Method Article

マウス脳におけるエンハンサーベースの発現コンストラクトのin vivo でのAAV展開

DOI:

10.3791/62650

⸱

March 31st, 2022

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Behavioral Sciences, University of California, Davis, 2Department of Neurobiology, Physiology and Behavior, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、新規rAAVベースの一過性エンハンサー-レポーターアッセイを記載しています。このアッセイは、マウス脳において in vivo でエンハンサー駆動発現を誘導するために使用することができる。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エンハンサーは、組織および細胞型特異的遺伝子の特異的発現パターンを駆動する多様な転写因子の結合プラットフォームです。ノンコーディングDNAとさまざまなクロマチン状態を評価する複数の手段は、ゲノム中のエンハンサー配列の存在を予測するのに有用であることが証明されていますが、これらの配列の活性を検証し、それらが活性である器官と発生段階を見つけることは労働集約的なプロセスです。アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの最近の進歩により、マウス組織への導入遺伝子の広範な送達が可能になり、トランスジェニック動物を必要とせずに in vivo エンハンサー試験が可能になりました。このプロトコルは、それ自体では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下でEGFPを発現するレポーターコンストラクトを使用して、マウス脳内の候補エンハンサー配列の活性パターンを研究する方法を示しています。AAVパッケージレポーターコンストラクトをマウスの脳に送達し、1〜4週間インキュベートした後、動物を屠殺し、脳切片を顕微鏡で観察します。EGFPは、試験されたエンハンサーが遺伝子発現を開始するのに十分である細胞に現れ、エンハンサーが脳内で活性である位置および発生段階を特定する。標準的なクローニング法、低コストのAAVパッケージング、および拡張AAV血清型と in vivo 送達および標準的なイメージング読み出しのための方法により、これは脳内で遺伝子発現がどのように調節されるかを研究するためのアクセス可能なアプローチになります。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

エンハンサーは、転写因子結合部位として機能するゲノムシス調節要素であり、時空間的に特異的な方法で標的遺伝子の発現を駆動することができます1,2。それらは、異なる細胞型、組織、および発生段階で差動的に活性であり、疾患リスク関連のゲノム変異の基質となり得る3,4。したがって、エンハンサー機能のダイナミクスを理解する必要性は、ゲノミクス内のトランスレーショナルサイエンスアプリケーションと基礎科学アプリケーションの両方で進歩するために重要です。インシリコエンハンサー活性の予測は、エンハンサー能力に関する仮説を生成するための優れたリソースとして役立ち得る5、6。そのような予測されたエンハンサー活性は、機能的活性を完全に理解するために追加の検証および尋問を必要とし得る。エンハンサーレポーターアッセイは、細胞から動物まで、さまざまなシステムでこの目的のために価値があることが証明されています7、8、9。柔軟で費用対効果の高い一過性のin vivoコンテキストでこれらの研究を拡張するために、このプロトコルは、生後マウス脳における異所性レポーター遺伝子の発現を促進する能力について推定エンハンサー配列をテストするためのin vivoAAVベースの方法の使用について説明しています。この一連の方法は、単一の候補配列または並行ライブラリスクリーニングを調べるための有用性があり、基礎研究およびトランスレーショナル研究に関連しています。

この方法は、レポーター遺伝子(ここではEGFP)を有する推定エンハンサー候補DNA配列を単一のプラスミド中で組み合わせ、単独では有意な発現を駆動しない最小限のプロモーターの制御下にある。プラスミドは組換えAAV(rAAV)にパッケージされ、動物モデルに注入されます。ここでの応用は脳へのものであるが、様々なrAAV血清型は、異なる組織型にわたる感染を可能にするので、このアプローチを他のシステムに拡張することができる10。一定期間後、脳を収集し、レポーター遺伝子の発現についてアッセイすることができる。強い発現は、対照と比較して、試験された候補配列が遺伝子の発現を「増強」することができたことを示す(図1)。このシンプルなデザインは、脳内のin vivo でのエンハンサー活性のシーケンスをテストするための簡単で明確なアプローチを提供します。

配列のエンハンサー能力の試験に加えて、この方法は、細胞型エンハンサー活性を決定するための技術と組み合わせることができる。差次的エンハンサー活性を決定するための配列ベースのアプローチでは、DNAおよびRNAシーケンシングの前に細胞型特異的マーカーで細胞を選別することで、Gisselbrechtら11に記載されているように、異なる細胞型が異なるエンハンサー活性を示すかどうかを研究者が判断できます。イメージングベースのアプローチでは、細胞型特異的マーカーと画像を共標識することで、エンハンサー駆動蛍光を示す細胞が目的の細胞型マーカーも表示するかどうかを調べることができます12、13、14、15、16。エンハンサーレポーターアッセイは、エンハンサー能力への影響について、エンハンサーのリスク関連対立遺伝子変異を直接試験することができます。ゲノムワイド関連研究(GWAS)で同定されたリスク遺伝子座の大部分は、ゲノム17の非コード領域にあります。これらのリスク遺伝子座の機能的アノテーション研究は、大部分がエンハンサーとして作用する可能性が高いことを示している18、19、20。インビボでのMPRA展開は、脳におけるエンハンサー活性についてのこれらのリスク関連変異体の試験を可能にすることができる12、21。最後に、異なる時点での送達および収集は、エンハンサーが活性である発達段階への洞察を提供することができる。

エンハンサーレポータープラスミドの設計は多様であり、実験目標に合わせてカスタマイズできます。エンハンサー研究で使用されてきた最小プロモーターには、ヒトβグロビン最小プロモーター22やマウスHsp68最小プロモーター23など、いくつかのオプションがあります。これらのプロモーターは、それらを活性化するためにエンハンサー要素と結合しない限り、低レベルの発現を駆動することが知られている。対照的に、構成的プロモーター要素は導入遺伝子の強い発現を駆動し、ポジティブコントロールまたは堅牢な発現の背景に対するエンハンサー機能の試験に有用である。構成的プロモーターの一般的な選択肢には、CAG、ニワトリβアクチンプロモーターおよびサイトメガロウイルス即時早期エンハンサー24に由来するハイブリッドプロモーター、またはヒトEF1α25が含まれる。エンハンサーは双方向に働くことが知られているので26、最小プロモーターに対するエンハンサーの向きおよび位置は柔軟である(図2A)。従来のエンハンサー−レポーターアッセイは、エンハンサーをプロモーターの上流に配置し、ライブラリー送達において、シーケンシングリードを試験されたエンハンサー27に関連付けるために、レポーター遺伝子の下流にバーコード配列を含む。しかしながら、エンハンサーは、STARR-seq28で行われているように、レポーター遺伝子のオープンリーディングフレームに配置し、それら自身のバーコード配列として機能することもできる。ここで説明するプロトコルは、STARR-seqアッセイデザインを利用し、候補エンハンサー配列をレポーター遺伝子の3' UTRに配置します。STARR-seqオリエンテーションは、より合理化されたクローニングの利点を提供しますが、従来のアプローチよりもよく理解されておらず、コンストラクト間の可変RNA安定性を誘導する可能性があります。記載された方法は、他の箇所に記載されているクローニングプロセスにわずかな変更を加えるだけで、STARR−seqまたは従来のオリエンテーションのいずれかに容易に適合させることができる27、29。

AAV送達のさまざまな方法を採用して、実験目標に合わせてこの手法をさらにカスタマイズできます(図2B)。このプロトコールにさらに記載される直接頭蓋内注射は、高濃度のウイルスを脳30に直接送達する。これにより、注入部位を中心とした高い形質導入効率が得られ、組織の領域にわたって形質導入細胞の密度を最大化しようとする実験に最適な技術となります。定位注射は、再現性のある局所形質導入のために動物全体の注射部位を標準化するのに役立ちます。頭蓋内注射は、出生後初期の動物で最も簡単です。代替技術として、全身注射は、血液脳関門31を通過することができる血清型を有するAAVを用いて導入遺伝子を送達することができる。尾静脈注射は、ウイルスが体中を循環することを可能にし、多くの組織にわたる一般的な送達を可能にします10。眼窩後注射は、眼の後ろのウイルスを眼窩後洞32に送達する別の全身注射技術である。これは、静脈系から脳へのAAVのためのより直接的な経路を提供し、より多くの末梢血管への注射よりも脳内の形質導入細胞のより高い濃度をもたらす33。

この技術のもう一つの柔軟な側面は、読み出しの方法です。大まかに言えば、オプションはレポーターベースまたはシーケンシングベースとして説明できます(図2C)。GFPなどの蛍光レポーターをコンストラクトのオープンリーディングフレームに組み込むと、候補エンハンサーが発現を促進した形質導入細胞において蛍光タンパク質が発現します。免疫組織化学などの標識およびイメージング技術により、シグナル増幅が可能になります。シーケンシングベースの読み出し技術は、組織から収集されたRNA中の送達された構築物から配列を同定することを含む。最初に送達されたウイルスDNAの量を定量することにより、発現されたRNAと送達されたDNAの比較を使用して、例えば超並列レポーターアッセイ(MPRA)の状況において、試験されたエンハンサー配列が導入遺伝子の発現増加をどの程度促進できるかを決定することができる。MPRAは、これらの技術の強力な拡張を提供して、最大数千の候補エンハンサーの活性を同時にテストし、ゲノミクス研究で広く説明されています12、27、34、35、36。候補エンハンサーのクローニング、パッケージング、デリバリー、およびシーケンシングのステップを個別にではなくバッチで実行することにより、より高いスループットスクリーニングが実現されます。

候補エンハンサーの選択は、柔軟性のための別の機会を提供する(図2D)。例えば、このアッセイは、特定の遺伝子のエンハンサーの同定、目的の非コードDNA領域の機能の確認、またはエンハンサーが活性である特定の細胞型または発生段階の決定に使用できます。一般に、候補エンハンサーの選択は、エンハンサー活性の インシリコ 予測によって駆動される。一般に、 インシリコ 予測には、H3K27ac37 やクロマチンアクセシビリティマッピング38などのエンハンサーの可能性を示すヒストン修飾のChIP-seqが含まれます。最後に、成長している研究分野は、合成的に設計されたエンハンサー要素の機能ベースのスクリーニングであり、エンハンサー配列が機能39 をどのように指示するかの研究と、特定の特性を持つエンハンサーの設計を可能にします40。

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Protocol

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このプロトコルは、カリフォルニア大学デービス校の施設動物管理および使用委員会(プロトコル#22339)およびカリフォルニア大学デービス校の施設バイオセーフティ委員会(BUA-R1903)によって承認されています。このプロトコルは、生後0〜1日目に男女のC57BL / 6Jマウスでテストされています。

1.エンハンサー候補配列をAAVベクタープラスミドにクローニングします。

注:代表的なプロトコルが示されていますが、クローニング戦略には高度な柔軟性があります。

  1. レポーター構成を選択または設計します。ここで、エンハンサー候補は、Hsp68最小プロモーターの制御下で発現されるEGFPレポーター遺伝子の3'非翻訳領域(UTR)に挿入される。
    注:このアッセイに適した多くのMPRAプラスミド構築物がAddgene41 に寄託されており、研究用途に利用できます。
  2. 目的の配列を増幅するためのPCRプライマーを設計します。プライマーの5'末端に、ギブソンクローニングに適した相同性アームを追加します(挿入位置の上流の配列5'に対応する~35 bp、フォワードプライマーのトップストランド、リバースプライマーのボトムストランド)。
    注:ベースプライマー配列の長さが~18-24 bp、GC含量が~50%-60%で、融解温度が約57-59°Cであることを確認してください。
  3. 設計したプライマーを使用してDNAサンプルからPCRを実行します。
    1. 表1に記載されているように、PCR反応ミックスを0.2 mL PCRチューブに組み立てます。
    2. PCR反応混合物をサーマルサイクラーに置き、 表1に記載されているプログラムに従ってサイクルします。
    3. 5 μLのPCR産物を0.7%〜1%のアガロースゲル上で100 Vで30〜60分間実行して、PCRの成功を確認します。予測された長さのフラグメントを確認します。
    4. 市販の酵素反応クリーンアップカラムキットを使用してPCR産物をクリーンアップします。最終溶出液はクローニングインサートです。
  4. 制限酵素処理を実行して、固有のクローニング部位でAAVベクターを線形化し、エンハンサーをベクターに挿入します。
    1. ここで使用されるエンハンサーレポーターコンストラクトの3' UTRのクローニング部位は、固有のPacIおよびAscI制限部位によって囲まれています。以下のパラメータに従ってこの位置でプラスミドを線形化するためのダイジェストを実行します(ステップ1.4.2-1.4.4)。
    2. 必要なクローニング反応の数に応じて、PacIおよびAscIを使用して1〜10 μgのベクターDNAを消化します。製造元の指示に従って、付属のバッファーを使用して反応を調製します。
    3. 37°Cで1〜2時間インキュベートし、ベクターDNAを消化します。(50 μLの反応で5 μg以上を消化する場合は、より長いインキュベーションが必要になる場合があります。
    4. 1〜2時間のインキュベーション後、65°Cで20分間インキュベートすることにより酵素を失活させます。
    5. 制限ダイジェストフラグメントを、0.7%〜1%のアガロースゲルを使用したゲル電気泳動で分離し、100 Vで30〜60分間実行します。
    6. 直鎖化ベクターのバンドを切除し、市販のゲル抽出キットを使用して精製します。
  5. ギブソンクローニング反応を実行し、変換します
    1. 分光光度計を使用して、精製ベクターおよびクローニングインサートの濃度を測定します。
      注:DNAは260nmの光を吸収し、汚染物質は230nmと280nmの光を吸収します。260/230および260/280の高い比率(>1.8)は、高度に精製されたDNAを示します。
    2. ギブソンクローニング反応を0.2 mL PCRチューブで組み立てます:5 μLの2xギブソンマスターミックス、0.02-0.5 pmolのDNAフラグメントを3:1のインサート対ベクターの比率で(反応に最適なDNA濃度は経験的に決定する必要があります)およびヌクレアーゼフリー水(容量を10 μLにします)。
    3. ギブソン反応をサーマルサイクラーで50°Cで20分間インキュベートします。
  6. 形質転換組換え欠損(recA-)コンピテント大腸菌(大腸菌)。
    1. ウォーターバスを42°Cに設定し、市販のコンピテントセルを氷上で解凍します。
      注:このステップはステップ1.4の前に行うことができ、ギブソン反応の準備とインキュベーション中に細胞が解凍できます。
    2. 30〜50 μLの細胞を2.0 mLの微量遠心チューブに分注します。2μLのギブソン反応をアリコートに加え、チューブにギブソンのアイデンティティをラベル付けします。細胞を氷上で30分間インキュベートします。
      注:ポジティブコントロールとして5〜10 ngの未消化の空のベクターを使用し、ネガティブコントロールとして水を使用します。
    3. 細胞を42°Cの水浴中で30〜45秒間ヒートショックし、すぐにチューブを氷に戻し、5分間回復させます。
    4. 氷上で、市販の回収培地を400〜950 μL加えます。
      注:これらの実験で使用された回収培地には、2%の植物性ペプトン、0.5%の酵母抽出物、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、10 mM MgCl2、10 mM MgSO4、および20 mMグルコースが含まれています。
    5. 氷上で回収した後、37°Cで250 RPMの穏やかな攪拌で30〜60分間インキュベートすることにより、細胞を完全に回収します。
    6. 5,000 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、400 μLの上清を除去し、~50 μLの細菌をプレートに残します。
    7. 選択培地にプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。
      注:これらの実験で使用された選択培地には、1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、1〜2%寒天、96〜97%水、およびカルベニシリンが100μg/ mLの濃度で含まれています。ウイルスの逆末端リピート(ITR)は一致する配列を持ち、相同組換えを受ける可能性があるため、ウイルスプラスミドのクローニングには常に組換え欠損菌株を使用してください。しかしながら、細菌のrecA− 株は依然として低レベルの組換えを受ける。ここで使用されるレポータープラスミドは自己相補性AAVであり、ITRの1つの配列が変更され、他のITRと完全に一致しなくなりました。相同組換えの速度をさらに遅くするために、30°Cで細菌を増殖させることも推奨されます。
  7. クローンを検証し、プラスミドを回収します。
    1. ベクターにアニールするフォワードプライマーとリバースプライマー(材料表)を使用して、インサート位置に隣接してPCRマスターミックスを調製します。10 μLの容量を0.2 mL PCRストリップチューブに分注します。
    2. 14 mLの丸底チューブで、PCRおよび陰性対照を介してテストされるコロニーごとに1つずつ、5 mLの抗生物質選択的LBブロスのアリコートを準備します。
    3. 滅菌爪楊枝またはピペットチップを使用して個々のコロニーを選び、コロニーを1本のPCRチューブの底に大まかにこすり落とします。
    4. コロニーがPCRマスターミックスに解離したら、つまようじまたはチップをLBアリコートの1つに落とし、14 mLチューブにギブソン反応とPCRチューブ番号をラベル付けします。
    5. コロニーPCR反応をサーマルサイクラーに置き、 表2に記載のプログラムでサイクルします。
    6. つまようじまたはピペットチップを接種した5 mLの液体培養液を、37°Cおよび180RPMに設定された振とうインキュベーターでインキュベートします。
    7. コロニーPCR反応を0.7%-1%アガロースゲル上で100 Vで30-60分間実行し、ゲルドキュメントイメージングシステムでバンドを可視化します。
    8. 予測されたPCRバンドを表示しない5 mL培養液を廃棄します。
    9. 正常に統合されたクローンごとに、5 mLの培養液を一晩増殖させてから、市販のキットを使用して4.5 mLからプラスミドミニプレップを実行します。液体培養液0.5 mLを保存し、グリセロールストックとして-80°Cで保存します。
    10. プラスミドに含まれる導入遺伝子に望ましくない変異がないことを、サンガーシーケンシング42を用いて確認する。
    11. レポーターコンストラクトのクローニングに成功したことを確認したら、保存したグリセロールストックを使用して5 mLスターターカルチャーに接種し、30°Cおよび180 RPMの振とうインキュベーターで8〜16時間増殖させます。
    12. ブロスが濁ったら、スターターカルチャーを250〜300 mLの新鮮な選択的LBブロスで1,000倍に希釈し、30°Cおよび180RPMの振とうインキュベーターで少なくとも一晩インキュベートします。次いで、市販のプラスミドマキシキットを用いてプラスミドを精製する。
      注:細菌は37°Cと比較して30°Cでよりゆっくりと成長しますが、これは大規模な培養物を成長させるときに自発的組換えの速度を遅くするのに最適な温度です。
    13. XmaI ダイジェストを実行し、手順 1.4.2 から 1.4.5 を使用して ITR の再結合をテストし、PacI と AscI の代わりに XmaI を置き換えます。ゲルドキュメントイメージングシステムでバンドを視覚化します。
      注:両方のITRが存在するrAAVプラスミドは、この消化に続いてゲル上に2つのバンドを生成します:1つはrAAVゲノムの長さ、もう1つは残りのプラスミド骨格の長さです。バンドが1つしかない場合、ITRは相同組換えを受けており、rAAVプラスミドはウイルス粒子をパッケージングすることができません。ここで説明するrAAVプラスミド骨格は、XmaIサイトがITRにのみ存在するように設計されています。エンハンサー候補インサートにXmaIサイトも含まれている場合は、それに応じて予測バンド結果と分析を更新します。

2.パッケージ化されたrAAVを入手します。

  1. この研究の実験には、パッケージ化されたrAAV(専門的または社内)を使用してください。
    注:rAAVをパッケージ化するための多くのオプションがあります。rAAVは、企業または大学の中核施設で専門的にパッケージ化することができます。rAAVは、複雑さおよび特殊な機器の必要性に及ぶ異なる技術を使用して社内でパッケージ化することもできる43,44。 主な関心事は、高品質であり、感染力価が高い確実性に決定されたベクターを得ることです。専門的にパッケージ化されたrAAVと社内パッケージの両方のrAAVを、この研究で説明されているさまざまな実験に使用しました。

3.rAAVパッケージプラスミドを新生児マウスに頭蓋内注射します。

  1. 送達のためにrAAV混合物を準備します。
    1. 異なるエンハンサーレポーターウイルス間の発現パターンを比較することを意図している場合は、最も濃度の低いウイルスに一致するようにすべてを希釈することによって、比較するすべてのウイルスの力価を等しくします。
    2. エンハンサーレポーターウイルスと構成的に発現したコントロールレポーターウイルスの比率を2:1または3:1で混合し、少量(最終濃度0.06%)のFast Green色素を加えます。
      注:ファストグリーンは、AAVを含む実験動物の注射に広く使用されている染料であり、手順45、46、47、48の最中および直後に注射部位を視覚化します。これは重要な品質保証ステップですが、色素の添加が形質導入を妨げる可能性があります。注射用色素の使用を再考することは、場合によってはプロトコルの最適化に重要な場合があります。構成的に駆動される制御ウイルスは、独立した注射を比較するために絶対に重要です。ウイルス注射は、動物ごとに形質導入の場所と程度が異なります。構成的コントロールは、失敗した注射を分析から除外することを可能にし、ウイルス送達の変動の正規化のための標準を提供します。
    3. μL目盛り付きキャピラリーチューブから作られた滅菌プルガラスピペットの先端を、70%エタノールに浸して滅菌し、完全に乾燥させた繊細なワイプにそっと突き刺して壊します。次に、引っ張られたガラスピペットを、マイクロキャピラリーピペットを保持するためのゴム製ガスケットで終わる15インチの長さのゴムチューブに接続された圧力を加えるための装置からなるアスピレーターアセンブリに挿入します。
      注:「圧力を加えるための装置」は、注射器またはマウスピースであり得る。注射器を使用する場合、実験者が片手でピペットを操作し、もう一方の手で動物を操作する間、2人目の人が注射器を通して圧力を加える必要があります。マウスピースを使用する場合、実験者が動物とピペットの両方の位置とシリンジに加えられる圧力を細かく制御できるようにするには、ウイルス汚染を避けるために特別な注意が必要です。
    4. アスピレーターアセンブリを通して負圧を加え、少量(~0.2-0.5 μL)の鉱物油をガラスピペットに引き込みます。
      注:このステップは、エアロゾル化されたウイルス粒子がアスピレーターアセンブリを汚染するのを防ぐためのバリアを提供するために非常に重要です。
    5. 準備したアスピレーターアセンブリを脇に置き、注入する準備ができるまでウイルスを氷の上に置いておきます。
  2. ペダル離脱反射が止まるまで(~5分)氷に部分的に沈めた乾燥したプラスチック皿に新生児マウスを凍結麻酔します。マウスが氷に直接接触していないことを確認してください。
  3. アスピレーターアセンブリを通して負圧を使用して、メニスカスが2μLの目盛りを通過するまで、ウイルス混合物をプルドガラスピペットに引き込みます。
  4. コールドチャンバーからマウスを取り外し、ベンチトップに置きます。ラムダとブレグマの中間、矢状縫合糸と各眼の中間に両側注射部位を配置します。アルコールワイプで両方の領域を消毒します。
  5. プルドグラスピペットを使用して新生児マウスの頭蓋骨を突き刺し、針が脳に入るとアスピレーターアセンブリを通して陽圧を静かに加えます。ウイルス混合物の半月板を見てください。加えられた圧力に対する抵抗は、ピペットの先端が側脳室に到達すると減少します。1 μLのウイルスを分注し、ピペットを引き出し、もう一方の側脳室についても繰り返します。
  6. マウスを加熱パッドまたは加温室に置いて回復します。目を覚まして活動したら、動物をホームケージに戻します。

4.組織を採取し、免疫組織化学を行います。

  1. ウイルス形質導入後十分な時間経過した後、マウスを麻酔し、経心灌流により屠殺する。
    注:ここに示されている代表的な結果を含む多くの実験では、ウイルスが形質転換されるまでに4週間以上の期間がかかります。しかし、自己補完性AAVは早くも7日目に強い発現を示す可能性があります12。望ましい潜伏期間は、特定の実験技術と目標に応じて最適化する必要があるかもしれません。
    1. 静脈内注入チューブと25 Gの針を備えた蠕動ポンプを準備します。
    2. 1x PBSと4%パラホルムアルデヒド(PFA)を準備し、氷上に置きます。
    3. チューブの吸気端を氷のように冷たい1x PBSに配置します。流量(P7マウスの場合は2.5 mL /分、P28マウスの場合は3.5 mL / min)を設定し、バッファーがチューブを完全に引き込まれ、気泡がなくなるまでポンプを運転します。灌流の準備ができるまで針を脇に置きます。
    4. ヒュームフード内で、ドロップジャーチャンバーの底にあるペーパータオルに少量のイソフルランをピペットで貼り付けます。以前に注射したマウスをペーパータオルの上の火格子に置き、イソフルランと直接接触しないようにします。チャンバーを密閉してマウスを麻酔します。~5分待ってからチャンバーを開き、ペダル離脱反射を確認します。動物が意識を失ったら進めてください。
      注:灌流中は、意識の回復を防ぐために、マウスをノーズコーン付きのイソフルランに維持する必要があります。.
    5. 外科用ハサミを使用してマウスの腹部と胸部を開き、胸郭を取り外して心臓を露出させます。
    6. 虹彩マイクロハサミを使用してマウスの右心房を小さく切開し、IV針を左心室に挿入し、蠕動ポンプを作動させます。
    7. 右心房の切開部から洗い流される血液が透明になるまで、氷のように冷たい1x PBSで動物を灌流します。赤血球は自家蛍光を持ち、血管はレポーター発現細胞を画像化する能力を損なう可能性があるため、血液の組織をきれいにすることは非常に重要です。
    8. 蠕動ポンプを一時停止し、吸気チューブをPBSから4%PFAに移動します。ポンプを再活性化し、体重1 mL/g、成体マウスの場合は~25 mLを灌流します。
      注意: 固視振戦は観察可能であり、マウスの体は硬くなるはずです。
  2. 脳を解剖して後置します。
    1. 外科用ハサミでマウスの頭を取り除きます。
    2. 小さな手術用ハサミを使用して、頭蓋骨の付け根から始めて、頭の正中線に沿って切開し、皮膚とその下にある組織を引き戻して頭蓋骨を露出させます。
    3. 虹彩はさみを使用して、頭蓋骨の後ろを慎重に切り、大孔から始まり、嗅球が通過するまで矢状縫合糸に向かって、そして矢状縫合糸に沿って続けます。
    4. はさみを嗅球の上の頭蓋骨に挿入し、頭蓋骨に2つの水平方向の切り込みを入れます。後頭骨に同様の水平方向の切り込みを入れます。水平方向と正中線のカットは、頭蓋骨の上部にドアのようなフラップのペアを作成します。
    5. 頭蓋骨のフラップをはがして、脳を完全に露出させます。ピンセットを使用して頭蓋骨から嗅球を切断し、脳神経を切断して、脳を頭蓋骨から解放します。
    6. PBS中の4%PFAを3〜5mL入れた15mLのコニカルチューブに脳を落とします。ポストフィックス6時間から一晩。組織を固定しすぎないでください。
  3. 凍結切片のために脳を準備します。
    1. 固定された脳を、脱水のためにPBS中の12〜14mLの30%スクロースを含む新しい15mLコニカルチューブに移します。脳がチューブの底に沈むまで4°Cでインキュベートします(2〜3日)。
    2. 固定および脱水した脳を、15 mm x 15 mm x 5 mmのクライオモールド内の最適切断温度(OCT)コンパウンドに浸します。脳が完全に覆われるまでOCTを追加します。
    3. クライオモールドをドライアイスのブロックの上に置き、OCTの固体ブロックでサンプルを凍結します(~5分)。
      注:OCTブロックは、-80°Cで数か月から数年保存できます。
    4. クライオモルドにサンプル名と脳の向きをラベル付けします。
  4. クライオスタットミクロトームを使用して冠状切片を取得します。
    1. OCTブロックの脳の向きを鉛筆でマークし、クライオスタット内のクライオモルドからブロックを取り外します。
    2. 脳が嗅球をクライオスタットの刃に向けるようにOCTブロックを配置し、新しいOCTを使用してブロックをクライオスタットのオブジェクトホルダーに接着します。
    3. 所定の位置に凍結したら、手順4.4.4〜4.4.6に従って、ブロックを通して50μmのセクションの切断を開始します。
    4. アンチロールプレートは使用しないでください。セクションは、切断されるとタイトなロールにカールし、ブロックの上に集まるか、収集トレイの下に落ちます。
    5. 作成された最初のいくつかのカットでブロックの形状を観察します。ブロックを垂直にカットし、カットを開始するときに均一な面を生成します。必要に応じて、サンプル調整アームを使用して角度を調整します。
    6. 嗅球が見えるときは、切片の形状に細心の注意を払ってください。一方が他方よりも大きく見える場合、カットは脳に対して角度があり、サンプル調整アームを使用してブレードに対する脳の向きをまっすぐにする必要があります。
      注:まっすぐに切ると、皮質が各嗅球の上に同時に現れ始めるはずです。
    7. 嗅球が切片化され、吻側の脳組織が見えるようになったら、切断厚さを30〜35μmに減らし、浮遊切片の収集を開始します。手順4.4.8〜4.4.13に従って、脳を切片化します。
    8. ブロックとオブジェクトホルダーの前のすべてのセクションを払いのけて、収集トレイに落ちるようにします。トレイの片側にブラシをかけ、別々に保ちます。パイルが大きすぎる場合は、トレイを空にします。
    9. 1 mLのPBSを24ウェルプレートの各ウェルに分注します。脳ごとに 1 行のラベルを付けます。
    10. 6つの冠状切片をカットします。冷たいピンセットを使用して切片を取り出し、クライオスタットステージに配置します。この手順を2〜3回繰り返し、6つのセクションのグループを分離したままにします。
    11. サイズ000の絵筆をPBSで濡らし、糸くずの出ないティッシュまたはペーパータオルで余分な液体を軽くたたきます。絵筆を使用して、各セクションを一度に1つずつそっと持ち上げ、24ウェルプレートの適切なウェルに置きます。
    12. スライスのグループの6つのセクションの1つを、24ウェルプレートの列の6つのウェルのそれぞれに配置します。これにより、各ウェルに脳の切片領域にまたがる代表的な切片が含まれることが保証されます。
    13. 大脳皮質の尾端が切片化されるまで、6人のグループで切片化を続けます。
    14. 保存するには、24ウェルプレートをパラフィルムで密封し、4°Cで保存します。
      注:切片は4°Cで1〜2か月間安定しています。 0.1%アジ化ナトリウムを含むPBS溶液を使用して、細菌の増殖を抑制し、切片の貯蔵寿命を延ばすことができます。ただし、切片を2か月以上保管する場合は、最良の結果を得るために、凍結保護剤溶液に入れ、-20°Cで凍結する必要があります。
  5. レポーター遺伝子シグナル増幅のための免疫組織化学を行います。
    注:抗原賦活化を除くすべてのステップは、オービタルシェーカーで穏やかから中程度の攪拌(~100 RPM)を使用して実行する必要があります。コントロールレポーター(mRuby3)のネイティブ蛍光を維持するには、すべてのステップを可能な限り光から保護する必要があります。
    1. 表 3 の説明に従って、必要なバッファーを準備します。
    2. 染色される脳ごとに1列の新しい24ウェルプレートを準備します。ウェルの最初の列で、各ウェルに1 mLのPBSを追加します。
    3. サイズ000のペイントブラシを使用して、元のコレクションウェルから新しい24ウェルプレートの新しいPBSに1ウェルのセクションをそっと移し、すばやくすすぎ、残留OCT化合物を除去します。
    4. 1 mLのARBを24ウェルプレートの次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。60°Cのオーブンで1時間インキュベートします。
    5. プレートを室温(RT)で20分間冷却します。
    6. 1 mLのPBを次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。RTで20分間インキュベートします。
    7. 500 μLのBBを次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。RTで1時間インキュベートします。
    8. 2 mLのWBをBBに加え、~2 mLの溶液をピペットで取り出して廃棄し、希釈したBB溶液をウェルに残します。セクションがはっきりと見えるまで繰り返します。
    9. 一次抗体(チキンIgY抗GFP、1:1000)をBBで希釈します。350〜500 μLの一次抗体溶液を次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。プレートをパラフィルムで密封し、4°Cで一晩インキュベートします。
    10. セクションがはっきりと見えるまで、前に行ったようにWBでBBを希釈します。
    11. 1 mLのWBを次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。RTで20分間インキュベートします。
    12. ~800-900 μLのバッファーを除去し、廃棄します。1 mLの新鮮なWBを加え、20分間インキュベートします。1 mLのWBをさらに4回交換して、合計5回の洗浄をそれぞれ20分行います。
    13. 二次抗体(ロバ抗チキンAlexa Fluor 488結合、1:500)をBBで希釈します。350〜500 μLの二次抗体溶液を新しいウェルに追加します。RTで45分から1時間インキュベートします。
      注:これは7番目のウェルであるため、2つ以上の脳からの切片を染色する場合は、この時点で新しいプレートが必要になります。
    14. 以前と同様にBBをWBで希釈し、1 mLのWBで満たされた新しいウェルに切片を移します。以前に行ったように切片を20分間3回洗浄します。
    15. PBS中のDAPIの作業溶液を調製します(最終濃度0.04-0.8 μg / mL)。溶液を光から保護します。
    16. 1 mL DAPI溶液を次のウェルに加え、切片をこのウェルに移します。RTで~5分間インキュベートします。
    17. 切片をWBに戻し、サイズ000の絵筆を使用して顕微鏡スライドにそっと取り付けます。スライドを風乾させます。
    18. 適切な封入剤でカバーガラスを貼ります。スライドを暗闇の中でRTで一晩硬化させます。

5.エンハンサー活性について脳組織切片を画像化して分析します。

  1. 低倍率(5倍)の対物レンズを使用して、脳切片にまたがる蛍光画像を記録します。
  2. 注射部位を特定し、赤色蛍光細胞の密度と強度に基づいてウイルス形質導入の程度を評価します。同様に形質転換された動物を比較するように注意してください。
  3. 必要に応じて、高倍率の対物レンズ(≥25倍)で詳細な蛍光画像を記録します。
    注:比較するサンプル間の励起光強度、フィルター、露光時間などの取得パラメータには常に同じ設定を使用してください。
  4. 画像解析ソフトで画像処理します。
    注:処理は、任意の画像解析ソフトウェアパッケージで実行できます。次の手順は、ImageJ のオープンソースの FIJI ディストリビューションを使用して、シーケンスがレポーター構築コンテキスト (はいまたはいいえの質問) でエンハンサーとして機能するかどうかを判断するための提案です。エンハンサー変異体間の活性度を比較する際には、より詳細な測光が適切であり得る。異なるサンプルからの画像は、比較するために常に一貫して処理する必要があります。
    1. ノイズを減らすためにフィルターを適用します。フィジーでは、[ プロセス>ノイズ ]メニューの[スペックル除去]オプションを選択します。
      注: これは 3 x 3 メディアン フィルタです。
    2. ステップ5.4.3〜5.4.6に従ってバックグラウンド蛍光を差し引きます。
    3. マルチチャンネル画像のチャンネルを分離します。フィジーでは、[画像>カラー]メニューで[チャンネルを分割]オプションを選択します。
    4. 長方形または円の選択ツールを使用して、蛍光セルのない画像の領域に小さな形状を描画し 、[分析>測定]を使用して背景の平均ピクセル強度を測定します。繰り返して、複数の領域をサンプリングします。
      注意: [測定値の分析]メニューで[平均グレー値]が選択されていることを確認してください>。
    5. 背景の5〜8領域から平均グレー値を平均し、小数点を落とします。[減算] を使用して、画像内の各ピクセルからこの値を減算 >>します。
      注: 最も近い整数に丸めると、減算する背景を過大評価する可能性があります。単に小数点を落とす方が保守的です。たとえば、6.4 は 6 に切り捨てられますが、各ピクセルから 0.5 単位の実信号を差し引くリスクを回避するために、6.5 も 6 に切り捨てる必要があります。
    6. 必要に応じて、チャンネルをマルチチャンネル画像にマージして戻します。フィジーでは、 画像>カラー>チャンネルの結合を使用します。
    7. 重なり合う画像をつなぎ合わせます。フィジーでは、プラグイン>ステッチング>グリッド/コレクションステッチを使用します。
    8. 明るさとコントラストを調整します。フィジーでは、 画像>を使用して>明るさ/コントラストを調整します。
      注: 比較する各画像には、常に同じ最小値と最大値を使用してください。
    9. 手順5.4.10〜5.4.12に従って緑色蛍光細胞の数を数えます。これらは、候補エンハンサー配列がレポーター発現を駆動することができた細胞です。
    10. 緑のチャンネルを非表示にすることから始め、フリーフォーム選択ツールを使用して、赤い蛍光を表現する脳の領域の周りに形状を描画します。フィジーの計測機能を使用して、このゾーンの赤チャンネルの面積、積分密度、平均グレー値を 計測 します。
    11. マルチポイント選択ツールを使用して、このゾーン内の緑色のセルの数を数えます。
    12. 緑のセルの数を赤チャンネルの積分密度で正規化します。局所的な赤チャンネルの明るさは、ウイルス曝露の大きさの代理尺度であり、異なる形質導入動物間のエンハンサー活性の比較を可能にします。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

これらの方法を用いて、遺伝子CACNA1C19、49、50の精神医学的リスク関連第3イントロンにおける915bp配列を、出生後マウス脳におけるエンハンサー活性について試験した。この配列は、精神医学的および神経学的リスクSNPs12を中心とした345の候補エンハンサー配列のMPRAで発見され、ここでは一般的な例として特性評価実験について説明します。C57BL/6マウスに、Hsp68最小プロモーターおよび単一の候補エンハンサー配列の制御下でEGFPを含む自己相補性ベクター51としてパッケージ化されたAAV9コンストラクトをP0に注射した(図3A)。追加のマウスに、調節活性を有さないと予測された陰性対照配列を含む構築物を注射した(図3B

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、出生後マウスの脳におけるエンハンサー駆動型導入遺伝子の展開のためのrAAVベースの方法を記載している。この一般化プロトコルでは、候補エンハンサー、最小プロモーター、レポーター遺伝子、および任意のバーコード配列がAAVプラスミド骨格にクローニングされます。これらの実験は、単一の候補エンハンサー配列を用いて、または多数の配列を並行して行うことができる。プラスミドはrAAVにパッケージ化され、生後マウスの脳に送達されます。ウイルスの形質導入を可能にする期間の後、脳が収集され、レポーター遺伝子発現のために画像化されます。構成的に発現したレポーターウイルス(CAG-mRuby3)が注射対照として含まれています。このアッセイを用いて、エンハンサーエレメントがマウス脳におけるEGFPの転写を促進することが示され、 in vivoでのエンハンサー活性が実証されます。

このアッセイのトラブルシューティングと最適化の主なターゲットには、ウイルス力価、注射技術、および形質導入時間枠が含まれます。異なるウイルス力価は、形質導入細胞の密度に強い影響を与える可能性があります...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、競合する金銭的利益を宣言していません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

シーケンシングは、UC Davis DNA Technologies Coreで実施されました。カリフォルニア大学デービス校のLin Tianの研究室には、rAAVパッケージングに関するトレーニングを提供し、AAVヘルパーとrep/capプラスミドを惜しみなく贈ってくれたことに感謝します。この作業はNIH/NIGMS R35GM119831の支援を受けた。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x クエン酸バッファーSigma-AldrichC9999-1000ML
5'-gatcactctcggcatggac-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A:形質転換後のクローンを検証するためのカスタム設計フォワードプライマー。これらのプライマーは、使用したベクターに特異的であり、私たちの実験で使用した特定のベクター用に設計されました。
5'-gatggctggcaactagaagg-3'IntegratedDNA TechnologiesN/A:形質転換後のクローンを検証するためのカスタム設計のリバースプライマー。これらのプライマーは、使用したベクターに特異的であり、私たちの実験で使用した特定のベクター用に設計されました。
アガローVWRVWRVN605-500G
アスピレーター チューブ アセンブリシグマ アルドリッチA5177-5EAの口駆動型送達用
サーモフィッシャーサイエンティフィック08-757-100D
カルベニシリンシグマアルドリッチC1389-5G
チキン IgY 抗 GFPサーモフィッシャーサイエンティフィックA10262
共焦点顕微鏡ツァイスLSM900画像はLSM800モデルで撮影されましたが、ツァイスは近年、LSM800に代わるLSM900モデルを発売しました。
円錐形遠心分離管 15 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック12-565-269
クライオモールドサーモフィッシャーサイエンティフィックNC9806558これらの型は、P28マウスの脳に適しています。他のサイズは、より大きな組織または小さな組織により適している場合があります。
DAPIシグマ-アルドリッチD9542-10MG
解剖はさみ、4.5インチVWR82027-578
バアンチチキンAlexaFlour-488クソン免疫研究703-545-155
ベッコのPBS 1xサーモフィッシャーサイエンティフィックMT21031CV
ッペンドルフ微量遠心チューブ2.0mLモフィッシャーサイエンティフィック
Falcon 丸底チューブ 14 mLサーモフィッシャーサイエンティフィック352059
ファストグリーン染料グレインジャーF0099-1G
ファインディテールペイントブラシセットアートブラシ タワーB014GWCLFO
ギブソン アセンブリ マスターミックスNEBE2611S
ガラス毛細管Drummond Scientific Company5-000-2005
HiSpeed プラスミド マキシ キットQIAGEN12663市販のプラスミド マキシ プレップ キット
HyClone HyPure 分子生物学グレード 水VWRSH30538.03
IV バタフライ インフュージョン セット 12" チューブと 25G ニードル付きサーモフィッシャーサイエンティフィック26708
KimwipesKimberly Clark34155リントフリーワイ
LB 寒天サーモフィッシャーサイエンティフィックBP1425-500LB寒天培地用プレミックス
マクファーソン・バンナス・アイリス・シザーインテグラ・ライフサイエンス360-215
鉱物油シグマ・ライフサイエンス69794-500ML
NEB 安定 コンピテント大腸菌NEBC3040I
NucleoSpin ゲルとPCRクリーンアップタカラ740609.5酵素反応用キットクリーンアップとゲル抽出
OCT培地VWR25608-930
オービタルシェーカーコールパーマー60-100
パラホルムアルデヒドSigma-Aldrich158127-500G
PCRストリップチューブ 0.2mLVWR490003-692
蠕動ポンプギルソンF155005
リン酸緩衝生理食塩水(PBS) 10xサーモフィッシャーサイエンティフィ70011044
Phusion ホットスタート II ハイフィデリティ DNA ポリメラーゼサーモフィッシャーサイエンティフィックF549L
粉ミルクサニーセレクト
プロロング ゴールド 退色防止封入剤サーモフィッシャーサイエンティフィックP36934
QIAquick PCR 精製キットQIAGEN28106
rCutSmartバッファーNEBB6004SPacI、AscI、XmaIによる制限酵素消化用バッファー
制限酵素:AscINEBR0558L
制限酵素:PacINEBR0547L
制限酵素:XmaINEBR0180L
SOC伸長培地NEBB0920S形質転換後の回復培地
ショ糖(RNase/DNase free)Millipore Sigma033522.5KG
TAEバッファーApex20-194
トランスファーチューブギルソンF1179941蠕動ポンプ用
Triton X100Sigma-AldrichX100-100ML
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemThermo Fisher ScientificA1460Plasmid mini prep kit
ス rAAV 細菌学ペトリ皿ロジャダルエサー22431048プ ック

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