - 0.1〜10 μLのピペットチップを使用して2.5 μLの歯科用セメント混合物を除去し、次にピペットチップを光硬化型接着剤で密封します。
- チップをラックに置き、歯科用セメント混合物の最上位レベル....
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結果
歯科用セメントの体積変化の評価
歯科用セメントの体積は硬化プロセス中に変化するため、GRINレンズの作動距離が約50〜350μmであることを考えると、画像品質に大きな影響を与える可能性があります4,8。したがって、この場合、移植および下地めっき手順の前に、2つの市販の歯科用セメント、テンプロンとトクソがテストされました(図5)。最初にビデオを評価してセメントが収縮したかどうかを確認し、次に完全に乾燥したときのセメントの体積を比較しました。歯科用セメントの初期混合物の同じ濃度および量をピペットチップに装填し、ビデオテープを貼った(補足ビデオS1)。ビデオS1は、両方のセメントが乾燥プロセス中に収縮したことを示しました。特捜はテンプロンよりも優れた性能を発揮しました(つまり、縮小後もテンプロンよりも体積が大きかった):図3B;テンプロ.......
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ディスカッション
本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上させるために、ミニスコープシステムの他のバージョンにも使用できます。ウイルス注入に関する一般的な問題、およびミニスコープのバージョンに関係なく修正する必要があるレンズ埋め込みの他に、UCLAベースプレートの構造は位置シフトを引き起こす可能性があり、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離の不一致につながる可能性があります(図1C)。2つのレンズの位置シフトを最小限に抑えるために、修正された実験プロトコルが開発されました(図2、図 4、 図5)。カルシウムイメ.......
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開示事項
これは業界が支援する研究ではありません。著者らは、金銭的利益相反は報告していない。
謝辞
この作業は、台湾科学技術部(108-2320-B-002 -074、109-2320-B-002-023-MY2)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.7 mmドリルビット | #19008-07 | ファインサイエンスツール;手術 | のための |
| 0.1–10 μlピペットチップ | 104-Q;QSP | フィッシャーサイエンティフィック;歯科 | 用セメント |
| 20 G IVキャター | #SR-OX2032CA | テルモコーポレーション;東京、日本 | 、手術用 |
| 27 G ニードル | AGANI、AN*2713R | テルモ株式会社;東京、日本 | 外科用 |
| AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE# | 104487-AAV9; 1.5*10^13 | Addgene viral prep;マサチューセッツ州、ウイルス | 注射用 |
| 米国アトロピン硫酸塩 | アスタート;台湾・新竹 | 市、手術用/ダミーベースメッキ/ベース | |
| メッキ ベースプレート | V3 | http://miniscope.org | ダミーベースメッキ/ベースメッキ用 |
| BLU TACK | #30840350 | Bostik;米国マサチューセッツ州チェルシー | 再利用可能な接着粘土; 手術用/ダミーベースメッキ/ベースメッキ |
| ボーンロンガーフリードマン | 13 cm | ディーナー;ドイツ、トゥットリンゲン、 | |
| ブプレノルフィン | INDIVIORのベースメッキ。手術 | のための | |
| Carprofen | Rimadyl | Zoetis;ペンシルベニア州エクストン | 鎮痛剤 |
| Ceftazidime | 台湾バイオテクノロジー;台湾 | 感染を防ぎます | |
| UCLAミニスコープのデータ収集PCB | https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq | でベースメッキのために | |
| 歯科用セメントセット | Tempron | GC Corp;東京、 | 日本、歯科用セメントの試験用 |
| 歯科用セメントセット | Tokuso Curefast | Tokuyama Dental Corp.;東京、日本、 | 歯科用セメント/手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティングのテスト用 |
| ラボスタンダードとマウスとラットアダプター# | 51673 | Stoelting Co;米国イリノイ州 | 手術用/ダミーベースメッキ/ |
| デュラテア軟膏 | アルコンのベースプレーティング。ジュネーブ、スイス | 、手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング | |
| Ibuprofen | YungShin;台湾 | 鎮痛剤 | |
| イソフルラン | パニオン&BFバイオテック株式会社;台湾桃園、 | 手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング | |
| Inscopix | nVistaシステム | Inscopix;カリフォルニア州パロアルト | V3 UCLA Miniscope |
| Ketamine | Pfizerとの比較用)NY、 | NY安楽死手術 | |
| のための | 通常の生理食塩水 | ||
| マイクロブルドッグクランプ# | 12.102.04 | Dimedo;Tuttlingen、レンズ | 移植のための |
| リットルマイクロシリンジ、2.0 µL、25ゲージ | #88400 | ハミルトン;ボナドゥーツ、ウイルス | |
| 射出成形シリコーンゴム | ZA22 Thixo | Zhermackのためのスイス。Badia Polesine、ダ | ミーベースプレーティング |
| Objective Gradient index(GRIN)レンズ | #64519 | Edmund Optics;ニュージャージー州、 | 米国、ダミーベースメッキ/ベースメッキ |
| パラフィルム | #PM996 | ベミス。ニーナ、ダ | ミーベースメッキ用 |
| 米国ポータブル吸引 | #DF-750 | Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc.、台中、台湾 | 手術用 |
| リレーGRINレンズ | #1050-002177 | Inscopix;パロアルト、カリフォルニア州、米国 | 、ダミーベースメッキ用、 |
| ステンレス鋼アンカーネジ | 直径1.00mm、手術用全長3.00mm | ||
| 顕微鏡 | #SL720 | セージビジョン;台湾の新北市、 | 手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング |
| Stereotaxic apparatus | #51673 | Stoelting;イリノイ州、手術 | 用/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング |
| UV硬化接着剤 | #3321 | ロックタイト;Düドイツ、セルドルフ、 | 歯科用セメント |
| V3 UCLAミニスコープ | 手術/ダミーベースメッキ/ベースメッキのために | https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components | |
| キシラジン | X1126 | Sigma-Aldrich; 安 | 楽死のために |
| キシロカインポンプスプレー10% | アストラゼネカ;Södertälje, スウェーデン | 手術用 |
参考文献
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Dana, H., et a....
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再版と許可
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