インビトロでのヒト網膜芽細胞腫の再構築

ヒト網膜芽細胞腫(RB)は、網膜錐体前駆体^1,2,3に由来するまれで致命的な腫瘍であり、小児期の眼内悪性腫瘍の最も一般的なタイプです4。RB1遺伝子のホモ接合型不活性化は、^RB5における開始遺伝子病変である。しかし、RB1変異を有するマウスは網膜腫瘍²を形成することができない。マウス腫瘍は、Rb1変異と他の遺伝子改変の組み合わせで生成される可能性がありますが、それでもヒト^RB6の特徴が欠けています。網膜オルガノイド分化の発達により、ヒト^RB1の特徴を示すhESC由来のRBを得ることができました。

網膜オルガノイド分化のための多数のプロトコルが過去10年間で確立されており、2D⁷、3D⁸、および2Dと3D⁹の組み合わせが含まれています。ヒトRBを生成するためにここで用いられる方法は、付着培養と浮遊培養⁹の連結である。RB1変異hESCを網膜オルガノイドに分化させることで、45日目頃に RB の形成が検出され、60日目頃に急速に増殖します。90日目に、RBの単離、およびRB細胞株の生成が可能です。さらに、RBは120日目にほぼすべての網膜オルガノイドを取り囲んでいます。

hESC由来のRBは、RBの起源、腫瘍形成、および治療法を探索するための革新的なモデルです。このプロトコルでは、遺伝子編集hESCの生成、RBの分化、およびRBの特性評価について詳しく説明します。

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されています。H9 hESCはWiCell研究所から入手しています。

1. RB1 変異hESCの生成

1. RB1のノックアウト(KO)のためのCRISPR/Cas9ターゲティングベクター。
   1. sgRNAのペアを設計します。 RB1のアブレーションでは、この遺伝子の最初のエクソンを標的とする。フォワードプライマー配列はCACCGCGGTGGCCGGCCGTTTTTCGGであり、リバースプライマー配列はAAACCCGAAAAACGGCCCCACCGCである。
      注: 特定の RB1 変異については、修復されたテンプレートも必要です。このプロトコールでは、 RB1-KO細胞株が一例として用いられる。
   2. 製造元の指示に従って、1 μgのpX330-U6-キメラBB-CBh-hSpCas9-2A-PuroをBbsI制限酵素( 材料表を参照)で37°Cで30分間消化します。
   3. 消化されたプラスミドは、製造元の指示に従って精製キットを使用して精製します。
      注:酵素反応は、精製キットを使用してアガロースゲルなしで直接クリーンアップできます(材料の表を参照)。
   4. 1 μLのオリゴ1(100 μM)、1 μLのオリゴ2(100 μM)、1 μLの10x T4ライゲーションバッファー、6.5 μLのddH₂O、および0.5 μLのT4 PNKを含む反応で、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(材料表)を使用して各オリゴペアをリン酸化およびアニールします。
      注:手順1.1.1のフォワードプライマーとリバースプライマーはオリゴのペアです。以下のパラメータを使用してサーモサイクラー中でオリゴをリン酸化およびアニールする:37°Cで30分間;95°Cで5分間;毎分5°Cで25°Cまで上昇します。
   5. 室温(RT)で199 μLのヌクレアーゼフリー水に1 μLのオリゴ試薬を加えて、リン酸化およびアニーリングされたオリゴを200倍に希釈します。
   6. ライゲーション反応を設定し、ステップ1.1.3のBbs1消化プラスミド50 ng、ステップ1.1.5のオリゴ二本鎖1 μL、2xライゲーションバッファー5 μL、リガーゼ1 μL、およびヌクレアーゼフリー水を使用して最大10 μLを混合して、RTで10分間インキュベートします。
   7. ライゲーション混合物を形質転換し、次のステップのために陽性コロニーを配列決定します。
      注:シーケンスにはU6フォワードプライマーまたはリバースプライマーを使用してください。
      1. コンピテントセルを氷上で解凍します。
      2. 50 μLのコンピテントセルを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに入れます。
      3. ステップ1.1.6のライゲーション混合物1 μLをコンピテントセルに加えます。
      4. チューブを上下に3回ピペッティングして穏やかに混ぜます。
         注意: ボルテックスはしないでください。
      5. 混合物を氷上に30分間置きます。
      6. 混合物を42°Cで90秒間ヒートショックします。
      7. 抗生物質を含まない室温のルリアベルターニ(LB)ブロス950 μLをチューブに加えます。
      8. チューブを300rpmのシェーカーに入れ、37°Cで60分間行います。
      9. LBプレート(ペプトン、カゼイン由来のペプトン、塩化ナトリウム、寒天、アンピシリン)をあらかじめ37°Cに温めてください。
      10. 50〜100 μLの細胞とライゲーション混合物をRTでプレートに広げます。
      11. プレートを37°Cで一晩インキュベートします。
      12. プレートから12個のコロニーをピックアップし、アンピシリンを含むLB培地に移します。培地を300rpmのシェーカーに60分間置きます。
      13. 1 μLの細菌溶液(ステップ1.1.7.12から)をPCRのテンプレートとして使用し、陽性コロニーを選択します。
      14. U6プライマーにより陽性コロニーを配列決定し、設計したsgRNA配列を有するコロニーを次のステップで使用する。
   8. MIDIキットを使用してプラスミドを抽出します(材料の表を参照)。
      注:ミニキットを使用したプラスミドの質と量は、次の核効果実験には十分ではありません。ミニキットよりもミディまたはマキシキットの方が適しています。
2. HESC培養と核代謝。
   注意: すべての試薬をRTに予熱します。
   1. 1 x 10 6 H9細胞を、10 μM Y-27632(ROCK阻害剤)と2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培地を含むプレコート⁶ ウェルプレートに解凍します。
      注:使用前に、6ウェルプレートを1%成長係数低減基底膜マトリックスで37°Cで少なくとも30分間コーティングします。
   2. 翌日、上清を取り除き、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞をすすぎ、2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培養液を追加します。
   3. 細胞が約80%のコンフルエンシーになるまで、次の3〜5日間で2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC / hESC培養培地で培地を毎日交換します。
   4. 1回または2回通過してhESCの状態を調整する。
      注:hESCの状態を特定する最も簡単な方法は形態です。
   5. 未分化H9細胞を6ウェルプレートで80%コンフルエントになるまで培養します。
   6. 核放出の2時間前に、10 μMのY-27632と混合した2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培地で培地を交換し、1%成長因子低減基底膜マトリックスを使用して12ウェルプレートの1ウェルをプレコートします。
   7. 培地を吸引し、1 mLの予熱したDPBSですすいでください。
   8. DPBSを除去し、1 mLの細胞解離酵素( 材料の表を参照)とともに37°Cで3.5分間インキュベートします。
   9. 1 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培養液を細胞に加え、ピペットで2回ピペットして、H9細胞を単一細胞懸濁液にします。
   10. 細胞計数用に100 μLの混合物を取り出し、残りを別の2 mLのncEpic-hiPSC/hESC培養培地が入った15 mLの遠沈管に移します。
   11. 200 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、約2 x 10⁶ 細胞を100 μLの反応容量に再懸濁します。メーカーのプロトコルに従って、細胞、プラスミド、ヌクレオフェクター、および反応条件に合わせて容量を最適化します。このプロトコルで使用される核放出システムについては 、材料表 を参照してください。
       注:一般に、核形成中は気泡は許可されません。
   12. トランスフェクション後、細胞をプレコートされた12ウェルプレートに移し、1.5 mLのncEpic-hiPSC/hESC培養培地と10 μMのY-27632を添加し、37°C、5%_CO2 インキュベーターで細胞を培養します。
   13. 培地を毎日交換してください。48時間後、細胞選択のために2 μg/mLのピューロマイシンを約1週間加えます。
       注:最初の3日間で多数の細胞が死にます。残りの細胞は増殖し、ピューロマイシン選択後の翌週にコロニーに生成する可能性があります。選択週には、培地に常に2 μg/mLのピューロマイシンが含まれていることを確認してください。
   14. 顕微鏡下で手動でコロニーを選びます。
       注:コロニーの形態はhESコロニーと同じです。培地中の10 μLの白色/通常のピペットチップを使用してコロニーを小片(コロニーあたり2〜6個)に切断し、1つのコロニーを12ウェルプレートの1つのプレコートウェルに移します。
   15. まず、RB1変異およびオフターゲット状況を特定し(表1)、次いで多能性を同定してRB1ノックアウトH9細胞株を特徴付ける。
       注:PCRとサンガーシーケンシングを使用して 、RB1 変異とオフターゲット状況を検出します。RT-PCRおよび免疫蛍光法により多能性マーカーを同定します。

2.ヒト網膜芽細胞腫の発生

1. RB1-KO hESCのメンテナンス
   1. 遺伝子編集したH9細胞を、2 mLのncEpic-hiPSC/hESC培地で培養し、成長因子還元基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートで培養し、毎日培地を交換します。
   2. EDTAバッファーを使用して、37°Cで3.5分間、またはRTで5分間継代します。
      注:EDTAバッファーは、1x DPBS、5 mM EDTA、および0.9 mg/mLのNaClの混合物です。
2. 網膜細胞分化。
   注:分化前に培地Iを準備します。培地Iを調製するには、24.5 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F-12(F12)-グルタミン(1x)、24.5 mLのニューロン基礎培地、250 μLの100xサプリメントA、500 μLの50xサプリメントB、0.1 mM ß-メルカプトエタノール、および250 μLの100xL-グルタミンを混合します。使用前にすべての混合物をRTに予熱します。
   1. RB1-KO hESCを6ウェルプレートの1ウェルで80%コンフルエントまで成長させます。
   2. 培地を取り出し、1 mLの1x DPBSで細胞を洗い流します。
   3. 1 mLのディスパーゼバッファー( 材料の表を参照)を使用して、37°Cで5分間細胞コロニーを上昇させます。
      注:顕微鏡で細胞コロニーを確認します。通常、コロニーの端がロールアウトするのに5分かかります。
   4. ディスパーゼバッファーを吸引し、1 mLの1x DPBSで細胞を1回穏やかにすすぎます。
   5. 1 mLの培地Iをウェルに加えます。
   6. 培地中の10 μLの白色/通常のピペットチップを使用して、コロニーを小片(コロニーあたり6〜9個)に切断します。
      注:一般的に、細胞の約60%〜70%がウェルから剥離します。セルスクレーパーを使用して、培地中の残りの細胞をこすり落とします。
   7. 15 mLチューブ中で200 x g で5分間遠心分離することにより、すべての細胞を回収します。
   8. 約50 μLの上清を残して細胞を培地に分散させた後、細胞を250 μLの成長因子低減基底膜マトリックスと穏やかに攪拌して混合します。
      注意: 成長因子低減基底膜マトリックスは、使用前に4°Cまたは氷上に保管してください。分注して-20°Cで保存する場合は、使用前に一晩または少なくとも1時間前に4°Cに置いてください。
   9. 懸濁した細胞を入れた15 mLチューブを37°Cのインキュベーターに20分間保持します。
      注:細胞と成長因子の減少した基底膜マトリックスが固化したゲルを形成することを確認してください。
   10. 1 mLの培地Iを15 mLチューブに加え、固化したゲルを2〜3回軽くピペットで固め、1 mLピペットで塊を分散させます。
   11. 9 mLの培地Iを加え、細胞懸濁液を10 cmの細胞培養皿に移します。
   12. ディッシュを5%_CO2 を含む37°Cのインキュベーターに移し、その日を0日目として設定する。
   13. 1日目に顕微鏡を使用して細胞を調べます。
       注:皿には何千もの中空嚢胞が観察されました。平均して、1枚のゲル中に3〜4個の嚢胞が観察される。
   14. 5日目に培地を交換してください。上清を15 mLチューブに集め、嚢胞が底に落ち着くのを待ってから、培地を取り除き、新しい培地Iと交換します。
       注意: 4日目に培地が黄色になった場合は、4日目に培地を交換し、それ以外の場合は5日目に培地を交換してください。10mLの新鮮な培地Iを元の皿に加えます。何百もの嚢胞がすでに培養表面に付着しています。それらをそこに保管してください。
   15. チューブ内の嚢胞を2つの10 cm皿に分散させます。
       注:少なくとも300個の嚢胞が皿に入っていることを確認してください。嚢胞がコンフルエントでない場合は、嚢胞を他の皿に分離しないでください。それらを元の10 cmの皿に戻します。
   16. 7日目に、ほとんどの嚢胞(95%以上)が皿に付着し、広がり、付着コロニーを形成します。
       注:早くも3日目に、付着コロニーが観察されます。
   17. 10日目に、培地を新鮮な培地Iで交換します。 すべての嚢胞が皿に付着していることを確認します。
   18. 次のステップの前に、36 mLのDMEM、12 mLのF12、2%のサプリメントB(v/v)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)を混合して、培地IIを準備します。
   19. 細胞が13〜17日目までに広がっていることを確認してください。細胞が広がっているが隣接するコロニーと相互作用していない15日目に次のステップを実行します。
   20. 細胞を1 mLのDPBSで1回すすぎ、1 mLのディスパーゼ溶液を加えて37°Cで5分間浸します。
       注意: 5分以内に、セルの端が上昇します。
   21. ディスパーゼバッファーを除去し、1 mLの1x DPBSで培養物を穏やかにすすぎます。
   22. 培地IIを各10 cmディッシュに10 mL加え、37°C、5%_CO2 インキュベーター内で培養する。
   23. 付着培養物は24時間後に自発的に剥離し、網膜オルガノイドに集合する。
       注:オルガノイドを形成しない多数の細胞は、次の2日間で死滅します。
   24. 剥離の3日後に、細胞培養皿から細胞を回収し、オルガノイドを15 mLチューブに沈降させます。
   25. チューブから上清を取り除き、オルガノイドを10 mLの培地IIを含む新しい非付着性ディッシュ(ペトリディッシュ)に次の4日間移します。
   26. DMEM:F12を3:1の比率(v/v)、2%サプリメントB(v/v)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、8%ウシ胎児血清(FBS)(v/v)、100 μMのタウリン、および2 mMグルタミンを混合して、培地IIIを調製します。
   27. 分離の1週間後に、培地をミディアムIIIに変更します。
   28. この日から、培地IIIでオルガノイドを培養し、週に2回培地をリフレッシュします。
3. RB細胞株の樹立
   注:すべての試薬はRTで予熱されています。
   1. 90日目に、RB(80%-90%)は網膜オルガノイドを包含する。したがって、RB細胞株の作製には90日間のRBオルガノイドを選択する。
   2. ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地と10%FBSを混合して、1640培地を調製します。
   3. RPMI-1640培地の顕微鏡下で顕微手術用ナイフを使用して、RBを小片(RBあたり20〜25個)に切断します。
   4. RPMI-1640培地を取り出し、0.25%トリプシン/EDTAで37°Cで10分間処理します。
   5. RPMI-1640培地を加えて反応を終了し、200 x g で5分間遠心分離します。
   6. 上清を除去し、細胞を非接着性ディッシュの1640培地に再懸濁します。
   7. RB細胞株は浮遊培養物です。週に2回培地を交換し、2週間以内にRB細胞を継代します。
      注:初代RB細胞の増殖速度は非常に遅いです。

RB生成の手順は、付着培養と浮遊培養を組み合わせた 図1で解明されている。RB1-KO hESCからヒトRBを回収し、RBオルガノイドを単離することにより RB細胞株を得ることができた。

ここで、プロトコルは、異なる段階での分化の詳細を提供する(図2)。中空の球体は最初の3日間で形成され、培養表面に付着してから膨張します(図2A-E)。15日目以降、細胞は上昇し、浮遊状態で培養されます(図2F)。剥離の翌日、網膜オルガノイドが形成され、明るい縁が見えます(図2G、黒い矢印)。さらに、オルガノイドの外側の細胞は、次の週に死ぬ可能性があります(図2G、オレンジ色の矢印)。27日目には、視小胞構造が明らかであり、オルガノイドの約90%がこの構造を示します(図2H)。この構造を持たないオルガノイドは廃棄される可能性があります。RBの最初の検出は45日目に起こり、その後50日目に触知可能になります(図2I)。90日目に成長すると、視神経小胞構造は主にRBに包まれます(図2J)。一方、RBは、さらなる培養のためにRB細胞株として単離することができた(図2K)。80%を超える網膜オルガノイドは、105日目にRBによって完全に包囲されます(図2L)。H9由来の網膜オルガノイドと比較して、Ki67(増殖マーカー)およびSYK(癌遺伝子マーカー)の発現を高く示し、RBオルガノイドの腫瘍形成を示しています(図2M、N)。さらに、RBオルガノイドにおけるARR3(錐体前駆体メーカー)およびCRX(光受容体前駆体マーカー)の高発現は、それらが錐体前駆細胞に由来することを示しています(図2O、P)。

RB生成の手順は、主にRB形成前に形態変化を伴う3つの段階を経る。ここでは、この研究はこれらの段階で劣った結果と優れた結果を提供します(図3)。分化したhESCと未分化のhESC(図3A、B)は形態と区別しやすく、RB形成には未分化のhESCが選択されます。5日目には、中空の球体(図3C)ではなく、中空の球体(図3D)が生成されます。RBは、視神経小胞構造を示す網膜オルガノイドに由来します(図3F)。下位オルガノイドで生成されるRBはありません(図3E)。

図1:RBオルガノイド分化の模式図。0日目〜15日目に、細胞を培地Iで2D培養し、15日目以降、細胞を浮遊培養する。RBは45日目頃に形成されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:RBの生成と特性評価。 (A-C)初期段階の手順では、hESCが上昇して嚢胞を形成する。(B)の黒い矢印は、ディスパーゼ処理後のhESCのロールエッジを示しています。(D,E)嚢胞はプレートに付着し(D)、次に膨張する(E)。(f)接着細胞が上昇して網膜オルガノイドを形成する。黒い矢印はディスパーゼ処理後の圧延エッジを示す。(G,H)初期の頃はRBのない網膜オルガノイド。(I, J)50日目(I)および90日目(J)にRBを有する網膜オルガノイドについて、緑色の円はRB部分を示す。(k)90日目の網膜オルガノイドから単離されたRB細胞株。(L)105日目のRBオルガノイド。(M-P)癌遺伝子マーカー(M、N)および視細胞マーカー(O、P)の免疫蛍光画像。A-Lでは、スケールバー= 200μm;M-Pでは、スケールバー= 50μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:否定的な結果と肯定的な結果の比較。0日目(A、B)、5日目(C、D)、および30日目(E、F)の鑑別のための劣像および上画像。スケールバー= 200μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、この研究の客観性に影響を与える可能性のある所属、メンバーシップ、資金、または保有金を認識していません。