ここでは、Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J(以下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)の確立と適用について述べています。マウス株から分離された新生児心臓線維芽細胞(NCF)は、誘導心筋細胞(iCM)に変換され、カルシウム(Ca2+)フラックスを介したiCMのリプログラミング効率と機能的成熟の便利かつ効率的な評価を可能にします。
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方法論記事
GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復するための潜在的に有望な治療法となっています。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を含む複数の転写因子を導入することにより、線維芽細胞を誘導心筋細胞(iCM)に再プログラムすることができる。これらのiCMは、梗塞した心臓 の中でその場で 発生した場合、電気的および機械的に周囲の心筋と統合し、瘢痕サイズの縮小および心臓機能の改善を招く。iCM のリプログラミング効率、純度、品質が比較的低いため、iCM の特性評価は依然として課題となっています。フローサイトメトリー、免疫細胞化学、qPCRなど、現在使用されている方法は、主に心臓特異的遺伝子とタンパク質発現に焦点を当てていますが、iCMの機能的成熟には焦点を当てていない。行動電位によって引き起こされ、心筋細胞における電圧ゲートカルシウムチャネルの開放は、細胞内にカルシウムの急速な流入をもたらす。従って、カルシウム流入率を定量化することは、心筋細胞機能を評価する有望な方法である。ここで、プロトコルはカルシウム(Ca2+)フラックスによるiCM機能を評価する方法を導入する。αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株は、Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hz/J(ローザ26A-Flox-Stop-C-G3マウス)とTg(Myh6-cre)1Jmk/J(以下のMyh6-Creと呼ばれる)を交合することによって確立されました。P0-P2新生児マウスからの新生児心臓線維芽細胞(NcF)を インビトロで単離して培養し、MGTの多元性構造をNCFに導入し、iCMへの再プログラミングにつながった。正常に再プログラムされたiCMだけがGCaMP3レポーターを発現するので、iCMの機能的成熟は蛍光顕微鏡でCa2+ フラックスによって視覚的に評価することができる。NCF-iCMは、再プログラムされていないNFと比較して、CMと同様に有意なカルシウム過渡束および自発的収縮を示した。このプロトコルは、マウス株の確立、新生児マウス心臓の単離および選択、NCF単離、心臓リプログラミング用レトロウイルスの産生、iCM誘導、レポーターラインを用いたiCM Ca2+ フラックスの評価、および関連する統計分析およびデータ提示について詳細に説明する。ここで説明する方法は、心臓リプログラミング研究のためのiCMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供することが期待される。
概要
心筋梗塞(MI)は世界的に重篤な疾患です。心血管疾患(CVD)は世界の主要な死因であり、20191年には約1,860万人が死亡しました。過去半世紀の間にCVDの総死亡率は減少した。しかし、この傾向は、CVDのより効果的な治療法を求める一部の未開発国1では減速または逆転しています。CVDの致命的な症状の1つとして、MIは米国のCVDに起因するすべての死亡の約半分を占めています2。虚血の間、冠状動脈の遮断および栄養素および酸素の両方の供給が限られていると、心筋は重度の代謝変化に苦しみ、心筋細胞(CM)の収縮期機能を損ない、CM死3に至る。心血管研究における多数のアプローチは、心臓損傷を修復し、負傷した心臓の機能を回復するために探求されてきた4.直接心臓リプログラミングは、損傷した心臓を修復し、その機能を回復するための1つの有望な戦略として浮上しています5,6。Mef2c、Gata4、Tbx5(MGT)を導入することにより、線維芽細胞をインビトロおよびインビボでiCMに再プログラム....
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プロトコル
動物に関するすべての実験的な手順と実践は、ミシガン大学の施設動物ケア&ユース委員会によって承認されました。細胞培養に関わる実験手順および実践はすべて、無菌条件下でBSL2生物学的安全キャビネットを実施しなければならない。ウイルスに関する手順と実践については、環境や健康への危険を回避するためのトランスフェクト細胞、ピペットチップ、チューブの適切な廃棄のガイドラインに従った。
Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ローザ)26ソルトム38(CAG-GCaMP3)Hze /J(Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)マウス株の確立(図1)
- Tg(Myh6-cre)1Jmk/Jマウス株(ジャクソンラボストック009074、Myh6-Creと呼ばれる)とGt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株(ジャクソンラボストック014538、Rosa26A-Flox-ストップフロックス-GCaMP3と呼ばれる)をそれぞれ準備します。
- 生後8週間まで各株を飼育し、それぞれ生後6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを得る。
- 成体Myh6-CreとRosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスを交....
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結果
Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス株およびトランスジェニックマウスの遺伝子構造を生成する実験的ワークフローを図1に示す。マウス株が確立されている間、子犬の心臓を単離し、逆蛍光顕微鏡で観察し、遺伝子型を確認した。正しい遺伝子型を持つ心臓は、Ca2+フラックスが拍動と同期し、GCaMP3蛍光として視覚化され、コントロール心臓では蛍光は観察されなかった(図2、ビデオ1、 およびビデオ2)。隔離された NCF は 2 時間以内にウェルに接続し、シードの 1 日後に円形から円形までの楕円を示します(図 3)。iCMの機能成熟度とリプログラミング効率は、MGT導入後14日後にCa2+フラックスによって評価された。再プログラムされた細胞は、蛍光顕微鏡下で評価してCa2+フラックスを測定すること.......
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ディスカッション
iCM機能の評価は、心臓リプログラミング分野で必要です。本稿では、プロトコルは、確立されたTg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/Jマウス株、この株の新生児マウスから分離されたNDFを使用してiCmに再プログラミングする方法、およびCa2+ フラックスによるiCMs関数の評価について説明しています。これは、iCM機能成熟を評価する デノボ 法である。
この方法を使用して正しく再プログラミングおよび評価を行う場合、いくつかの重要な手順が重要です。まず、NCFは、孤立後に新たに準備され、健康でなければなりません。心臓の分離と切断の迅速な手順が不可欠です。最も重要なことは、過剰消化と細胞の生存率と状態の減少を避けるためにインキュベーション時間に従うことが重要です。第二に、すべての手順の中で、ウイルス感染効率は、多くの場合、結果に高い変動を導入します。ウイルス感染効率は、主に2つの要因によって影響される。一方で、ウイルス力計は、トランスフェクトされたプラスミド量お.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この原稿の英語のテキストを編集するレオ・グナトフスキーの努力に感謝します。図 1 は、BioRender.com で作成されています。この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)によって支援されました (1R01HL109054) 王博士への助成金.
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 mLコニカル遠心チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-959-70C | |
| 50mL コニカル遠心チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-959-49A | |
| 6ウェル細胞培養プレート | アルカリサイエンティフィック | TP9006 | |
| A83-01 | ステムジェント | 04–0014 | |
| オールインワン蛍光顕微鏡 | Keyence | BZ-X800E | 倒立型蛍光顕微鏡 |
| B-27 Supplement (50X)、無血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 17504044 | |
| Blasticidin S HCl (10 mg/mL) | サーモフィッシャーサイエンティフィ | A1113903 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) DNase-およびプロテアーゼフリー 粉末 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | ||
| BP9706100 CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec | 130-049-101 | Thy1.2 Microbeads |
| コラゲナーゼ, Type 2 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | NC9693955 | |
| 計数チャンバー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 02-671-51B | 血球計算盤 |
| DMEM, 高グルコース, グルタミン無し | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11960069 | |
| DPBS,カルシウム、マグネシウム | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 14-040-133 | |
| エタノール、200プルーフ (100%) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 04-355-451 | |
| エチレンジアミン四酢酸(ACS認定) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | E478-500 | |
| ウシ胎児血清 | コーニング | 35-010-CV | |
| HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドなし | サーモフィッシャーScientific | 14025092 | |
| IMDM 培地 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12440053 | |
| IX73 倒立顕微鏡 | オリンパス | IX73P2F | 倒立蛍光顕微鏡 |
| リポフェクタミン 2000 トランスフェクション試薬 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 11-668-019 | |
| LS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| 培地 199、Earle's Salts | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | |
| MidiMACSセパレーターおよびスターティングキット | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| Millex-HVシリンジフィルターユニット、0.45 &マイクロ;メートル、PVDF、33 mm、ガンマ滅菌ミリ | ポアシグマ | SLHV033RB | |
| MM589 | Shaomeng Wang博士から入手ミシガン大学の | ||
| 研究室 Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line Cell | Biolabs | RV-101 | |
| pMx-puro-MGT | Addgene | 111809 | |
| ポリ(エチレングリコール) | ミリポアシグマ | P5413-1KG | |
| PEG8000 ポリブレン感染/トランスフェクション試薬 | ミリポアシグマ | TR-1003-G | |
| PTC-209 | シグマ | SML1143–5MG | |
| ピューロマイシン二塩酸塩 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A1113803 | |
| 組換えヒト IGF-I | Peprotech | 100-11 | |
| RPMI 1640 中 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | サイエンティフィック 11875093 | |
| ST 16 遠心分離機 シリーズ | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 75-004-381 | |
| 滅菌セルストレーナー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 22-363-547 | 40 µm ストレーナー |
| 表面処理組織培養皿 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | FB012921 | |
| TEバッファー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 12090015 | |
| トリパンブルー溶液 | ミリポアシグマ | T8154 | |
| トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 25300054 | |
| ボルテックスミキサー | サーモフィッシャーサイエンティフィック |
参考文献
- Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
- Virani, S., et al.
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再版と許可
