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方法論記事

ピュアシフト核磁気共鳴:植物メタボロミクスのための新しいツール

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DOI:

10.3791/62719

⸱

2021年7月31日

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

この記事について

サマリー

この論文では、植物の代謝プロファイリングにおけるPSYCHEとSAPPHIRE-PSYCHEの使用を紹介し、サンプル調製と最適なPure Shift NMRスペクトル記録の詳細な手順を紹介しています。同種核デカップリングによって達成される分解能の向上により、システムのより包括的な理解が可能になる例について説明します。

要約

核磁気共鳴(NMR)は、メタボロミクスで使用される最も強力なツールの1つです。これは、定量データを提供するだけでなく、複雑な混合物中に存在する代謝物の構造的同定を可能にする、非常に正確で再現性の高い方法として立っています。

1H NMRによる代謝プロファイリングは、作物の状態の評価、収穫および収穫後の処理、代謝表現型、代謝経路、遺伝子調節、バイオマーカーの同定、化学分類学、品質管理、原産地呼称など、さまざまなタイプの植物シナリオの研究に有用であることが証明されています。しかし、J結合の多重度が拡大した多数の共鳴のシグナルの重なりは、スペクトル解析とその解釈を複雑にし、従来の1HNMRプロファイリングの限界を表しています。

過去10年間で、 1HNMRの古典的スペクトルに特有のスペクトル分解能の問題を克服するために、複数の信号を単一の共鳴線に集約する新しいNMR広帯域同核デカップリング技術(一般にピュアシフト法と呼ばれる)が開発されました。

ここでは、植物抽出物調製の段階的なプロトコルと、 バニラ 植物の葉、ジャガイモ塊茎(S.tuberosum)、ケープグーズベリー(P.peruviana)の3つの異なる植物マトリックスで最適なPure Shift PSYCHEおよびSAPPHIRE-PSYCHEスペクトルを記録する手順を紹介します。代謝同定、相関分析、および多変量解析における分解能の向上の影響について、従来のスペクトルと比較して説明します。

概要

生物を構成する代謝産物の完全なセット(基質、中間体、および生物学的プロセスの最終生成物)は、1998年にメタボロームという用語で造られました。メタボロームが表現型と密接に関連していることはよく知られており、遺伝子型と環境との間の直接的な相互作用を反映しているため、植物では特に興味深い1,2。したがって、メタボロームプロファイルの特性評価は、植物において最も重要になっています。バイオマーカー(主要な代謝物)と代謝パターンの同定と定量化を通じて、種、栽培品種、開発段階、病原性疾患、または環境条件(日常および季節の変化、土壌、水ストレス、機械的ストレス、収穫および収穫後の処理)などを区別することが可能になりました3,4,5。

質量分析(MS)および核磁気共鳴(NMR)分光法は、この目的のために最も広く使用されている分析プラットフォームです。MS法とは異なり、NMRは再現性が高く、バイアスがなく、定量的で、正確で、非破壊的な手法であり、最小限のサンプル調製で済むため、メタボロミクス研究に適しています。ただし、MSメソッドと比較すると、固有の感度の低さが限界です。近年、高磁場磁石、極低温プローブ、マイクロコイルデバイス、動的核分極(DNP)法の使用により、NMRの感度は大幅に向上しています。例えば、後者のアプローチの場合、感度向上は2〜3桁の大きさ6,7のレベルであった。現在までに発表されたメタボロミクス研究の約20%がNMRベースであり、その数は増加しています7。

陽子NMRは、NMRメタボロミクスフィンガープリント法の最も人気があり感度の高い実験ですが、いくつかの欠点があります。まず、サンプルで検出されたすべての 1HNMR信号は、プロトン化学シフトウィンドウに対応する小さなウィンドウに分布するため、スペクトルが混雑します。次に、同核スカラー結合は信号を複数の成分に分割し(信号の多重度)、プロトン信号をより広い周波数範囲に拡散し、混雑と信号の重なりが増加することにより、スペクトルの読み取りをさらに複雑にします。さらに、NMRメタボロミクスは、NMR観察可能な濃度で通常50〜300分子を含む混合物の分析に使用され、200〜2000のピークからなる複雑なスペクトルを生成します。

同核デカップリングプロトンNMRは、Pure Shiftとも呼ばれ、マルチプレットシグナルを1つのピークに崩壊させる方法です。これは、混雑したスペクトル8,9,10のシグナル分解能を向上させるための優れたツールであり、したがって、植物のメタボロミクス11にとって便利なツールである。

過去10年間で、感度とデカップリング性能の両方を向上させる新しいPure Shiftパルスシーケンスが登場しました。その応用範囲も、分子構造解析12,13からフラクソミクス14、混合物割り当て15,16,17、並進拡散測定18、鏡像異性体弁別19、共重合体中の単位分布20など、多岐にわたります。

歴史的に、Broadband Pure Shift実験は感度が低く、処理方法が複雑であるため、生物学的抽出物の評価範囲が限られていました8。2014年、Foroozandehらは、反z-COSYパルスシーケンスに基づく新しいPure Shift実験であるPSYCHE(Pure Shift Yielded by Chirp Excitation)を発表し、優れた同核デカップリングと感度値の改善をもたらしました21。しかし、PSYCHEは時間領域データのチャンクを取得する2Dインタフェログラム実験であるため、チャンクのエッジでの J結合変調歪みに起因する周期的な側波帯アーチファクトの影響を受けます。複雑な混合物では、これらのアーティファクトは、非常に低濃度で存在する代謝物に関連するシグナルよりも大きなシグナルを生成し、分析11を妨げます。これらのアーティファクトを除去するには、TSE-PHYCHE22 と、SAPPHIRE-PSYCHE(Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23と呼ばれるPSYCHE実験のより最近の修正方法の2つがある。

2019年には、感度ペナルティをほとんど受けずにアーティファクトを除去するSAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift法11が、一般にケープグーズベリー11として知られているPhysalis peruvianaの果実の抽出物などの複雑な生物学的混合物の分析に採用できることを初めて実証しました11。これらの方法により、代謝アサイン、相関解析、多変量係数解析などのメタボロミクスデータ解析の性能が向上することを示した11。それ以来、ソフトコーラル24、オトギリソウ植物25、蜂蜜26,27、茶27、ペパーミントオイル26、クルミ28など、さまざまな生物学的マトリックスに関するいくつかのピュアシフトメタボロミクス研究が取り組まれており、メタボロミクス分析の新しいツールとしての重要性が実証されています。逆説的ですが、これらの研究の大部分は、より優れたパフォーマンスを発揮することが示されているSAPPHIRE-PSYCHEパルスシーケンスの代わりに、どの分光器ライブラリからでも入手できる標準的で実装が容易なPSYCHEパルスシーケンスを採用していました。ただし、適切なセットアップを行うには、パルスシーケンスをよりよく理解する必要があります。

この論文は、新しいユーザーが植物、特に バニラsp (V.planifolia および V.pompona)29、ジャガイモ塊茎(S.tuberosum)30、およびケープグーズベリー(P.peruviana)31の葉の研究にピュアシフト法を適用するのを支援することを目的としています。サンプル調製、NMR実験のセットアップ、データ取得、データ解析について詳しく説明しています。さらに、このプロトコルには、この分野に不慣れな研究者が、植物のメタボロームプロファイリングにおけるPSYCHEおよびSAPPHIRE-PSYCHE実験を適切に設定するのに役立つ重要な注意事項が含まれています。

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プロトコル

1. サンプル調製

  1. ケープグーズベリー
    1. 100〜200gの新鮮な果物をブレンダーの花瓶に入れます。4°Cで30分間保持した後、実験室のブレンダーで均質化します。
    2. すぐに、ジュースを50mLのプラスチックチューブに移し、液体窒素で凍結し、4〜5日間凍結乾燥させます。
    3. 凍結乾燥された材料を電動グラインダーを使用して微粉末に粉砕します。
      注:粉末は吸湿性が高いため、乾燥材料の取り扱いは迅速に行う必要があります。
    4. 粉砕材1gを秤量し、超純水10mLを加えます。1分間渦巻きます。
    5. 10°Cで20分間超音波処理し、次いで23,000 × g で10°Cで20分間遠心分離する。
    6. 上清を回収し、13 mmポリテトラフルオロエチレン(PTFE)0.45 μmシリンジフィルターでろ過します。
    7. ろ過した抽出物1 mLを凍結乾燥させ、得られた固体を0.9 mLの200 mMシュウ酸ナトリウム緩衝液pH 4に再懸濁します。渦動。
    8. 得られたサンプルを凍結乾燥させて乾燥させ、5 mMの3-(トリメチルシリル)プロピオン-2,2,3,3-d4 酸性ナトリウム塩(TMSP-d4)を含む0.9 mLの重水素酸化物に溶解します。
    9. マイクロピペットを使用して、NMRチューブに0.6 mLのサンプルを満たします。
  2. バニラ の葉
    1. 葉を集め、湿らせたティッシュペーパーできれいにし、液体窒素で丸ごと冷凍します。
    2. 葉を細かく砕き、乾くまで4日間凍結乾燥します。
    3. 乾物を電動グラインダーを使用して微粉末に粉砕します。
    4. 粉砕材料50 mgを秤量し、0.1%のTMSP(w / w)および0.75 mLのメタノール-d4を含む重水素酸化物に0.75 mLのリン酸緩衝液pH 6.0を加えます。1分間渦巻きます。
    5. 25°Cで20分間超音波処理します。
    6. 13,000 × g で25°Cで10分間遠心分離します。
    7. 上清(~1.3-1.4 mL)を回収し、13 mm PTFE 0.45 μmシリンジフィルターでろ過します。
    8. マイクロピペットを使用して、ろ過したサンプル0.6 mLをNMRチューブに充填します。
  3. ジャガイモ塊茎
    1. 塊茎を4〜8個皮をむいてスライスします。すぐに、約125gの材料をスタンドアップバッグに入れ、液体窒素で凍結します。
      注意: 取り扱い中の酸化を避けるために、ジャガイモをdに保ちますamp.
    2. 完全に乾くまで4〜6日間凍結乾燥します。
    3. 乾物を電動グラインダーを使用して微粉末に粉砕します。
    4. 160 mgの粉砕塊茎を秤量し、1.6 mLの脱イオン水を加えます。1分間渦巻きます。
    5. 10°Cで45分間超音波処理します。
    6. 23,000 x g で10°Cで20分間遠心分離します。
    7. 上清(~1.5 -1.6 mL)を回収し、冷蔵遠心真空濃縮器で10°Cで16時間蒸発させて乾燥させます。
    8. 得られた固体(20-25 mg)に0.9 mLの100 mMシュウ酸ナトリウム緩衝液pH 4を加え、ボルテックスし、10°Cで16時間蒸発させます。
    9. 得られた固体を、3 mMのTMSPを含む0.9 mLの酸化重水素に溶解します。
    10. 23,000 x gで10°Cで5分間遠心分離し、上清を13 mm PTFE 0.45 μmシリンジフィルターでNMRチューブに直接ろ過します。
      注:この場合、1000を超えるサンプルの調製におけるステップを減らすために、NMRチューブへの直接ろ過が行われました。

2. NMRデータの取得と処理

  1. NMR初期設定
    1. サンプルをNMR分光計に移します。
    2. プローブヘッドを調整し、一致させます。
    3. サンプルをロックしてシムします。
    4. 90°のハードパルスを校正します。90°パルスは、標準的な手順のいずれかを使用して校正します。
    5. 標準的な1DプロトンNMRスペクトルを実行します。
  2. PSYCHE実験
    1. Bruker Topspinライブラリからreset_psyche_1dパルスシーケンスを選択します(図S1)。次の標準パラメータを使用します:5 kHzスペクトル幅(SW2)、少なくとも1秒または2秒の緩和回復遅延(D1)、16回のダミースキャン(DS)、ブロックあたり64または128の複素データポイント(L31)、および64または128スキャン(NS)(図S1)。
      注:L31は、各Pure Shiftブロックで取得された複素デジタルポイントの数であり、2の累乗に設定するのが最適です。21名
    2. 目的のCHIRPパルス反転角度励起(CNST61)とCHIRPパルス帯域幅(CNST60)の10kHzを設定します(図S2)。
      注:PSYCHE実験は、反z-COSYスキームに基づいています。したがって、CHIRPパルスの反転角度は、再結合アーチファクトを避けるために小さくする必要があります(図1)。絶対強度は、励起フリップ角度とともに増加します。周期的なアーチファクトも増強され、スペクトルに広がり、「ノイズ」が増加します(図1)。「ノイズ」は、標準的なノイズとチャッキングアーティファクトの組み合わせになります。感度と低再結合アーチファクトの間の適切な妥協点は、CNST61 = 20°に設定することです。19,22
    3. ハードパルス長(P1)を以前に校正した値に設定し、PSYCHE形状パルス長を30ミリ秒(P49)に設定します(図S2)。
      注:形状パルスパワーはこの値から自動的に計算されるため、ハードパルス値を較正することは非常に重要です。
    4. PSYCHEエレメント(図S2)のCrp_psyche.20(SPNAM 37)形状パルスを選択します。
    5. PSYCHEエレメント(GPZ0)中に適用されるパルスフィールド勾配の強度を設定します。勾配形状パルス(GPNAM 0)にはRECT.1を選択します(図S2)。
      注:PSYCHEエレメントでは、プローブにもよりますが、通常は勾配の最大強度の1%から4%の間で、弱い磁場勾配が適用されます。
    6. Pure Shift FID (TD1) を再構築するために取得するブロック数を設定します (図 S3)。
      注:PSYCHEは、TD1がPure Shiftインタフェログラムブロックの数である疑似2D実験として取得されます。スペクトル分解能は、スペクトルウィンドウのサイズ(SW1)と取得したポイントの総数(TD1*2*L31)によって異なります。通常、ブロックごとに64または128の複素点を持つ16または32ブロックは、十分なデジタル解像度を提供します。PSYCHEはインタフェログラム方式で記録されるため、ブロック数が多いほどデジタル解像度は向上しますが、合計取得時間も19になります。同種Jカップリングは、各ブロックの間に進化し、振動するJ変調パターン21,23をもたらす。フーリエ変換後、ブロックの長さに依存する周期的な側波帯アーチファクトが生成されます(図2)。アーティファクトを減らすには、ブロックの持続時間を短くし、通常は 16 ミリ秒未満にする必要があります (ブロック持続時間 = 2*in0: 図 S1)。ブロック期間が長い場合は、L31を減らします。
    7. BrukerのProc_reset AUプログラムとフーリエ変換でデータを処理します。
      注:ゼロフィリングとサインベルアポダイゼーションを使用してスペクトルを変換することをお勧めします(図S4)。
  3. SAPPHIRE-PSYCHE実験
    1. SAPPHIRE-PSYCHEパルスシーケンスを選択し、パルスシーケンスパラメータを設定します。標準パラメータは、5 kHzスペクトル幅(SW3)、少なくとも1秒または2秒の緩和遅延(D1)、16回のダミースキャン(DS)、増分あたり8回または16回のスキャン(NS)、およびD2〜14ミリ秒(図S5)です。
      注:この配列はブルカーのレパートリーにはありませんが、配列および処理プログラムは、Manchester NMR Methodology Groupのウェブサイト(https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23から入手できます。D2遅延により、T2の緩和はJ変調の増加ごとに一定に保たれます。D2 は 1/4*SW1+p16+2*d16 より大きくする必要があります。23名
    2. 目的のCHIRPパルス反転角度励起(CNST20)とCHIRPパルス帯域幅(CNST21)の10kHzを設定します(図S6)。
      注:通常のPSYCHE実験と同様に、CHIRPパルスフリップ角度は、再結合アーティファクトを避けるために短くする必要があります。CNST20 = 20°は、感度と低再結合アーチファクト21,23,25との間の適切な妥協点です。
    3. ハードパルス長(P1)を以前に校正した値に設定し、PSYCHE形状パルス長を30ミリ秒(P40)に設定します(図S6)。
      注:形状パルスパワーはハードパルス値から自動的に計算されるため、ハードパルス値をキャリブレーションすることが重要です。
    4. PSYCHEエレメントのPSYCHE_Saltire_10kHz_30m形状パルスを選択します(図S6)。
    5. PSYCHEエレメント(GPZ10)中に適用されるパルスフィールド勾配の強度を設定します。勾配形状パルス(GPNAM 10)にはRECT.1を選択します(図S7)。
      注:PSYCHEエレメントの間、通常は勾配の最大強度の1%から4%の間で、弱い磁場勾配が適用されます。この値はプローブによって異なります。
    6. F2(TD2)でSAPPHIRE J 変調の増分数を設定します(図S7)。
      注:通常、8つの増分により、サイドバンドアーチファクトの優れた抑制が保証されます(図2および3)。最終的なピュアシフトFIDのスキャンの総数はNS*TD2です。23名
    7. F1 と F2 のスペクトル ウィンドウ (SW1 と SW2) を設定します (図 S5)。
      注:SW2 = SW3 /(2 * TD2)およびSW3 / SW1 = TD2 * NはTD2であり、Nは偶数の整数23です。SAPPHIRE-PSYCHE実験は、F2がJ結合アーチファクト位相変調を符号化し、F1がPure Shiftインタフェログラム取得20を符号化する疑似3Dとして取得される。SAPPHIRE-PSYCHEはJ変調側波帯を除去するため、インタフェログラムのPure Shiftブロック持続時間は通常のPSYCHEよりも長くなり(Pure Shiftブロック持続時間= 1/SW1)、通常は20〜40msになる可能性があります(図2)。しかし、チャンク・データ・アクイジションが長くなると、J-結合の進化が強くなり、達成された23の強い側波帯を除去するために、より多くのJ-結合位相変調の増分が必要になる。
    8. Pure Shiftブロック(TD1)の数を設定します(図S7)。
      注:SAPPHIRE-PSYCHEは最初のブロックの J結合位相変調を補償する必要があるため、追加のブロックを取得する必要があります。通常、17(16 + 1)または33(32 + 1)ブロックは十分なデジタル解像度23を提供します。
    9. pm_pshiftとpm_fidadd AUプログラムを実行し、続いてフーリエ変換23を実行してデータを処理します。
      注:ゼロフィリングとサインベルアポダイゼーションを使用してスペクトルを変換することをお勧めします(図S4)。

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結果

NMRスペクトル解析
PSYCHE実験は、結合共鳴をシングレット21に集約することによりスペクトル分解能を向上させ、これによりオーバーラップが減少し、割り当てとデータ解析が容易になります。ピュアシフトNMRは、植物抽出物に適用することができます。ここでは、バニラの葉、ジャガイモの塊茎、 Physalis peruviana の果実の3つの異なるマトリックスでの使用を示します。これらの植物抽出物のスペクトルで達成された分解能の向上は、 図S8〜S11から明らかです。

NMR信号の分解能におけるこれらのパルスシーケンスの影響を評価するために、最大高さの10%(W10)における周波数単位での線の幅をいくつかのタイプの共鳴について計算しました。これらはすべて、バニラsp抽出物で得られたスペクトル(古典的な1HNMRに対する純粋なシフト)で例示されています(

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ディスカッション

代謝物の構造同定と定量は、メタボロームの特性評価における重要な問題であり、多変量解析を行うと、研究対象の生物学的システムをよりよく理解することができます。サンプル調製とデータ取得は、信頼性の高い結果を得るために最適化が必要な重要な側面です。

この記事では、3つの異なる植物マトリックスのNMR分析のためのサンプル調製について説明し、図解します。他の抽出手順と同様に、材料1グラムあたりの溶媒の量と選択した溶媒の物理的特性によって、最終抽出物の化学組成と抽出された代謝物の濃度が決まります。NMRメタボロームプロファイリングの場合、pH、独立したサンプル抽出間の再現性、NMRチューブ内の抽出物の最終量も最適化が必要な側面です。メタボロミクスにおける再現性の重要性は、信頼性の低い結果につながる可能性のある相関しない分散の導入を避けることです。私たちの経験では、乾燥して粉砕した植物材料で最適な抽出条件が達成されました。ケープグーズベリーの場合、乾燥製品の取り扱いが非常に困難(吸湿性が高い)であったため、新鮮なベリーは、リオフィ...

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開示事項

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

この研究は、Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - Contract # 008-2017-FONDECYT によって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
77500シリーズフリーゾーン4.5リットルベンチトップLabconco77500
Bruker Avance III 500 MHz、5 mm TCI Z勾配極低温プローブを装備Bruker Corporation
Centrivap 冷蔵遠心濃縮器 Labconco 7310000シリーズLabconco7310000
酸化重水素Sigma-Aldrich151882
グラインダーマシンMKM6003ボッシュMKM6003
リクアドーラブレンダー8011SモデルHgb2wts3リングHgb2wts3
ノール-d4シグマアルドリッチ151947
ワーメタ

参考文献

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