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方法論記事

走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化

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DOI:

10.3791/62658

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2021年5月27日

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

この記事について

サマリー

マクロピノサイトーシスは、膜フリルとしても知られるF-アクチンに富むシート状の膜突起の形成によって開始される高度に保存された内球性プロセスである。マクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションの速度の増加は、様々な病理学的状態に関与している。このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いて インビトロで 膜ラッフル形成を定量する方法を提示する。

要約

メンブレンフリルは、新しく重合されたアクチンフィラメントのメッシュワークを含む運動性原形質膜凸部の形成である。膜フリルは、自発的に、または成長因子、炎症性サイトカイン、およびホルボールエステルに応答して形成され得る。膜突起の一部は、遠位縁で融合し、マクロピノソームと呼ばれる大きくて不均一な液胞として細胞質に閉じて分離するカップを形成する円形の膜フリルに再編成することができる。このプロセスの間、フリルはマクロピノソーム内に内在化する細胞外液および溶質を捕捉する。高分解能走査型電子顕微鏡(SEM)は、細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および閉じた大尖頭カップを視覚化および定量化するために一般的に使用されるイメージング技術です。以下のプロトコールは、細胞培養条件、 インビトロでの 膜ラッフル形成の刺激、およびSEMを用いたイメージングのための細胞の固定、脱水、および調製方法を記載する。この方法は、生理学的および病理学的プロセスにおけるマクロピノサイトーシスの役割に関する重要な質問に答え、膜フリル形成を調節する新しい標的を調査し、まだ特徴付けられていない生理学的刺激因子およびマクロピノサイトーシスの新規薬理学的阻害剤を同定するのに役立つ。

概要

マクロピノサイトーシスは、メンブレンフリル1と呼ばれる動的でアクチン駆動の原形質膜突起の形成を介して、大量の細胞外液およびその内容物を内在化する内分泌過程である。これらの膜フリルの多くは、細胞を閉じて融合させ、マクロピノソーム1としても知られる大きくて不均一な細胞内エンドソームとして原形質膜から分離するカップを形成する。マクロピノサイトーシスは、広範囲の細胞型においてマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および上皮成長因子(EGF)などの成長因子によって誘導されるが、構成的マクロピノサイトーシスとして知られるさらなる独特のカルシウム依存性プロセスは、自然免疫細胞2、3、4、5、6、7、8においても観察されている。

マクロピノサイトーシスを介して細胞外物質をインターナライズする細胞の能力は、栄養素の取り込みから病原体の捕捉および抗原提示に至るまでの様々な生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たすことが示されている9、10、11。しかしながら、このプロセスは非選択的かつ誘導性であるため、多くの病理学的状態にも関与している。実際、以前の研究では、マクロピノサイトーシスがアルツハイマー病、パーキンソン病、癌、腎結石症およびアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことが示唆された12,13,14,15,16。さらに、特定の細菌およびウイルスは、マクロピノサイトーシスを利用して宿主細胞に侵入し、感染を誘導することが示されている17,18。興味深いことに、マクロピノサイトーシスの刺激は、様々な疾患状態における治療剤の標的送達のためにも利用され得る19、20。

これまでの研究では、フローサイトメトリーおよび共焦点イメージング21,22を用いて、マクロピノサイトーシスを阻害する薬理学的薬剤の非存在下および存在下で、内在化された蛍光タグ付き液相マーカーを定量化することによってマクロピノサイトーシスを探索してきた21,22。マクロピノサイトーシスを阻害する現在利用可能な薬理学的ツールは、1)アクチン重合阻害剤(サイトカラシンDおよびラトルンクリン)、2)PI3K遮断薬(LY-290042およびワートマニン)、および3)ナトリウム水素交換剤(NHE)の阻害剤(アミロリドおよびEIPA)に限定され、5、14、15、23、24、25.しかしながら、これらの阻害剤はエンドサイトーシスに依存しない効果を有するため、特にインビボでの溶質取り込みおよび疾患病因に対するマクロピノサイトーシスの寄与を選択的に決定することは困難である21。

走査型電子顕微鏡(SEM)は、電子26の集束ビームを用いて細胞の超高分解能画像を生成する電子顕微鏡の一種である。マクロピノサイトーシス研究において、SEMイメージングは、原形質膜の地形学的および形態学的特徴を視覚化し、膜フリル形成を定量化し、マクロピノソーム内在化への進行を調べるためのゴールドスタンダード技術と見なされています。さらに、溶質取り込みの定量化と組み合わせた走査型電子顕微鏡は、マクロピノサイトーシス遮断薬の存在下および非存在下で、イン ビトロでマクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションを調べるための信頼できる戦略を提供する。この論文は、SEM用の細胞を調製し、細胞表面を視覚化し、フリル形成を定量化し、カップ閉鎖およびマクロピノソーム内在化へのそれらの進歩を調べる方法に関する詳細なプロトコルを提供する。

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プロトコル

注:以下は、SEM顕微鏡を用いてRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を定量するために使用される一般的なプロトコルである。異なる細胞タイプに対して最適化が必要な場合があります。

1. 細胞株および細胞培養

  1. 37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100IU/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でRAW 264.7マクロファージを増殖させる。成長メディアは 1 日おきに交換します。
  2. 細胞が80%コンフルエントになったら、滅菌PBSを使用してプレートを2回洗浄する。
  3. 0.5%トリプシン-EDTAを1,000 μL加えて細胞を剥離し、細胞培養プレートを37°Cの加湿インキュベーター内で3〜5分間インキュベートする。
  4. プレートを光学顕微鏡で調べ、細胞解離を確認した。10%FBSを含む10mLの成長培地を加えてトリプシンを不活性化する。
  5. 細胞懸濁液を50mL円錐管に集め、400 x g で室温で5分間遠心分離する。完全な細胞培養培地中に細胞を穏やかに再懸濁し、トリパンブルー(0.4%)染色を用いて細胞数および生存率を決定する。
    注:この実験に推奨される最小細胞生存率は>90%です。
  6. 滅菌ガラスカバースリップをオートクレーブ処理された鉗子を使用して24ウェルプレートのウェルに入れます。1 x106 cells/mLの密度でカバースリップ上に細胞をシードし、プレートを37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。
  7. 処理前に、各ウェルの培地を新鮮な500μLの完全培地で交換してください。マクロファージをビヒクル(DMSOまたはEIPAを溶解するために使用される他の溶媒)またはマクロピノサイトーシス阻害剤5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロリド(EIPA、25μM21)で30分間前処理する。
  8. 膜フリルを促進するためにマクロピノサイトーシスのビヒクルおよび刺激剤で細胞を治療する:ホルボール12-ミリスチン酸13-アセテート(PMA、1μM、30分21)およびマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF、100ng/mL、30分3)。
    注:マクロピノサイトーシスの代替阻害剤[例えば、ラトルンクリンA(1μM、30分)またはサイトカラシンD(1μM、30分)]および刺激剤[例えば、上皮増殖因子(EGF、100ng/mL、10分)または血小板由来成長因子(PDGF、100ng/mL、15分)]もまた、マクロファージおよび他の細胞型におけるマクロピノサイトーシスを特徴付けるために使用され得る16,27、16、27、28,29。細胞は、マクロピノサイトーシスの生理学的刺激剤による治療の前に一晩血清飢餓を必要とすることがある。他の細胞型におけるマクロピノサイトーシスを刺激するために、最も効果的な濃度およびインキュベーション時間を決定しなければならないことに注意することが重要です。

2. SEM固定

  1. 処理後、ウェルから培地を吸引し、カバースリップを氷冷PBSで2回洗浄する。
  2. 細胞(0.1 Mカコジル酸ナトリウム中の4%パラホルムアルデヒドおよび2%グルタルアルデヒド)を室温で30分間固定し、続いて固定液中で4°Cで一晩インキュベートした。
  3. カバースリップを500 μLの以下の試薬で穏やかに洗浄し、細胞単分子膜を乱すことなくインキュベートします。
    1. 0.1 Mカコジル酸ナトリウムで1回洗浄し、15分間インキュベートする。
    2. 各洗浄液に10分間インキュベーションしながらdH2Oで2回洗浄する。
    3. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら25%エタノールで2回洗浄する。
    4. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら50%エタノールで2回洗浄する。
    5. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら75%エタノールで2回洗浄する。
    6. 各洗浄液に10分間インキュベーションしながら80%エタノールで2回洗浄する。
    7. 各洗浄で10分間インキュベーションしながら95%エタノールで2回洗浄する。
    8. 100%エタノールで2回洗う。各洗浄で10分間のインキュベーションを行う。
      注:試薬の変更/交換は、細胞の空気乾燥を防ぐために迅速に行う必要があります。カバースリップは、100%エタノール中に4°Cで数日間放置することができる。 長期保存のために、さらに100%エタノールを加え、サンプルの空気乾燥を防ぐためにパラフィルムで井戸を覆います。

3. 臨界点乾燥

  1. カバースリップをクリティカルポイントドライヤーに入れ、100%エタノールで覆います。 電源 ボタンを押して、CO2 タンクを開きます。
  2. 温度が0°Cに下がるまで 、クール ボタンを約30秒間押し続けます。 チャンバーウィンドウにバブルが表示されるまで、塗りつぶしボタンを押します。
  3. パージ排気からのエタノールの臭いが消えるまで パージ ボタンを押します。温度が0°Cに下がるまで 、もう一度クール ボタンを押します。
  4. [塗りつぶし] ボタンと [パージ] ボタンを押して電源を切り、CO2 タンクを閉じます。[クール]ボタンを押下して電源を切り、[ヒート]ボタンを押します。
  5. 温度を 42 °C、圧力を 1,200 psi に設定します。圧力と温度が安定したら、 ブリード ボタンを押して圧力をゆっくりと下げます。
  6. チャンバーの圧力が 150 psi に達したら、 ベント ボタンを押し、圧力が 0 psi に低下するまで待ちます。臨界点乾燥機の電源を切り、カバースリップを取り外します。
  7. カーボン接着剤タブを使用してSEMアルミニウム試料マウントにカバースリップをマウントし、スパッタコーターで金/パラジウムを使用してスパッタコーティングを行います。
  8. 電源ボタンをオンにし、真空が30mTorrに達するまで待ちます。チャンバーをフラッシュし、ガススイッチをオフにし、ファインガスバルブを反時計回りに回して、湿度と空気を除去します。
  9. 真空が200mTorrに上昇したら、ガススイッチをオフにし、真空が30mTorrに達するまで待ちます。この手順を 3 回繰り返します。
  10. タイマーボタンを押し、ゲージが10mAを読み取るまで電圧ノブを調整します。コーティングされたカバースリップをチャンバーから取り外します。
    メモ:メーカーの指示に従って、サンプルの臨界点乾燥とスパッタコーティングを行います。

4. イメージングと定量化

  1. サンプルカバースリップを走査型電子顕微鏡のチャンバーに挿入します。ドアを閉じ、 Evac ボタンを押します。
  2. SEM 操作ソフトウェアを開きます。加速電圧を15 kv、作動距離を10 mmに設定します。
  3. [座標] ボタンを押し、セルが観測画面の中央に表示されるまでコントローラーの周りを移動します。倍率を 3,500 倍に設定し、[写真] ボタンをクリックしてサンプルを画像化します。
    注:原形質膜をより詳細に表示するには、より高いレベルの倍率(8,500倍から16,000倍)を使用してください。
  4. カバースリップ上の少なくとも10のランダムな場所から画像を撮影し、各顕微鏡フィールドに複数の細胞が含まれていることを確認します。画像を.tifファイルとして保存します。
  5. 画像から、原形質膜の突出した毛布状のひだとして定義される、500nmを超えるサイズの膜フリルを見つけます(図1)。セルあたりのフリルの数を数えます。
    注:C字型のフリルは、その側端に融合しなかった湾曲した膜突起として同定された[(図1 (M-CSF処理)および 図2B]。融合した円形膜フリルは、それらの閉鎖の前に、マクロピノサイトーシスカップとして同定された(図2C)。
  6. 膜フリルの数を、評価された顕微鏡視野内の細胞の総数に正規化する。各グループのサンプルについてこの分析を繰り返します。

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結果

ここで、提示された手法の結果について説明する。図1に示す代表的なSEM画像は、PMAおよびM-CSFによる処理後のRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する。画像は、最初に定量化目的で3,500倍の倍率で撮影され、次に原形質膜をより詳細に表示するためにより高いレベルの倍率(8,500倍〜16,000倍)で撮影された。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロファージの前処理は、膜ラッフル形成を弱毒化した(図1)。マクロピノサイトーシス関連原形質膜活動は、5つの連続したステップに分けることができる:1)膜フリルの開始、2)円形化、3)カップ形成、4)カップ閉鎖、および5)マクロピノソーム形成を介した細胞外液およびそれに関連する溶質の内在化。図2は、M-CSF刺激後のこれらの形態学的に異なる原形質膜活動の代表的な画像を示す。大型シート状のフリル(図2A)、円形のC字型フリル(図2...

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ディスカッション

本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。現在のプロトコールはマクロファージに焦点を当てているが、研究は、膜フリル形成が樹状細胞、線維芽細胞、ニューロン、および癌細胞を含む様々な他の細胞型においても起こることを示している11、12、14、21、30。これを考えると、細胞培養条件の最適化および異なる刺激剤または処理条件の使用は、他の細胞型における膜フリルの視覚化のために必要であり得る。

サンプル調製にはある程度の余裕がありますが、細胞表面構造を維持するためには、脱水および臨界点乾燥ステップに正確に従わなければなりません。さらに、水またはエタ...

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開示事項

著者らは利益相反がないと宣言しています。

謝辞

著者らは、SEMサンプル調製に協力してくれたLibby Perry(オーガスタ大学)に感謝している。この研究は、国立衛生研究所[R01HL139562(G.C.)およびK99HL146954(BS)]および米国心臓協会[17POST33661254(B.S.)]によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5% トリプシン EDTAGibco15400-054
2% グルタルアルデヒド電子顕微鏡科学16320
4% パラホルムアルデヒドサンタクルーズ バイオテクノロジー281692
5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロライドシグマ ライフサイエンスA3085
Accuri C6 フローサイトメーター
カーボン接着タブ電子顕微鏡科学77825-09
ジメチルスルホキシドコーニング25-950-CQC
ダルベッコの修正イーグル 培地Cytiva ライフサイエンスSH30022.01
ファルコン 24ウェル クリアフラットボトム TC処理マルチウェル細胞培養プレートファルコン353047
ウシ胎児血清ジェミニバイオ900-108
FitC-デキストランサーモフィッシャーサイエンティフィックD1823
FM 4-64サーモフィッシャーサイエンティフィックT13320
HERAcell 150i CO2 インキュベーターサーモフィッシャーサイエンティフィ51026282
ハマーモデル 6.2 スパッタコーターアナテックUSA58565
JSM-IT500HR 走査型電子顕微鏡
顕微鏡カバーサーモフィッシャーサイエンティフィック12-545-82
ペン 連鎖球菌Gibco15140-122
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテートミリポアシグマ524400
RAW 264.7 マクロファージATCCATCC TIB-71
組換えヒト M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790臨界点乾燥機Tousimis Research Corporation8778B
SEM アルミニウム試料マウント電子顕微鏡科学75220
カコジル酸ナトリウム電子顕微鏡科学12300
テキサス red-dextraサーモフィッシャーサイエンティフィックD1864
トリパンブルーソリューションサーモフィッシャーサイエンティフィック 15250061
Zeiss LSM 780共焦点顕微鏡
ック ガラス

参考文献

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