走査型電子顕微鏡による膜ラッフル形成の可視化

Summary

マクロピノサイトーシスは、膜フリルとしても知られるF-アクチンに富むシート状の膜突起の形成によって開始される高度に保存された内球性プロセスである。マクロピノサイトーシス溶質インターナリゼーションの速度の増加は、様々な病理学的状態に関与している。このプロトコルは、走査型電子顕微鏡を用いて インビトロで 膜ラッフル形成を定量する方法を提示する。

Abstract

メンブレンフリルは、新しく重合されたアクチンフィラメントのメッシュワークを含む運動性原形質膜凸部の形成である。膜フリルは、自発的に、または成長因子、炎症性サイトカイン、およびホルボールエステルに応答して形成され得る。膜突起の一部は、遠位縁で融合し、マクロピノソームと呼ばれる大きくて不均一な液胞として細胞質に閉じて分離するカップを形成する円形の膜フリルに再編成することができる。このプロセスの間、フリルはマクロピノソーム内に内在化する細胞外液および溶質を捕捉する。高分解能走査型電子顕微鏡(SEM)は、細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および閉じた大尖頭カップを視覚化および定量化するために一般的に使用されるイメージング技術です。以下のプロトコールは、細胞培養条件、 インビトロでの 膜ラッフル形成の刺激、およびSEMを用いたイメージングのための細胞の固定、脱水、および調製方法を記載する。この方法は、生理学的および病理学的プロセスにおけるマクロピノサイトーシスの役割に関する重要な質問に答え、膜フリル形成を調節する新しい標的を調査し、まだ特徴付けられていない生理学的刺激因子およびマクロピノサイトーシスの新規薬理学的阻害剤を同定するのに役立つ。

Introduction

マクロピノサイトーシスは、メンブレンフリル¹と呼ばれる動的でアクチン駆動の原形質膜突起の形成を介して、大量の細胞外液およびその内容物を内在化する内分泌過程である。これらの膜フリルの多くは、細胞を閉じて融合させ、マクロピノソーム1としても知られる大きくて不均一な細胞内エンドソームとして原形質膜から分離するカップ^{を形成する。}マクロピノサイトーシスは、広範囲の細胞型においてマクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)および上皮成長因子(EGF)などの成長因子によって誘導されるが、構成的マクロピノサイトーシスとして知られるさらなる独特のカルシウム依存性プロセスは、自然免疫細胞²、³、⁴、^5、6、^7、8においても観察されている。

マクロピノサイトーシスを介して細胞外物質をインターナライズする細胞の能力は、栄養素の取り込みから病原体の....

Protocol

注:以下は、SEM顕微鏡を用いてRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を定量するために使用される一般的なプロトコルである。異なる細胞タイプに対して最適化が必要な場合があります。

1. 細胞株および細胞培養

1. 37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、100IU/mLのペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)でRAW 264.7マクロファージを増殖させる。成長メディアは 1 日おきに交換します。
2. 細胞が80%コンフルエントになったら、滅菌PBSを使用してプレートを2回洗浄する。
3. 0.5%トリプシン-EDTAを1,000 μL加えて細胞を剥離し、細胞培養プレートを37°Cの加湿インキュベーター内で3〜5分間インキュベートする。
4. プレートを光学顕微鏡で調べ、細胞解離を確認した。10%FBSを含む10mLの成長培地を加えてトリプシンを不活性化する。
5. 細胞懸濁液を50mL円錐管に集め、400 x g で室温で5分間遠心分離する。完全な細胞培養培地中に細胞を穏やかに再懸濁し、トリパンブルー(0.4%)染色を用いて細胞数および生存率を決定する。
   注:この実験に推奨される最小細胞生存率は>90%です。
....

Results

ここで、提示された手法の結果について説明する。図1に示す代表的なSEM画像は、PMAおよびM-CSFによる処理後のRAW 264.7マクロファージにおける膜フリル形成を実証する。画像は、最初に定量化目的で3,500倍の倍率で撮影され、次に原形質膜をより詳細に表示するためにより高いレベルの倍率(8,500倍〜16,000倍)で撮影された。マクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによるマクロファージの前処理は、膜ラッフル形成を弱毒化した(図1)。マクロピノサイトーシス関連原形質膜活動は、5つの連続したステップに分けることができる:1)膜フリルの開始、2)円形化、3)カップ形成、4)カップ閉鎖、および5)マクロピノソーム形成を介した細胞外液およびそれに関連する溶質の内在化。図2は、M-CSF刺激後のこれらの形態学的に異なる原形質膜活動の代表的な画像を示す。大型シート状のフリル(図2A)、円形のC字型フリル(図2.......

Discussion

本SEMイメージングプロトコルは、インビトロで細胞表面上の膜フリル形成、円形突起、および大尖頭カップを視覚化および定量化するためのツールを提供する。現在のプロトコールはマクロファージに焦点を当てているが、研究は、膜フリル形成が樹状細胞、線維芽細胞、ニューロン、および癌細胞を含む様々な他の細胞型においても起こることを示している11、^12、14、^21、30。これを考えると、細胞培養条件の最適化および異なる刺激剤または処理条件の使用は、他の細胞型における膜フリルの視覚化のために必要であり得る。

サンプル調製にはある程度の余裕がありますが、細胞表面構造を維持するためには、脱水および臨界点乾燥ステップに正確に従わなければなりません。さらに、水またはエタ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% トリプシン EDTA	Gibco	15400-054
2% グルタルアルデヒド	電子顕微鏡科学	16320
4% パラホルムアルデヒド	サンタクルーズ バイオテクノロジー	281692
5-(N-エチル-N-イソプロピル)-アミロライド	シグマ ライフサイエンス	A3085
Accuri C6 フローサイトメーター
カーボン接着タブ	電子顕微鏡科学	77825-09
ジメチルスルホキシド	コーニング	25-950-CQC
ダルベッコの修正イーグル 培地	Cytiva ライフサイエンス	SH30022.01
ファルコン 24ウェル クリアフラットボトム TC処理マルチウェル細胞培養プレート	ファルコン	353047
ウシ胎児血清	ジェミニバイオ	900-108
FitC-デキストラン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1823
FM 4-64	サーモフィッシャーサイエンティフィック	T13320
HERAcell 150i CO2 インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィ	51026282
ハマーモデル 6.2 スパッタコーター	アナテックUSA	58565
JSM-IT500HR 走査型電子顕微鏡
顕微鏡カバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12-545-82
ペン 連鎖球菌	Gibco	15140-122
ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート	ミリポアシグマ	524400
RAW 264.7 マクロファージ	ATCC	ATCC TIB-71
組換えヒト M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790臨界点乾燥機	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM アルミニウム試料マウント	電子顕微鏡科学	75220
カコジル酸ナトリウム	電子顕微鏡科学	12300
テキサス red-dextra	サーモフィッシャーサイエンティフィック	D1864
トリパンブルーソリューション	サーモフィッシャーサイエンティフィック 15250061
Zeiss LSM 780共焦点顕微鏡