方法論記事

GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価

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DOI：

10.3791/62643

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2022年2月22日

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J(以下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)の確立と適用について述べています。マウス株から分離された新生児心臓線維芽細胞(NCF)は、誘導心筋細胞(iCM)に変換され、カルシウム(Ca2+)フラックスを介したiCMのリプログラミング効率と機能的成熟の便利かつ効率的な評価を可能にします。

要約

心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復するための潜在的に有望な治療法となっています。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を含む複数の転写因子を導入することにより、線維芽細胞を誘導心筋細胞(iCM)に再プログラムすることができる。これらのiCMは、梗塞した心臓 の中でその場で 発生した場合、電気的および機械的に周囲の心筋と統合し、瘢痕サイズの縮小および心臓機能の改善を招く。iCM のリプログラミング効率、純度、品質が比較的低いため、iCM の特性評価は依然として課題となっています。フローサイトメトリー、免疫細胞化学、qPCRなど、現在使用されている方法は、主に心臓特異的遺伝子とタンパク質発現に焦点を当てていますが、iCMの機能的成熟には焦点を当てていない。行動電位によって引き起こされ、心筋細胞における電圧ゲートカルシウムチャネルの開放は、細胞内にカルシウムの急速な流入をもたらす。従って、カルシウム流入率を定量化することは、心筋細胞機能を評価する有望な方法である。ここで、プロトコルはカルシウム(Ca2+)フラックスによるiCM機能を評価する方法を導入する。αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株は、Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hz/J(ローザ26A-Flox-Stop-C-G3マウス)とTg(Myh6-cre)1Jmk/J(以下のMyh6-Creと呼ばれる)を交合することによって確立されました。P0-P2新生児マウスからの新生児心臓線維芽細胞(NcF)を インビトロで単離して培養し、MGTの多元性構造をNCFに導入し、iCMへの再プログラミングにつながった。正常に再プログラムされたiCMだけがGCaMP3レポーターを発現するので、iCMの機能的成熟は蛍光顕微鏡でCa2+ フラックスによって視覚的に評価することができる。NCF-iCMは、再プログラムされていないNFと比較して、CMと同様に有意なカルシウム過渡束および自発的収縮を示した。このプロトコルは、マウス株の確立、新生児マウス心臓の単離および選択、NCF単離、心臓リプログラミング用レトロウイルスの産生、iCM誘導、レポーターラインを用いたiCM Ca2+ フラックスの評価、および関連する統計分析およびデータ提示について詳細に説明する。ここで説明する方法は、心臓リプログラミング研究のためのiCMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供することが期待される。

概要

心筋梗塞(MI)は世界的に重篤な疾患です。心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因であり、20191年には約1,860万人が死亡しました。過去半世紀の間にCVDの総死亡率は減少した。しかし、この傾向は、CVDのより効果的な治療法を求める一部の未開発国1では減速または逆転しています。CVDの致命的な症状の1つとして、MIは米国のCVDに起因するすべての死亡の約半分を占めています2。虚血の間、冠状動脈の遮断および栄養素および酸素の両方の供給が限られていると、心筋は重度の代謝変化に苦しみ、心筋細胞(CM)の収縮期機能を損ない、CM死3に至る。心血管研究における多数のアプローチは、心臓損傷を修復し、負傷した心臓の機能を回復するために探求されてきた4.直接心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復し、その機能を回復するための1つの有望な戦略として浮上しています5,6。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を導入することにより、線維芽細胞をインビトロおよびインビボでiCMに再プログラムすることができ、それらのiCMは瘢痕領域を減少させ、心臓機能を改善することができる7,8。

心臓リプログラミングはMI治療の有望な戦略ですが、多くの課題が残っています。第1に、リプログラミング効率、純度、品質が期待したほど高いとは限りません。MGT誘導は、vitro7でiCMに再プログラムされる全CFの8.4%(cTnT+)または24.7%(αMHC-GFP+)、またはvivo8で最大35%しか達成できないため、その用途は制限されています。Hand29 や Akt1/PKB10 など、システム内で誘導される因子が多くても、リプログラミング効率は臨床現場で使用されるのにほとんど満足できません。したがって、この分野では、リプログラミング効率の向上に焦点を当てたより多くの研究が必要とされている。第二に、iCMの電気的完全性と収縮特性は、心臓機能の効率的な改善のために重要であるが、これらは評価に挑戦している。現在、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、およびいくつかの主要なCM遺伝子発現のqPCRを含むこの分野で広く使用されている評価方法は、すべてiCMとCMの類似性に焦点を当てていますが、iCMの機能的特性に直接関係していません。さらに、これらの方法は比較的複雑な手順を有し、時間がかかる。リプログラミング研究は通常、iCM成熟11を促進する潜在的なリプログラミング因子のスクリーニングを伴うが、心臓リプログラミングはiCM機能に基づく迅速かつ便利な方法を求める。

CMは、収縮周期の間に細胞膜上の電圧ゲートカルシウムイオンチャネルを開き、細胞間流体から細胞質へのカルシウムイオン(Ca2+)の一過性流入を招き、筋形筋収縮に関与します。このようなCa2+ 流入および流出サイクルは心筋収縮の基本的な特徴であり、CMs12の正常な機能を構成する。したがって、Ca2+ 流入を検出する方法は、CMやCM様細胞(iCMを含む)の機能を測定する潜在的な方法となり得る。さらに、iCMの場合、このような方法は、再プログラミング効率を評価する別の方法を提供する。

遺伝子組み換えカルシウム指標(GECI)は、細胞活動、特に作用電位を示すために開発され、広く使用されています。一般に、GECはカルモジュリンなどのCa2+ 結合ドメインとGFPなどの蛍光ドメインで構成され、GCaMP3は高い親和性と蛍光強度を有するドメインです。GCaMP3の蛍光ドメインは、局所的なカルシウム濃度が変化したときに活性化される13。本論文では、Myh6+細胞においてGCaMP3レポーターを特異的に発現するマウス株について説明する。この株の新生児から分離されたNcFにMGTを導入することにより、リプログラミングは蛍光によって監視することができ、これは正常に再プログラムされたiCMが発揮されます。このようなマウス株および方法は、心臓リプログラミングを調査するための貴重なプラットフォームを提供する。

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プロトコル

動物に関するすべての実験的な手順と実践は、ミシガン大学の施設動物ケア&ユース委員会によって承認されました。細胞培養に関わる実験手順および実践はすべて、無菌条件下でBSL2生物学的安全キャビネットを実施しなければならない。ウイルスに関する手順と実践については、環境や健康への危険を回避するためのトランスフェクト細胞、ピペットチップ、チューブの適切な廃棄のガイドラインに従った。

Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ローザ)26ソルトム38(CAG-GCaMP3)Hze /J(Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)マウス株の確立(図1)

  1. Tg(Myh6-cre)1Jmk/Jマウス株(ジャクソンラボストック009074、Myh6-Creと呼ばれる)とGt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株(ジャクソンラボストック014538、Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)をそれぞれ準備します。
  2. 生後8週間まで各株を飼育し、それぞれ生後6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを得る。
  3. 成体Myh6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを交配した。
    注意:Myh6-Cre男性/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3女性またはその逆を設定します。子孫の間に大きな違いはありません。典型的には、雌マウスは交配後19〜21日後に8〜10匹の子犬を出産する。

2. 新生児 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 マウス心臓の分離と選択.

  1. P0-P2の子犬を得る。このプロトコルで 1000 万の NCF を分離するために、8 ~ 10 個の子犬が存在することを確認します。
  2. 低体温によって子犬を深く麻酔した。ラテックス手袋に子犬を入れ、砕いた氷と水(2°C〜3°C)で首まで浸します。
  3. 75%エタノールで子犬を簡単に消毒します。
  4. 無菌はさみで切断することによって子犬を犠牲にします。
  5. 心臓の近くで水平切開を行い、心臓を絞り、大間の根元をはさみで分離して分離します。
  6. 蛍光顕微鏡で心臓の鼓動を観察します。Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3遺伝子型で心臓を確認し、心臓の鼓動でGCaMP3によって示されるCa2+ フラックスを示しています。他の遺伝子型は蛍光を示さない(図2、 ビデオ1、 およびビデオ2)。

3. 新生児心臓線維芽細胞(NCF)の分離

注: この部分では、この研究に適用される場合、Li Qian博士のLab14 のプロトコルがマイナーな最適化で採用されました。

  1. αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心臓を単離した後、緩く接続された4つの部分に切ります。6 cmプレートの氷冷DPBSで数回徹底的に洗浄し、単離した細胞の血球汚染を制限します。
  2. 心臓を15 mLの円錐形チューブに移します。
  3. 37°Cで8mLの温かい0.25%トリプシン-EDTAで10分間消化します。
  4. トリプシン上清を捨て、5 mLの温かいII型コラゲナーゼ(0.5 mg/mL)をHBSSに加えます。
  5. 混合物を十分にボルテックスし、37°Cで5分間インキュベートする。
  6. インキュベート後、渦を徹底的に、未消化の組織を重力によって落ち着かせる。
  7. 上清を5 mL冷線維芽細胞(FB)培地(20%FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを有するIMDM)を用いた15 mL円錐形チューブに集める。
  8. 未消化組織に対してステップ3.4~3.7を4~5回繰り返します。
  9. 一緒にすべての上清を収集し、40 μmのストレーナーで上清をフィルタリングします。
  10. 4°Cで5分間200xgで遠心分離機を出し、上清を捨てます。
  11. 磁気活性化セルソーティングバッファの10 mLでセルを再中断します(MACSバッファ、2 mM EDTAと0.5%BSAを備えた1x PBS)。
  12. トリパンブルー染色により、生存細胞数を決定します。
    1. ステップ3.11の細胞懸濁液の10 mLから10μLの細胞を取り出す。
    2. 0.4%のトリパンブルー溶液を10 μL混合し、室温で5分間インキュベートします。
    3. 混合物をヘモサイトメーターに加え、生存可能な細胞数を決定する。死んだ細胞は青色に染色され、生存細胞は染色されない。
  13. 4°Cで5分間200xgで細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
  14. 90 μLのチルドMACSバッファーに10μLのThy1.2マイクロビーズを含む細胞を1,000万個未満の生存細胞に再懸濁させます。1000万個を超える生存細胞がある場合は、ビーズを比例的に追加します。混合物をよくピペットし、30〜60分間4°Cでインキュベートします。
  15. 10 mLのMACSバッファを追加し、よく混ぜます。
  16. 200xgで5分間遠心分離機、上清を捨てます。
  17. ステップ 3.15~3.16 を 1 回繰り返します。
  18. 2 mL の MACS バッファを使用してセルとビーズを再サスペンドします。
  19. フードに MACS セパレータを設置します。LS 列をセパレータに挿入し、3 mL の MACS バッファでカラムを平衡化します。
  20. LS 列が平衡化されたら、列を通してセルを渡します。
  21. 2 mL の MACS バッファで LS カラムを 3 回洗浄します。
  22. セパレータからカラムを取り出し、2 mLのMACSバッファで3回溶出し、50 mLチューブへの溶出を集めます。
  23. 5分間200× g で遠心分離機を出し、上清を捨てます。
  24. FBメディアの5 mLでセルを再サスペンドします。
  25. ヘモサイトメーターで細胞数を決定します。
  26. FB培地で細胞を希釈し、必要に応じて皿やプレートに細胞を播種します。細胞の播種密度が2~2.5 x 104 セル/cm2 程度であることを確認します(個々の実験に基づいて密度を最適化します)。付属の線維芽細胞は、播種後2日目に円形に楕円形を持っていることを確認します(図3)。

4. 心臓リプログラミング用ポリシストロニックMGTベクターをコードするレトロウイルスの製造

  1. Plat-E培養培地(DMEMは10%FBS、1 μg/mLのピューロマイシン、10 μg/mLのブラストシジン)を5%CO2で37°Cに維持します。
  2. 1日目に、Plat-Eを約4-5 x 105 細胞/ウェル密度で6ウェルプレートに分割します。
  3. 2日目には、Plat-Eは通常80%の合流度に達する。次の手順で細胞をトランスフェクトします。6ウェルプレートの各ウェルに基づいて、ここに存在する各要素の体積と量を調整します。
    1. PMX-puro-MGTポリシストロニックレトロウイルス発現プラスミドベクター(アプジェネ111809)を2μg希釈し、TEバッファーを用いて500ng/μLに希釈した。
    2. 10 μLのリポフェクタミンを150 μLの減らされた血清培地と混合してトランスフェクション混合物を調製します。慎重にピペットをよく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。ピペットの場合は泡を避けるように注意してください。
    3. 一方、プラスミドと150μLの還元血清培地を混合してプラスミド混合物を調製する。慎重にピペットをよく混ぜ合わせ、室温で5分間インキュベートします。ピペットの場合は泡を避けるように注意してください。
    4. 慎重に2つの混合物を混合し、室温で5分間インキュベートします。ソリューションが曇っているように見えることがあります。
    5. トランスフェクトされる細胞にドロップして混合物を追加します。
    6. 細胞を一晩37°Cでインキュベートする。
  4. 3日目に、ピューロマイシンおよびブラストシジンを欠いた新鮮な完全な細胞培養培地に培地を変更する。
  5. トランスフェクション後4日目、48時間後にレトロウイルスを含む上清を回収し、4°Cで保存します。
  6. トランスフェクションの5日目、72時間後に、レトロウイルスを含む上清を収集する。
  7. 48時間と72時間の両方の上清を0.45 μmフィルターでフィルターし、40%ポリ(エチレングリコール)(PEG)溶液の1/5体積を加えて4°Cで一晩沈殿し、8%PEGの最終濃度を作ります。
  8. ウイルスを沈殿させるために30分間4,000 x g で遠心分離機。
    注:PEG8000-ウイルスは小さな白い沈殿物を形成します。
  9. 必要に応じて8μg/mLポリブレンを含むiCM培地でウイルスを再中断します。すぐにレトロウイルスを使用してください。

5. レトロウイルス感染をコードするMGTを用いたiCMへのNCFのリプログラミング

  1. ウイルス感染前に拡大または通過NCFs。
    注: 通常、NCF は 2 回通過できます。
  2. 0日目に、FB培地で1-2 x 104 セル/cm2 の周りの密度にNCFをシードします。
  3. 1日目に、必要に応じて各々のウイルス含有培地で培地を交換する。1つの井戸Plat-Eからウイルスを6ウェルプレートに使用して、24ウェルプレートの2つの井戸に感染します。ウイルスを引き立て、最適なウイルス濃度を決定する。
    注: 他のリプログラミング要因を含むウイルスは、MGT レトロウイルスと共に導入される可能性があります。
  4. 一晩で37°Cでインキュベートする。
  5. ウイルス感染後2日目、24時間後に、ウイルス含有培地を通常のiCM培地に交換する。
  6. GCaMP3発現を監視するには、反転蛍光顕微鏡の下にプレートします。GFPチャネルで10xの下で、早ければ5日目に細胞の一部の軽度の基礎GCaMP3蛍光を観察する。
  7. リプログラミング中に2〜3日ごとに培地を交換してください。必要に応じて、2 μg/mLのピューロマイシンを培地に3日間添加し、1μg/mLで維持することにより、MGTレトロウイルス感染細胞に対して陽性選択を行います。
    注:中程度の変化と共に、関心のある化学物質(例えば、IGF-1、MM589、A83-01、PTC-209、以前報告されたIMAPと呼ばれる)を導入してください。
  8. 14日間の感染後、培地をB27培地に置き換えて、iCM成熟をさらに誘導する。

6. Ca2+ フラックスによるiCM機能成熟と再プログラミング効率の評価

注:必要に応じて、評価前に評価する細胞に1μMイソプロテレノールを加えます。

  1. 室温で蛍光顕微鏡を反転してCa2+ フラックスを評価します。
  2. GFP チャンネルでは、GCaMP3+ セルを 10x の目標で観察します。明視野チャネルで自発的な細胞拍動を示していることを確認します。
  3. 20x の下の 3 つのフィールドをランダムに選択し、各フィールドの 3 分間、iCM の Ca2+ フラックスを記録します。
    注: ここでは、Ca2+ フラックスは自発的なセルの拍動と同期していました(図 4、図 5、およびビデオ 3、ビデオ 4、ビデオ 5、ビデオ 6、ビデオ 7、ビデオ 8)。
  4. Ca2+フラックスを使用して細胞を手動で定量化します。

7. 統計分析とデータの表示

  1. グループ間の差異を一方向分散分析(ANOVA)で分析し、学生-ニューマン・キュースの多重比較検定を実行します。
    注: 結果は S.E±平均値であり、p < 0.05 は統計的に有意であると見なされます。各実験は少なくとも3回行った。

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結果

Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株およびトランスジェニックマウスの遺伝子構造を生成する実験的ワークフローを図1に示す。マウス株が確立されている間、子犬の心臓を単離し、逆蛍光顕微鏡で観察し、遺伝子型を確認した。正しい遺伝子型を持つ心臓は、Ca2+フラックスが拍動と同期し、GCaMP3蛍光として視覚化され、コントロール心臓では蛍光は観察されなかった(図2、ビデオ1、 およびビデオ2)。隔離された NCF は 2 時間以内にウェルに接続し、シードの 1 日後に円形から円形までの楕円を示します(図 3)。iCMの機能成熟度とリプログラミング効率は、MGT導入後14日後にCa2+フラックスによって評価された。再プログラムされた細胞は、蛍光顕微鏡下で評価してCa2+フラックスを測定すること...

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ディスカッション

iCM機能の評価は、心臓リプログラミング分野で必要です。本稿では、プロトコルは、確立されたTg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株、この株の新生児マウスから分離されたNDFを使用してiCmに再プログラミングする方法、およびCa2+ フラックスによるiCMs関数の評価について説明しています。これは、iCM機能成熟を評価する デノボ 法である。

この方法を使用して正しく再プログラミングおよび評価を行う場合、いくつかの重要な手順が重要です。まず、NCFは、孤立後に新たに準備され、健康でなければなりません。心臓の分離と切断の迅速な手順が不可欠です。最も重要なことは、過剰消化と細胞の生存率と状態の減少を避けるためにインキュベーション時間に従うことが重要です。第二に、すべての手順の中で、ウイルス感染効率は、多くの場合、結果に高い変動を導入します。ウイルス感染効率は、主に2つの要因によって影響される。一方で、ウイルス力計は、トランスフェクトされたプラスミド量お...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この原稿の英語のテキストを編集するレオ・グナトフスキーの努力に感謝します。図 1 は、BioRender.com で作成されています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)によって支援されました (1R01HL109054) 王博士への助成金.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mLコニカル遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック14-959-70C
50mL コニカル遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック14-959-49A
6ウェル細胞培養プレートアルカリサイエンティフィックTP9006
A83-01ステムジェント04–0014
オールインワン蛍光顕微鏡KeyenceBZ-X800E倒立型蛍光顕微鏡
B-27 Supplement (50X)、無血清サーモフィッシャーサイエンティフィック17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィA1113903
ウシ血清アルブミン (BSA) DNase-およびプロテアーゼフリー 粉末サーモフィッシャーサイエンティフィック
BP9706100 CD90.2 MicroBeads, mouseMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 Microbeads
コラゲナーゼ, Type 2サーモフィッシャーサイエンティフィックNC9693955
計数チャンバーサーモフィッシャーサイエンティフィック02-671-51B血球計算盤
DMEM, 高グルコース, グルタミン無しサーモフィッシャーサイエンティフィック11960069
DPBS,カルシウム、マグネシウムサーモフィッシャーサイエンティフィック14-040-133
エタノール、200プルーフ (100%)サーモフィッシャーサイエンティフィック04-355-451
エチレンジアミン四酢酸(ACS認定)サーモフィッシャーサイエンティフィックE478-500
ウシ胎児血清コーニング35-010-CV
HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなしサーモフィッシャーScientific14025092
IMDM 培地サーモフィッシャーサイエンティフィック12440053
IX73 倒立顕微鏡オリンパスIX73P2F倒立蛍光顕微鏡
リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬サーモフィッシャーサイエンティフィック11-668-019
LS カラムMiltenyi Biotec130-042-401
培地 199、Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACSセパレーターおよびスターティングキットMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HVシリンジフィルターユニット、0.45 &マイクロ;メートル、PVDF、33 mm、ガンマ滅菌ミリポアシグマSLHV033RB
MM589Shaomeng Wang博士から入手ミシガン大学の
研究室 Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31-985-070
PBS, pH 7.4Thermo Fisher Scientific10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line Cell BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
ポリ(エチレングリコール)ミリポアシグマP5413-1KG
PEG8000 ポリブレン感染/トランスフェクション試薬ミリポアシグマTR-1003-G
PTC-209シグマSML1143–5MG
ピューロマイシン二塩酸塩サーモフィッシャーサイエンティフィックA1113803
組換えヒト IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640 中サーモフィッシャーサイエンティフィックサイエンティフィック 11875093
ST 16 遠心分離機 シリーズサーモフィッシャーサイエンティフィック75-004-381
滅菌セルストレーナーサーモフィッシャーサイエンティフィック22-363-54740 µm ストレーナー
表面処理組織培養皿サーモフィッシャーサイエンティフィックFB012921
TEバッファーサーモフィッシャーサイエンティフィック12090015
トリパンブルー溶液ミリポアシグマT8154
トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッドサーモフィッシャーサイエンティフィック25300054
ボルテックスミキサーサーモフィッシャーサイエンティフィック
ック 02215365

参考文献

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