グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

Summary

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。

Abstract

スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、リボソームによって翻訳されている特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用できる強力なツールです。この技術では、自動グラジエントメーカーとグラジエント分画システムが一般的に使用されますが、これらのシステムは一般的に高価であり、リソースが限られている、または研究のためにこの方法を実行する頻度が低いか時折必要ないために費用を正当化できないラボにとっては法外なコストになる可能性があります。ここでは、特殊な分画装置なしでほとんどの分子生物学研究室で利用可能な標準装置を使用して、ポリソームプロファイルを再現性よく生成するためのプロトコルが提示されています。さらに、グラジエント分画システムの有無にかかわらず生成されたポリソームプロファイルの比較が提供されます。再現性のあるポリソームプロファイルを最適化して生成するための戦略について説明します。 サッカロミセス・セレビシエ は、このプロトコルのモデル生物として利用されています。ただし、このプロトコルは、多くの異なる生物および細胞タイプのリボソームプロファイルを生成するために簡単に変更および適合させることができます。

Introduction

リボソームは、mRNAをタンパク質に翻訳する基本的なプロセスを実行するメガダルトンリボ核タンパク質複合体です。リボソームは、細胞内のすべてのタンパク質の合成を実行する役割を果たします。真核生物のリボソームは、沈降係数に応じて小さなリボソームサブユニット(40S)と大きなリボソームサブユニット(60S)として指定された2つのサブユニットで構成されています。完全に組み立てられたリボソームは80Sモノソームとして指定されます。ポリソームは、単一のmRNA分子の翻訳に従事するリボソームのグループです。スクロース密度勾配遠心分離によるポリソーム分画は、リボソームプロファイルの作成、翻訳リボソームに関連する特定のmRNAの同定、およびポリソーム関連因子の分析に使用される強力な方法です1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ^....

Protocol

1. 7%〜47%スクロースグラジエントの調製

注:スクロース勾配の線形範囲は、使用する細胞の種類に応じて、より良い分離を達成するために変更できます。このプロトコルは、 S. cerevisiaeのポリソームプロファイル用に最適化されています。

1. スクロースグラジエントバッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.4、60 mM KCl、10 mM MgCl₂、および1 mM DTT)で7%および47%スクロースのストック溶液を調製します。フィルターは、ショ糖ストック溶液を0.22 μmフィルターで滅菌し、4°Cで保存します。
2. 表1に記載の方法で7%および47%のスクロースストック溶液を分注および混合することにより、17%、27%、および37%のスクロース溶液の14mLを調製する。
3. 6本のポリプロピレン製遠心チューブ(14 x 89 mm)をフルビューの試験管ラックに入れます。1つのチューブでのアクションが他のチューブを邪魔しないように、チューブ間に十分なスペースを確保してください。
4. 長い針を3 mLシリンジに取り付けます。このプロトコルでは、先端が鈍い9インチ、22 Gの針を使用しますが(図1)、遠心管の底に達するのに十分な長さの針で十分です。
   注意:....

Results

3つの代表的なポリソームプロファイルを図3に示す。すべてのプロファイルは同じ酵母株からのものです。典型的なポリソームプロファイルは、40S、60S、および80Sリボソームサブユニットおよびポリソームのよく分解されたピークを有する。各リボソームサブユニットの頂上とポリソームピークは、各プロファイルで明らかになります(図3)。自動密度分画システムの代表的なプロファイルを図3Aに示します。このプロファイルを生成するために使用されるスクロース勾配は、このプロトコルに記載されているように手作業で調製されました。図3Aに示すこのプロファイルは、スクロース勾配が検出器フローセルを通る追跡溶液によって下から上に置換され、フラクションに収集されたときの連続吸光度プロファイルから生成されました。これらのシステムは吸光度を継続的に測定するため、1,500を超えるデータポイントを記録できます。同じ数のデータポイントを手動で生.......

Discussion

ここでは、高価な自動分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを作成する方法について説明しました。この方法の利点は、自動分画システムを持たないラボがポリソームプロファイリングにアクセスできることです。このプロトコルの主な欠点は、専用の密度分画システムと比較して、面倒な手の分画と感度の低下です。

このプロトコルでは、リボソームサブユニット、モノソーム、およびポリソームを分離するのに十分な分解能でスクロース勾配を慎重に調製する必要があります。スクロース勾配を調製する場合、勾配層をロードするときに気泡を導入しないことが重要です。気泡は下から上に上昇し、勾配の直線性を乱す可能性があります。さらに、各勾配層の完全性を確保するために、各使用前に針の外側を拭き取り、余分なスクロース溶液を内腔から取り除く必要があります。4°Cでの勾配の一晩保管は、冷蔵室で行う必要があります。冷蔵庫でコンプレッサーのオンとオフを切り替えることによって引き起こされる振動は、勾配を乱す可能性があります。

このアッセイのもう一つの重要な部分は、グラジエントの量と.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
自動分画装置	Brandel
Clariostar マルチモード プレート リーダー	BMG Labtech
シクロヘキシミド	Sigma Aldrich	C7698
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
ガラスビーズ、酸洗浄	Sigma Aldrich	G8772	425–600 μm
ヘパリン	シグマ アルドリッチ	H4784
塩化マグネシウム、1 m	KD 医療	CAC-5290
針、22 g、メタル ハブ	ハミルトン カンパニー	7748-08	カスタム長さ 9 インチ、ポイント スタイル 3
オプティマ XL-100K 超遠心分離機	ベックマン・コールター
ポリプロピレン遠心分離管	ベックマン・コールター	331372
ポリプロピレン試験管 ペグラック	フィッシャーサイエンティフィック	14-810-54A
塩化カリウム	Sigma Aldrich	P9541
Qubit 4 蛍光光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Q33228
量子ビット RNA HS アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Q32855
RNAse 阻害剤	応用バイオシステム	N8080119
スクロース	Sigma Aldrich	S0389
SW41 スイング バケット ローター パッケージ	ベックマン コールター	331336
シリンジ、3 mL	Coviden	888151394
Tris、1 M、pH 7.4	KD Medical	RGF-3340
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100
UV-Star Microplate、96 ウェル	Greiner Bio-One