ミトコンドリアの熱発生能力を研究するためのパッチクランプ技術の使用

サマリー

この方法の記事では、ミトコンドリアの熱生成能力を研究するための新しいアプローチであるパッチクランプ技術を使用して、ミトコンドリア内膜を横切るH⁺ リークを測定する主な手順を詳述します。

要約

ミトコンドリア熱発生(ミトコンドリアアンカップリングとしても知られている)は、メタボリックシンドロームと戦うためのエネルギー消費を増加させるための最も有望な標的の1つである。茶色脂肪やベージュ脂肪などの熱発生組織は、熱産生のために高度に専門化されたミトコンドリアを発達させる。主にATPを産生する他の組織のミトコンドリアも、ミトコンドリア全体のエネルギー産生の最大25%を熱に変換し、したがって、全身の生理機能に大きな影響を与える可能性があります。ミトコンドリア熱発生は、体温を維持するために不可欠であるだけでなく、食事誘発性肥満を予防し、活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する。ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の重要な調節因子であるため、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発に役立つであろう。重要なことに、ミトコンドリアにおける熱発生の急性活性化を制御する正確な分子機構は、あまり定義されていない。この情報の欠如は、主に、結合解除タンパク質を直接測定する方法が不足しているためです。ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の最近の開発により、ミトコンドリア熱発生の起源における現象、IMMを介したH⁺ リークの直接研究が初めて可能になり、それを担うミトコンドリアトランスポーター、褐色およびベージュ色の脂肪に特異的な脱共役タンパク質1(UCP1)、および他のすべての組織に対するADP / ATPトランスポーター(AAC)の最初の生物物理学的特徴付けが可能になった。このユニークなアプローチは、H⁺ リークとミトコンドリア熱発生を制御するメカニズムと、メタボリックシンドロームと戦うためにそれらをどのように標的にすることができるかについての新しい洞察を提供します。この論文では、IMMを通るH⁺ 電流を直接測定することによってミトコンドリアの熱発生能力を研究するためにミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論について説明します。

概要

ミトコンドリアは細胞の原動力として有名です。実際、それらは化学エネルギーの主要な供給源であるATPです。あまり知られていないのは、ミトコンドリアも熱を発生するということです。実際、すべてのミトコンドリアは常に2種類のエネルギー(ATPと熱)を生成し、2つのエネルギー形態の微妙なバランスが代謝細胞の恒常性を定義します(図1)。ミトコンドリアがATPと熱の間でどのようにエネルギーを分配するかは、生体エネルギー学の分野では確かに最も基本的な問題ですが、まだほとんど知られていません。ミトコンドリア熱産生(ミトコンドリア熱発生と呼ばれる)を増加させ、その結果ATP産生を減少させるとエネルギー消費が増加することが知られており、これはメタボリックシンドローム1と戦うための最良の方法の¹つです。

ミトコンドリア熱発生は、ミトコンドリア内膜(IMM)を横切るH⁺リークに由来し、基質酸化の脱結合とATP合成、その結果生じる熱の生成につながるため、「ミトコンドリアアンカップリング」1という名前が付けられています(図1)。このH⁺リークは、アンカップリングタンパク質(UCP)と呼ばれるミトコンドリアトランスポーターに依存します。UCP1 は最初に同定された UCP でした。それは、ミトコンドリアが熱産生に特化している熱発生組織、褐色脂肪、およびベージュ脂肪でのみ発現される^2,3,4。骨格筋、心臓、肝臓などの非脂肪組織におけるUCPの同一性は、依然として議論の余地がある。これらの組織におけるミトコンドリアは、全ミトコンドリアエネルギーの約25%を熱に変換することができ、これは全身の生理機能に大きな影響を与える可能性がある¹。深部体温を維持することに加えて、ミトコンドリア熱発生はまた、カロリーを減らすことによって食事誘発性肥満を防ぎます。さらに、ミトコンドリアによる活性酸素種(ROS)の産生を減少させ、細胞を酸化的損傷から保護する¹。したがって、ミトコンドリア熱発生は、正常な老化、加齢性変性障害、および虚血再灌流などの酸化ストレスを伴う他の状態に関与する。したがって、ミトコンドリア熱発生は細胞代謝の強力な調節因子であり、この基本的なプロセスの機構的理解は、ミトコンドリア機能障害に関連する多くの病状と戦うための治療戦略の開発を促進するであろう。

ミトコンドリア呼吸は、細胞代謝におけるミトコンドリア熱発生の重要な役割を明らかにした最初の技術であり、コミュニティ¹で依然として最も人気があります。この技術は、ミトコンドリアH⁺リークが活性化されると増加するミトコンドリア電子輸送鎖(ETC)による酸素消費量の測定に基づいています。この技術は、道具的ではあるが、IMM 1を横切るミトコンドリアH⁺リークを直接研究することはできないため、特にATP産生と比較して熱産生が二次的である非脂肪組織において、IMM¹の原因となるタンパク質の正確な同定および特性評価を困難にする。最近、ミトコンドリアに適用されるパッチクランプ技術の開発は、様々な組織におけるIMM全体にわたるH⁺リークの最初の直接研究を提供しました⁵、^6、7。

IMM全体のミトコンドリアパッチクランプは、Kirichokらによって再現可能な方法で最初に確立された⁸。彼らは、2004年にCOS-7細胞株⁸からのミトプラストを用いてミトコンドリアカルシウムユニポーター(MCU)電流の最初の直接測定を説明した。その後、Kirichok研究室は、マウス⁹およびショウジョウバエ組織⁹のIMMからのカルシウム電流を示した。他の研究室は現在、MCU^10、11、¹²、^13、14の生物物理学的特性を研究するためにこの技術を日常的に使用^{しています}。カリウムと塩化物のコンダクタンスのIMMパッチクランプ分析も可能であり、いくつかの論文で言及されていますが、まだ出版物^6、7、9の主な主題ではありません。IMMを横切るH⁺電流の最初の測定は、2012年にマウスの褐色脂肪ミトコンドリア⁶から、そして2017年にマウスベージュ脂肪ミトコンドリアから報告^{されました7}。この電流は、熱発生組織の特異的な脱共役タンパク質、UCP1 ^6,7によるものである。2019年に発表された最近の研究では、AACが心臓や骨格筋などの非脂肪組織におけるミトコンドリアH⁺リークの原因となる主なタンパク質として特徴付けられました⁵。

このユニークなアプローチにより、ミトコンドリアの熱発生を担うミトコンドリアイオンチャネルとトランスポーターの直接高分解能機能解析が可能になりました。この方法の拡大を促進し、ミトコンドリア呼吸などの他の研究を補完するために、UCP1およびAACによって運ばれるH⁺ 電流を測定するための詳細なプロトコルを以下に説明する。1)UCP1依存性H⁺ 電流を分析するためのマウス褐色脂肪からのミトコンドリア単離およびAAC依存性H⁺ 電流を分析するための心臓からのミトコンドリア単離、2)外側ミトコンドリア膜(OMM)の機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製、3)IMM全体にわたるUCP1およびAAC依存性H⁺ 電流のパッチクランプ記録。

プロトコル

実施されたすべての動物実験手順は、国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、カリフォルニア大学ロサンゼルス校の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。

注:ミトコンドリア分離手順は、差動遠心分離に基づいており、組織ごとにわずかに異なります。例えば、褐色脂肪組織は脂質が非常に豊富であるため、ミトコンドリアを採取する前に細胞破片および細胞小器官を脂質相から分離するための追加のステップが必要である。混乱を避けるために、2つのミトコンドリア分離手順(1つは褐色脂肪から、もう1つは心臓から)を以下に詳述します。

1. マウス肩甲骨間褐色脂肪からのミトコンドリア単離(Bertholet et al. 2020より改変)¹⁵

1. 米国獣医師会パネルおよびIACUC委員会が推奨するように、_CO2 窒息およびその後の子宮頸部脱臼を用いてC57BL/6雄マウスを安楽死させる。
2. 腹をテーブルに向けるようにマウスを配置した後、アルコールを噴霧して毛髪をきれいにし、濡らす(Mann et al., 2014から修正)¹⁶。
3. ピンセットで皮膚をつかんだ後、背中上部に2cmの切開を行います。
4. 蝶の形をした二葉の器官に対応するマウスの褐色の肩甲骨間脂肪^{を抽出する16}。
5. 褐色脂肪を、予め氷上に置いた5mLの低温単離緩衝液(表1)で満たされた35mmペトリ皿に移す。
6. 双眼鏡の下の白い脂肪から茶色の脂肪をきれいにします。
7. 褐色脂肪を5mLの冷間分離緩衝液(表1)を含む10mLビーカーに移し、それを細片に切り刻む。氷冷した10mLガラスホモジナイザー(プラスチック材料ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)乳棒)に移す。
8. オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を275回転/分の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。
9. ホモジネートを8,500 x g で15 mLの氷冷円錐管で4°Cで10分間遠心分離します。脂質相を含む上清を捨てる。
10. ペレットを5mLの氷冷分離緩衝液(表1)に再懸濁し、275回転/分の速度で6回の低速ストロークで氷上で懸濁液を2回目に均質化する。
11. ホモジネートを15mLの氷冷円錐管に移し、700 x g で4°Cで10分間遠心分離して、すべての核および未切断の細胞をペレット化する。
12. 上清を新鮮な15mLチューブに集め、氷の上に置きます。
13. 上清を8,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ミトコンドリアを含むペレットを得た。
14. ミトコンドリアを含むペレットを3.8mLの氷冷高張マンニトール緩衝液(表2)に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。

2. マウス心臓からのミトコンドリア単離(Garg et al. 2019より改変)¹⁷

1. 米国獣医師会パネルおよびIACUC委員会が推奨するように、_CO2 窒息およびその後の子宮頸部脱臼を用いてC57BL/6雄マウスを安楽死させる。
2. マウスを背中に置いた後、アルコールをスプレーして髪をきれいにし、濡らします。次に、ピンセットで皮膚をつかんだ後、胸郭に2cmの切開を行います。
3. 動物の胸から心臓を解剖し、それをすすぎ、5mLの冷間隔離溶液を含む10mLビーカーですべての血液を除去した(表1)。
4. 心臓から微量の血液が取り除かれたら、5 mLの冷間隔離バッファー(表1)を含む別の10 mLビーカーに移して、それを細かく切り刻みます。次いで、氷冷した10mLガラスホモジナイザー(PTFE乳棒)に移す。
5. オーバーヘッドスターラーを使用して、氷上のプレカット組織を275回転/分の制御速度で6回の穏やかなストロークで均質化します。
6. ホモジネートを15mLの氷冷円錐管に移し、700 x g で4°Cで10分間遠心分離してペレット核および未破砕細胞を得た。
7. 上清を新鮮な15mLチューブに集め、氷の上に置きます。
8. 上清を8,500 x g で4°Cで10分間遠心分離し、ミトコンドリアを含むペレットを得た。
9. ミトコンドリアペレットを3.8mLの氷冷高張マンニトール緩衝液(表2)に再懸濁し、ミトコンドリア懸濁液を氷上で10〜15分間インキュベートする。

3.OMMの機械的破裂のためのフレンチプレスによるミトプラストの調製。

メモ: フレンチプレス手順では、マトリックスやクリスタを含め、整合性を維持したまま IMM を OMM から解放することができます (図 2)¹⁸。ミトコンドリアは、高張マンニトール緩衝液中でプレインキュベートされ(表2)、OMMが破裂したときにIMMの劇的な伸張を避けるために、フレンチプレス手順中により低い圧力を受ける。

1. ミトコンドリア-高張-マンニトール懸濁液をフレンチプレスの冷蔵ミニ圧力セル(ピストン直径3/8インチ)に充填します(図3A)。
2. フレンチプレスの ミディアム モードを選択し、フレンチプレスのダイヤルの110で褐色脂肪ミトコンドリアの場合は110、心臓ミトコンドリアの場合は140(〜2,000psi)でミニ圧力セルを介して懸濁液を圧縮します。 懸濁液が約1滴/秒の割合でミニ圧力セルから出てくることを確認します。
3. 15 mLの氷冷円錐管に滴を集める。
4. 懸濁液を10,500 x g で4°Cで10分間遠心分離する。
5. ミトプラストペレットを0.5〜2mLの氷冷高張-KCl緩衝液(表3)に再懸濁し、懸濁液を氷上に保存する。
   注:茶色の脂肪と心臓のマイトプラストはパッチクランプ録音の準備ができており、約3〜6時間使用可能なままであるはずです。

4. UCP1およびAAC ^5,7,15を介したH⁺リークの電気生理学的記録

メモ:次の電気生理学的セットアップ(図3B)を使用してください:微分干渉コントラスト(DIC)を備えた倒立顕微鏡、60倍の水浸漬対物レンズ、防振テーブル、ファラデーケージ、低ノイズ記録をサポートする標準アンプ、電気生理学的セットアップに使用される標準デジタイザ、pClamp 10、マイクロマニピュレータ、バスリファレンス電極(銀/塩化銀ペレット成形を含むマイクロ電極ホルダー内に挿入された3M KCl寒天ソルトブリッジ) ホルダー本体(Liu et al. 2021に記載)^19、0.13mmのガラスカバースリップ底部を有する灌流チャンバに、重力供給灌流システムに接続された。

1. 記録当日にホウケイ酸ガラスフィラメントをマイクロピペットプーラーを用いて引き抜く。再現性の高いピペット²⁰の生成に用いるプーラーにプログラムを設定する。
   メモ: このプログラム設計では、IMM パッチクランプ用に最適化されたピペットを何度か入手する必要があります。標準的なピペットは、プログレッシブコーン形状の細かい先端を備えています。
2. 1つのガラスフィラメントをプーラー内に挿入して引っ張り、1つのホウケイ酸フィラメントからほぼ2つの同一のパッチピペットを得る。
3. プーラーの加熱ボックスフィラメントの経年劣化により、ピペットが引っ張りサイクル間で不整合になった場合は、プログラムを調整してください。
4. ピペットをピペットポリッシャーの内側に置き、フィラメントの近くに先端を倍率100倍下に置き、ファイアーポリッシュします。
5. フットペダルを数回押して、先端の曲線を詰まらせたり傷つけたりすることなくフィラメントを加熱します。
6. TMAベースのピペット溶液で充填すると、25〜35MΩの間の抵抗を有するピペットが得られるまで磨く(テトラメチルアンモニウムヒドロキシドについてのTMA、 表4)。
7. カバースリップ(直径5mm、厚さ0.1mm)を0.1%ゼラチンでプレインキュベートしてミトプラスト付着を減少させ、KCl浴溶液(表5)ですすいでから、ミトプラスト懸濁液を沈着させる。
8. 濃縮マイトプラスト懸濁液35 μLと500 μLのKCl浴溶液(表5)を混合して生希釈液を調製し、4ウェルプレートのウェルに予め置いたカバースリップの上に置きます。
9. 氷上で15〜20分間インキュベートし、マイトプラストをカバースリップに沈殿させる。
10. 浴槽を約50μLのKCl浴液で完全に満たします(表5)。
11. 先端が曲がった薄い微小解剖ピンセットを使用して、カミトプラストを含むカバースリップをチャンバー内に移す。
12. カバースリップをチャンバーの底部に配置します。カバースリップ上でミトプラストを安定に保つためにチャンバーを灌流しないでください。
13. 60倍の対物レンズで顕微鏡下でカバースリップをスキャンして、8の形の個々の非接着ミトプラストを選択します。
14. ピペットにピペット溶液(約50 μL)をロードし、ピペットホルダーに入れます。
15. マイクロマニピュレーターでピペットをバス溶液に入れ、選択したマイトプラストのすぐ上に近づけてIMMに近づきます。アンププログラムは、ピペットが入浴液に入ると、ピペットの抵抗を与えます。膜電位を0mVに保持し、アンププログラムのメンブレンテストコマンドを使用して10mVパルスを印加します。
16. わずかな負圧をかけると、IMMでギガシールをすばやく作成します(図2B)。
17. 実験中のピペットのドリフトによるシールの破損を避けるために、マイトプラストを取り付けてピペットを持ち上げ、カバースリップから遠ざけます。
18. マイトプラスト全体の構成をテストする前に、アンププログラムの「メンブレンテスト」コマンドで浮遊容量トランジェントを補償し、侵入後のミトプラスト膜の正しい静電容量(Cm)測定値を取得します。
19. アンププログラムで短時間(5~15ms)の電圧パルス(250~600mV)を印加し、ガラスピペットの下のメンブレンパッチを破裂させ、ミトプラスト全体の構成を実現します(図2C)。成功した慣らし運転は、容量トランジェントの再出現によって反映されます。
20. ブレークイン後、容量トランジェントをアンププログラムのメンブレンテストオプションに合わせ、メンブレン容量(ミトプラストのサイズを反映する)とそのアクセス抵抗Ra(ミトプラスト構成全体の品質を反映する)を評価します。侵入後、Raは40~80MΩの範囲になります。パッチクランプ実験に使用されるミトプラスト(サイズが2〜6μm)は、典型的には0.5〜1.1pFの膜容量を有する。
21. ブレークインの直後に、灌流を開始してKCl浴液(表5)をHEPES浴溶液(表6)に交換する。
22. アンププログラムで設計された850 msのランププロトコルを、5 s間隔で-160 mV~+100 mVの範囲で適用し、ミトプラストを0 mVに保持します。このプロトコルは、UCP1⁶、^7、15およびAAC 5試験で機能します(図4および図5)。
    メモ: UCP1 および AAC に依存する H⁺ 電流測定では、すべての電気生理学的データを 10 kHz で集録し、アンプとデジタイザを駆動する適切なソフトウェアを使用して 1 kHz でフィルタリングすることをお勧めします。

結果

ミトコンドリアに適用されたパッチクランプ方法論の開発は、IMMとそれに関与するミトコンドリアトランスポーターUCP1およびAACを介したH⁺ リークの最初の直接研究を提供しました。UCP1およびAAC依存性のH⁺ リークの電気生理学的分析は、ミトコンドリアの熱発生能力の第一目瞭然を提供することができる。結果のセクションでは、UCP1 および AAC を介して H⁺ リークを測定するための標準的な手順について説明します。

UCP1依存のH⁺電流測定(図4)⁶、^7、15
電圧ランププロトコルの適用は、UCPの必要な活性化剤である外因性脂肪酸(FA)を添加することなく、褐色脂肪のIMM...

ディスカッション

この方法の記事は、ミトコンドリア熱発生を担当するIMMを介したH⁺リークを直接研究する新しいアプローチであるミトコンドリアに最近適用されたパッチクランプ技術を提示することを目的としています5,6,7,15。この技術は組織に限定されず、HAP1、COS7、C2C12、MEF細胞などの異なる標準ヒトおよび細胞モデルにおけるIMMのH⁺リークおよび他のコンダクタンスを分析するためにも使用することができる。しかし、各ミトコンドリア単離には、各細胞または組織タイプに固有の再調整が必要です。

褐色脂肪^{5,6および心臓5}のIMMを通るH...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1% ゼラチン	ミリポア	ES-006-B
60X 水浸対物レンズ、開口数 1.20	オリンパス	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B アンプ	分子デバイス
ホウケイ酸ガラス 毛細血管	サッター機器	BF150-86-10
Digidata 1550B デジタイザー	分子デバイス
ファラデーケージ	自家製
フレンチプレス	グレンミルズ	5500-000011
IKA ユーロスター PWR CV S1 オーバーヘッドスターラー
逆顕微鏡	オリンパス	IX71 または IX73
マイクロフォージ	(成茂)	MF-830
マイクロマニュピュレーター MPC-385	サッター器械	FG-MPC325
寒天橋用マイクロ電極ホルダー	ワールド精密機器	MEH3F4515
マイクロピペットプーラー	(Sutter Instruments)	P97
フレンチプレス用ミニセル	グレンミルズ	5500-FA-004
ミキサー IKA 6-2000RPM	コールパーマー	EW-50705-50
対物レンズ 100倍	ニコン  レンズ	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	分子デバイス
灌流チャンバー	ワーナー・インスツルメンツ	RC-24E
ポッター・エルヴェイェム ホモジナイザー 10 ml	ウィートン	358039
冷蔵遠心分離機 SORVALL X4R PRO-MD	サーモサイエンティフィック	75 009 521
小さな丸いガラスカバースリップ:直径5 mm、厚さ0.1 mm	ワーナーインスツルメンツ	640700
防振テーブル	ニューポート	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-グルコン酸	Sigma Aldrich	G1951
D-マンニトール	シグマ アルドリッチ	M4125
EGTA	シグマ アルドリッチ	3777
HEPES&	nbsp;シグマ アルドリッチ	H7523
KCl	シグマアルドリッチ	60128
MgCl2	シグマアルドリッチ	63068
スクロース	シグマ アルドリッチ	S7903
TMA	シグマ・アルドリッチ	331635
TrisBase	シグマ アルドリッチ	T1503
TrisCl	シグマ アルドリッチ	T3253