5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
生体細胞 周期進行解析は、有糸分裂およびDNA複製を調節する遺伝子に関する研究において日常的に行われている。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、複製/S相進行を調査するために利用されているのに対し、ホスホヒストンH3に対する抗体は、有核および細胞をマークするために利用されてきた。両方のラベルの組み合わせは、G0/G1(ギャップフェーズ)、S(複製)、およびM(有糸分裂)相の分類を可能にし、有糸分裂遺伝子のノックダウンまたはヌル突然変異体が細胞周期進行に及ぼす影響を評価する重要なツールとして機能する。しかし、EdU標識細胞をマークするために使用される試薬は、いくつかの二次抗体蛍光タグと互換性がありません。これは、一次およびタグ付き二次抗体がpH3陽性有糸分裂細胞をマークするために使用される免疫染色を複雑にします。本論文では、染色体 の幼虫 神経幹細胞におけるEdUとpH3の二重標識のステップバイステッププロトコルについて説明する。さらに、画像分析と定量化のために、G0/G1、S、S、S>G2/M(SからG2/Mへの進行)、およびM相の3つの異なるカテゴリーにラベル付けされたセルを割り当てるためのプロトコルが用意されています。
概要
細胞分割サイクルは、G1相(第1ギャップ相)、複製/S相、G2(第2ギャップ相)、M(ミトティック)相で構成されています。これらの段階を経て、細胞は細胞転写、翻訳、および細胞骨格機構1,2の再構成において劇的な変化を起こします。発達的および環境的な手掛かりに応じて、細胞は一時的に分裂を停止し、静止(G0)になるか、分化し、永久に3を分割しなくなる。DNA損傷などの他のシナリオでは、早期分化またはアポトーシス3,4を引き起こす可能性があります。このようなキューへの応答は、細胞周期チェックポイントによって仲介され、細胞が分割サイクル5の次の段階にコミットする前に、本質的な細胞プロセスの完全性を確保するための監視システムとして機能する。したがって、DNA複製、チェックポイント、および有糸分裂性機械を調節する遺伝子に関する研究では、変異細胞またはこれらの遺伝子のsiRNAノックダウン時に起こり得る細胞周期進行欠陥を分析する必要があります。さらに、このような分析は、全体的な細胞の健康だけでなく、薬物治療に対する細胞応答をテストするために使用することができます。
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プロトコル
1. クリックイットEdUアッセイ用試薬とストックの調製
注:キットに付属のキットと試薬の詳細については、 材料表 と 表1 を参照してください。
- 溶液を準備する前に、バイアルを室温にしてください。
- 2 mLのジメチルスルホキシド(DMSO、C成分)を加えて10mM EdU(成分A)ストック液を調製します。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
- DMSO(成分C)の70μLを加えて、Alexa Fluor 647-azide(成分B)の働く溶液を準備します。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
- この溶液の4 mLを36mLの脱イオン水と混合して、Click-iT EdU反応バッファー(成分D)の1x溶液を調製します。残りの溶液を2~6°Cで保存してください。
- 2 mLの脱イオン水を加えて、Click-iT EdU バッファー添加剤 (成分 F) の 10x ストック (200 mg/mL) を作ります。よく混ぜて-20°Cで保存してください。
- 2-6 °CでHoechst 33342(成分G)を保管してください。 DMSO(コンポーネントC)をデシケータに-20 °Cで保管してください。
メモ: 手袋は、DMSOとHoechstを扱うために使用されるべきです。
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結果
二葉性 ショウジョウバエ 第3次インスター幼虫脳は、基本的な細胞および発達過程9を研究するためのモデルシステムとして利用されてきた。現在の研究の焦点は、CB領域のEdU-およびpH3標識されたNBsにおける細胞周期進行の分析のためのプロトコルを提示することであった(図1)。CB NB はタイプ I とタイプ II にサブタイプ化され、特性非対称分割パターン9が表示されます。各タイプI NB部門は、自己更新が可能なNBと、分化9のために運命付けされた別のGMCを生成する。対照的に、II型NBは、自己更新し、2つの遺伝子組み換え9を生成するトランジット増幅、未熟な神経前駆細胞(INP)を生成します。異なるNB集団はOL領域に存在するが、この研究は、NB特異的マーカーで大きく容易に識別可能なCB NBに焦点を当てた。
この.......
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ディスカッション
EdU の組み込みとその続く細胞透過性アジドとの "クリック" 反応は、前の7で使用した BrdU メソッドよりもこの手法の実用的な利点を提示します。しかし、この反応はCu(I)イオンによって触媒され、いくつかの色素は、この銅触媒の存在下で不安定である可能性があり、Click-it EdUキットメーカーによって明確に助言される。EdU検出ステップを実行した後に免疫染色実験を行った場合、赤色チャネル色素、Alexa Fluor 568およびCy3では期待されるシグナル強度は認められなかった。しかし、このプロトコルは、EdU検出ステップの前に免疫染色反応が完了したときに機能した。このプロトコルでは、4つのチャンネルを使用して、Hoechst、pH3、ミランダ、およびEdUを可視化しました。
このプロトコルのもう一つの最適化されたステップは、幼虫にEdUスパイクフライフードを供給するのではなく、解剖された脳によるEdUの取り込みでした。完全な ショウジョウバエ NB細胞周期は約2-2.5 h
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開示事項
著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。
謝辞
この研究は、スイス国立科学財団(プロジェクト補助金31003A_173188;www.snf.ch)とベルン大学(www.unibe.ch)からBSへの資金提供によって支えられました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集、分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | 3番目のエクソンへのPエレメント挿入 |
| ;Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| 二次抗体 | |||
| ヤギ抗ラット Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| ヤギ抗ラット Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| ヤギ抗ウサギ Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| 試薬/キット | |||
| アクアポリ/マウント | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU組み込みキット、Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider's ショウジョウバエ 中 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 21720-024 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA)フラクション V | メルク | 10735078001 | |
| トリトン X-100 | フィッシャーサイエンティフィ | 9002-93-1 | 非イオン性洗剤 |
| <ストロング>ソフトウェア | |||
| フィジー (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 レーザー走査型共焦点顕微鏡、63倍油浸、1.4 NA プランアポクロマート対物レンズ | |||
| <ストロング>素材 | |||
| アクアポリ/マウント 埋込 媒体 | 水溶性、非蛍光性 埋込 メディウム | ||
| パイレックス3または9 くぼみガラス スポットプレート | |||
| ワットマン ろ紙 |
参考文献
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeut....
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再版と許可
