走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化

マクロピノサイトーシスは、メンブレンフリル¹と呼ばれる動的でアクチン駆動の原形質膜突起の形成を介して、大量の細胞外液およびその内容物を内在化する内分泌過程である。これらの膜フリルの多くは、細胞を閉じて融合させ、マクロピノソーム1としても知られる大きくて不均一な細胞内エンドソームとして原形質膜から分離するカップ^{を形成する。}マクロピノサイトーシスは、広範囲の細胞型においてマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および上皮成長因子(EGF)などの成長因子によって誘導されるが、構成的マクロピノサイトーシスとして知られるさらなる独特のカルシウム依存性プロセスは、自然免疫細胞²、³、⁴、^5、6、^7、8においても観察されている。

マクロピノサイトーシスを介して細胞外物質をインターナライズする細胞の能力は、栄養素の取り込みから病原体の捕捉および抗原提示に至るまでの様々な生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている⁹、^10、11。しかしながら、このプロセスは非選択的かつ誘導性であるため、多くの病理学的状態にも関与している。実際、以前の研究では、マクロピノサイトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、癌、腎結石症およびアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことが示唆された^{12,13,14,15,16}。さらに、特定の細菌およびウイルスは、マクロピノサイトーシスを利用して宿主細胞に侵入し、感染を誘導することが示されている^17,18。興味深いことに、マクロピノサイトーシスの刺激は、様々な疾患状態における治療剤の標的送達のためにも利用され得る^19、20。

これまでの研究では、フローサイトメトリーおよび共焦点イメージング21,22を用いて、マクロピノサイトーシスを阻害する薬理学的薬剤の非存在下および存在下で、内在化された蛍光タグ付き液相マーカーを定量化することによってマクロピノサイトーシスを探索してきた^21,22。マクロピノサイトーシスを阻害する現在利用可能な薬理学的ツールは、1)アクチン重合阻害剤(サイトカラシンDおよびラトルンクリン)、2)PI3K遮断薬(LY-290042およびワートマニン)、および3)ナトリウム水素交換剤(NHE)の阻害剤(アミロリドおよびEIPA)^{に限定され}、5、^14、15、23、^24、25.しかしながら、これらの阻害剤はエンドサイトーシスに依存しない効果を有するため、特にインビボでの溶質取り込みおよび疾患病因に対するマクロピノサイトーシスの寄与を選択的に決定することは困難である²¹。

走査型電子顕微鏡(SEM)は、電子²⁶の集束ビームを用いて細胞の超高分解能画像を生成する電子顕微鏡の一種である。マクロピノサイトーシス研究において、SEMイメージングは、原形質膜の地形学的および形態学的特徴を視覚化し、膜フリル形成を定量化し、マクロピノソーム内在化への進行を調べるためのゴールドスタンダード技術と見なされています。さらに、溶質取り込みの定量化と組み合わせた走査型電子顕微鏡は、マクロピノサイトーシス遮断薬の存在下および非存在下で、イン ビトロでマクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションを調べるための信頼できる戦略を提供する。この論文は、SEM用の細胞を調製し、細胞表面を視覚化し、フリル形成を定量化し、カップ閉鎖およびマクロピノソーム内在化へのそれらの進歩を調べる方法に関する詳細なプロトコルを提供する。

注:以下は、SEM顕微鏡を用いてRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を定量するために使用される一般的なプロトコルである。異なる細胞タイプに対して最適化が必要な場合があります。

1. 細胞株および細胞培養

1. 37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100IU/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でRAW 264.7マクロファージを増殖させる。成長メディアは 1 日おきに交換します。
2. 細胞が80%コンフルエントになったら、滅菌PBSを使用してプレートを2回洗浄する。
3. 0.5%トリプシン-EDTAを1,000 μL加えて細胞を剥離し、細胞培養プレートを37°Cの加湿インキュベーター内で3〜5分間インキュベートする。
4. プレートを光学顕微鏡で調べ、細胞解離を確認した。10%FBSを含む10mLの成長培地を加えてトリプシンを不活性化する。
5. 細胞懸濁液を50mL円錐管に集め、400 x g で室温で5分間遠心分離する。完全な細胞培養培地中に細胞を穏やかに再懸濁し、トリパンブルー(0.4%)染色を用いて細胞数および生存率を決定する。
   注:この実験に推奨される最小細胞生存率は>90%です。
6. 滅菌ガラスカバースリップをオートクレーブ処理された鉗子を使用して24ウェルプレートのウェルに入れます。1 x¹⁰⁶ cells/mLの密度でカバースリップ上に細胞をシードし、プレートを37°Cおよび5%_CO2の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。
7. 処理前に、各ウェルの培地を新鮮な500μLの完全培地で交換してください。マクロファージをビヒクル(DMSOまたはEIPAを溶解するために使用される他の溶媒)またはマクロピノサイトーシス阻害剤5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロリド(EIPA、25μM²¹)で30分間前処理する。
8. 膜フリルを促進するためにマクロピノサイトーシスのビヒクルおよび刺激剤で細胞を治療する:ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA、1μM、30分²¹)およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、100ng/mL、30分³)。
   注:マクロピノサイトーシスの代替阻害剤[例えば、ラトルンクリンA(1μM、30分)またはサイトカラシンD(1μM、30分)]および刺激剤[例えば、上皮増殖因子(EGF、100ng/mL、10分)または血小板由来成長因子(PDGF、100ng/mL、15分)]もまた、マクロファージおよび他の細胞型におけるマクロピノサイトーシスを特徴付けるために使用され得る16,27、^{16、27、28,29}。細胞は、マクロピノサイトーシスの生理学的刺激剤による治療の前に一晩血清飢餓を必要とすることがある。他の細胞型におけるマクロピノサイトーシスを刺激するために、最も効果的な濃度およびインキュベーション時間を決定しなければならないことに注意することが重要です。

2. SEM固定

1. 処理後、ウェルから培地を吸引し、カバースリップを氷冷PBSで2回洗浄する。
2. 細胞(0.1 Mカコジル酸ナトリウム中の4%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒド)を室温で30分間固定し、続いて固定液中で4°Cで一晩インキュベートした。
3. カバースリップを500 μLの以下の試薬で穏やかに洗浄し、細胞単分子膜を乱すことなくインキュベートします。
   1. 0.1 Mカコジル酸ナトリウムで1回洗浄し、15分間インキュベートする。
   2. 各洗浄液に10分間インキュベーションしながら_dH2Oで2回洗浄する。
   3. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら25%エタノールで2回洗浄する。
   4. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら50%エタノールで2回洗浄する。
   5. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら75%エタノールで2回洗浄する。
   6. 各洗浄液に10分間インキュベーションしながら80%エタノールで2回洗浄する。
   7. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら95%エタノールで2回洗浄する。
   8. 100%エタノールで2回洗う。各洗浄で10分間のインキュベーションを行う。
      注:試薬の変更/交換は、細胞の空気乾燥を防ぐために迅速に行う必要があります。カバースリップは、100%エタノール中に4°Cで数日間放置することができる。 長期保存のために、さらに100%エタノールを加え、サンプルの空気乾燥を防ぐためにパラフィルムで井戸を覆います。

3. 臨界点乾燥

1. カバースリップをクリティカルポイントドライヤーに入れ、100%エタノールで覆います。 電源 ボタンを押して、_CO2 タンクを開きます。
2. 温度が0°Cに下がるまで 、クール ボタンを約30秒間押し続けます。 チャンバーウィンドウにバブルが表示されるまで、塗りつぶしボタンを押します。
3. パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまで パージ ボタンを押します。温度が0°Cに下がるまで 、もう一度クール ボタンを押します。
4. [塗りつぶし] ボタンと [パージ] ボタンを押して電源を切り、CO₂ タンクを閉じます。[クール]ボタンを押下して電源を切り、[ヒート]ボタンを押します。
5. 温度を 42 °C、圧力を 1,200 psi に設定します。圧力と温度が安定したら、 ブリード ボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。
6. チャンバーの圧力が 150 psi に達したら、 ベント ボタンを押し、圧力が 0 psi に低下するまで待ちます。臨界点乾燥機の電源を切り、カバースリップを取り外します。
7. カーボン接着剤タブを使用してSEMアルミニウム試料マウントにカバースリップをマウントし、スパッタコーターで金/パラジウムを使用してスパッタコーティングを行います。
8. 電源ボタンをオンにし、真空が30mTorrに達するまで待ちます。チャンバーをフラッシュし、ガススイッチをオフにし、ファインガスバルブを反時計回りに回して、湿度と空気を除去します。
9. 真空が200mTorrに上昇したら、ガススイッチをオフにし、真空が30mTorrに達するまで待ちます。この手順を 3 回繰り返します。
10. タイマーボタンを押し、ゲージが10mAを読み取るまで電圧ノブを調整します。コーティングされたカバースリップをチャンバーから取り外します。
    メモ:メーカーの指示に従って、サンプルの臨界点乾燥とスパッタコーティングを行います。

4. イメージングと定量化

1. サンプルカバースリップを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入します。ドアを閉じ、 Evac ボタンを押します。
2. SEM 操作ソフトウェアを開きます。加速電圧を15 kv、作動距離を10 mmに設定します。
3. [座標] ボタンを押し、セルが観測画面の中央に表示されるまでコントローラーの周りを移動します。倍率を 3,500 倍に設定し、[写真] ボタンをクリックしてサンプルを画像化します。
   注:原形質膜をより詳細に表示するには、より高いレベルの倍率(8,500倍から16,000倍)を使用してください。
4. カバースリップ上の少なくとも10のランダムな場所から画像を撮影し、各顕微鏡フィールドに複数の細胞が含まれていることを確認します。画像を.tifファイルとして保存します。
5. 画像から、原形質膜の突出した毛布状のひだとして定義される、500nmを超えるサイズの膜フリルを見つけます(図1)。セルあたりのフリルの数を数えます。
   注:C字型のフリルは、その側端に融合しなかった湾曲した膜突起として同定された[(図1 (M-CSF処理)および 図2B]。融合した円形膜フリルは、それらの閉鎖の前に、マクロピノサイトーシスカップとして同定された(図2C)。
6. 膜フリルの数を、評価された顕微鏡視野内の細胞の総数に正規化する。各グループのサンプルについてこの分析を繰り返します。

ここで、提示された手法の結果について説明する。図1に示す代表的なSEM画像は、PMAおよびM-CSFによる処理後のRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する。画像は、最初に定量化目的で3,500倍の倍率で撮影され、次に原形質膜をより詳細に表示するためにより高いレベルの倍率(8,500倍〜16,000倍)で撮影された。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロファージの前処理は、膜ラッフル形成を弱毒化した(図1)。マクロピノサイトーシス関連原形質膜活動は、5つの連続したステップに分けることができる:1)膜フリルの開始、2)円形化、3)カップ形成、4)カップ閉鎖、および5)マクロピノソーム形成を介した細胞外液およびそれに関連する溶質の内在化。図2は、M-CSF刺激後のこれらの形態学的に異なる原形質膜活動の代表的な画像を示す。大型シート状のフリル(図2A)、円形のC字型フリル(図2B)、および大ピノシスコップ(図2C)を、倍率6,000倍〜7,000倍で捕捉した。走査型電子顕微鏡は、細胞表面の高解像度画像を提供するために使用することができるが、内部化されたマクロピノソームを視覚化するために利用することはできない。PMAおよびM−CSF処理後の膜ラッフルの定量を図3に示す。マクロピノソーム形成は、図4に示すように共焦点顕微鏡法を含む代替画像化技術によって確認することができる。最後に、膜フリルのSEM定量は、マクロピノサイトーシスの刺激を確認するために、蛍光流体相マーカー(例えば、FITCまたはテキサスレッドデキストラン)のフローサイトメトリー定量によって補完されるべきである(図5)。

図1:RAW 264.7マクロファージの走査型電子顕微鏡像。 RAW 264.7マクロファージをビヒクル(DMSOコントロール)またはEIPA(25μM)で30分間前処理し、PMA(1μM、30分)またはM-CSF(100ng/mL、30分)でインキュベートして膜フリルを刺激した。右側の画像は、細胞表面のより高い倍率を示しています。赤い矢印:膜フリル。緑色の矢印:c字型のフリル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:走査型電子顕微鏡により捕捉されたマクロピノサイトーシスの形態学的段階。RAW 264.7マクロファージをM-CSF(100ng/mL)で30分間処理し、細胞をSEMイメージング用に処理した。(A)シート状の膜突起、(B)C字状の膜フリル、及び(C)大ピノシスコップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:膜フリル形成の定量化。 RAW 264.7マクロファージをビヒクル(DMSOコントロール)またはEIPA(25μM)で30分間前処理し、PMA(1μM、30分)またはM-CSF(100ng/mL、30分)でインキュベートして膜フリルを刺激した。棒グラフは、全細胞数(n =3)に正規化された膜フリルの数を示す。データはSEM±平均を表す。*p <0.05対ビヒクル、 #p <0.05対PMAまたはM-CSF治療。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:マクロピノソーム形成 細胞をPMAで30分間前処理し、テキサスレッドデキストラン(25μg/mL、赤色)およびFM4-64(5μg/mL、緑色)と共に10分間インキュベートした。イメージングは共焦点顕微鏡を用いて行った。青色矢印:膜フリル、黄色矢印:テキサスレッドデキストランを含むマクロピノソーム、緑色矢印:マクロピノソーム。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:マクロピノサイトーシスの定量。RAW 264.7マクロファージをビヒクル(DMSOコントロール)またはEIPA(25μM)で30分間前処理し、PMA(1μM)およびFITCデキストラン(100μg/mL;70,000MW)と共に2時間インキュベートした。棒グラフは、ビヒクル処理(n=3、3連で実施)に正規化した平均蛍光強度(MFI)倍変化を示す。データはSEM±平均を表す。*p < 0.05 対車両、#p < 0.05 対 PMA です。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは利益相反がないと宣言しています。