ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価

Summary

ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。

Abstract

腸の地域仕様は、発達中の胃腸(GI)管の定義された領域に独自の形態と機能が付与されるプロセスを説明しています。腸内の局所的な特異性は、骨形成タンパク質(BMP)経路を含む複数の発生経路によって駆動されます。通常の地域仕様に基づき、ヒト胚性幹細胞(hES)と人工多能性幹細胞(iPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)からヒト結腸オルガノイド(HCO)を作製する方法を開発しました。BMPシグナル伝達の3日間の誘導により、中腸/後腸管培養物を、ヒト結腸に存在するすべての主要な上皮細胞タイプを含む特別なATリッチ配列結合タンパク質2(SATB2)発現HCOに十分にパターン化し、共発達する間葉系細胞にもたらします。この重要なパターニング期間中のBMPの省略(またはBMP阻害剤NOGGINの追加)により、ヒト腸オルガノイド(HIO)が形成されました。HIOとHCOは、形態学的および分子的に、それぞれヒトの発育中の小腸と結腸に似ています。HIOとHCOはヒトの腸の発達を研究する上で有用であるにもかかわらず、HIOとHCOの生成は困難です。この論文では、HIOおよびHCOを生成、維持、および特性評価する方法を紹介します。さらに、プロトコルの重要な手順とトラブルシューティングの推奨事項も示されています。

Introduction

ヒトの結腸発生の研究は、ヒトの胎児組織の使用に制限があるため困難です。動物モデルは、腸の発達を研究するためのマウスの遺伝的アプローチに非常に貴重であり、歴史的に使用されてきました。しかし、マウスとヒトの腸管発生の違いにより、マウスのモデルシステムとしての適用性は限られています。例えば、マウスの小腸や結腸での陰窩形成は出生後に起こりますが、ヒトは生まれつき完全に形成された陰窩¹を持っています。さらに、ヒトの小腸と結腸には、小腸のモチリン(MLN)発現腸内分泌細胞²や結腸のムチン5B(MUC5B)発現杯細胞^3,4など、マウスには見られない細胞タイプが含まれています。このため、結腸発生の初期段階を定義する動的な分子イベントを正確にモデル化する細胞培養システムを持つことが重要です。したがって、結腸特性を持つ細胞を生成するようにhPSCを指示することは、ヒトの結腸発生の研究のための強力なモデルを提供します。

プロトコル^は、hPSCからの腸様オルガノイド⁶ および結腸様オルガノイド

Protocol

1. ヒト腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製

1. ECMコーティングプレートの準備
   1. 50 mLのコニカルチューブに50 mLの冷たいDMEM培地を加えます。
   2. -80°Cの冷凍庫から4x hESC認定ECM( 材料表を参照)のアリコートを取り出し、氷上で解凍します。
      注意: 製品の分析証明書を参照して、4xストックを準備するために必要なESC認定ECMの量を決定します。
   3. hESC認定ECMが完全に解凍されていない場合は、50mLのコニカルチューブから750μLのDMEMを取り出し、ECMと混合します。
   4. DMEM/hESCで修飾されたECM混合物をDMEMで50mLコニカルチューブに移し、よく混合します。1ウェルあたり0.5 mLを4 x 24ウェル細胞培養プレートのそれぞれに加えます。
   5. プレートを振ってECMをウェル全体に均等に広げ、表面全体が覆われていることを確認します。パラフィルムを使用して、ECMコーティングされたプレートを密封し、バイオセーフティキャビネットに室温で少なくとも1時間放置します。ECMコーティングプレートは、最大2週間または必要になるまで4°Cで保管してください。
2. hPSCsシングルセルめっき
   1. ECMコー....

Results

中腸/後腸誘導期におけるスフェロイドの生成の成功は、パターニングの成功を示しています。浮遊スフェロイドおよび単層上のCDX2のIF染色を行い、パターニングが正しいことを確認します。決定的な内胚葉(DE)段階での染色はDE誘導の有効性を示すことができますが、効率的なDE誘導なしにはスフェロイドの生成は不可能です。DE誘導の効率をテストするには、FOXA2およびSOX17のIF染色および/またはRT-qPCRを実施します。

パターニングの段階に続いて、HOX因子の発現は、パターニングが成功したことを示す最良の指標です。HOX因子は、主に腸および結腸間葉^8,9で発現されます。したがって、HOX因子の発現は間葉のパターン化を反映します。前部HOX因子HOXD3のmRNAの発現は、NOGGINで処理されたHIOで最も高く、上皮成長因子(EGF)で処理されたHIOでは少なく、BMPで処理されたHCOで最も低いはずです。逆に、HOXA13および.......

Discussion

hPSCをHIOとHCOに区別することは、各ステップで品質管理を必要とする複雑なプロセスです。開始時の hPSC は、DE への分化を開始する前に、最小限の分化を行う必要があります。DE分化のために播種されたhPSCの密度を最適化することは、プロトコールの成功にとって重要です。DE分化の品質を確保するには、FOXA2とSOX17のIFを実行して、DE分化の効率を決定します。DEの分化により、処理した細胞の80%以上がFOXA2およびSOX17に陽性で染色されるはずです。最適な密度が確立されると、この同じ密度を複数の実験に使用でき、同様の成功を収めることができます。DEの分化が成功した後、中腸/後腸誘導は非常に効率的であるはずです。ECMでプレーティングした後、中腸/後腸スフェロイドにBMP2をパターニングすると、スフェロイドからのオルガノイド形成効率が低下します(~15%)。したがって、HCO生成のためのECMバブルあたりのスフェロイドは、HIOと比較して2〜3倍多くなります。

DE分化の最適な密度は、細胞株によっ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液	該当なし	該当なし	該当なし
15 mL Corningチューブ	隼	21008-918	該当なし
30% ショ糖	該当なし	該当なし	PBS製。
5%ノーマルロバ血清	ジャクソン免疫研究所	017-000-121	該当なし
50 mL Corningチューブ	隼	21008-951	該当なし
アキュターゼ	サーモサイエンティフィック	A1110501	細胞剥離溶液;5 mLのアキュターゼを合計20本のチューブの10 mLチューブにアリコートし、-20°Cで保存します。Cは最長6ヶ月間。4度に配置します。使用前にCを一晩。
アクチビンA	細胞誘導システム	GFH6-100x10	凍結乾燥粉末を100µで再構成します。0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む滅菌 PBS 中の g/mL。アリコート38&マイクロ;LのアクチビンAを予冷した微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存します。C(チューブの有効期限は受領日から12ヶ月です)。
アクチビン 1 日目培地 (RPMI 1640)	コーニング	MT10041CV	非必須アミノ酸(NEAA、Corning 11140050)を使用し、4°Cで保存します。基本1日目の培地:500 mLのRPMI 1640および500 mLのNEAA。アクチビン1日目培地を調製するときは、13 mLの塩基性1日目培地、13およびマイクロを加えます。l アクチビン A (100 & micro;g/mL)、および2µBMP4 の l (100 & micro;g/mL)。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
アクチビン 2 日目培地 (RPMI 1640、0.2% FBS vol/vol)	ハイクローン	SH30070.03トン	非必須アミノ酸(Corning 11140050)を使用し、4°Cで保存します。塩基性2日目培地:RPMI 1640 500 mL、NEAA 500 mL、0.2%血清1 mL。アクチビン2日培地を調製するときは、12.5 mLの塩基性2日目培地と12.5&マイクロを加えます。LのアクチビンA(100µg/mL)。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
アクチビン 3 日目培地 (RPMI 1640、2% FBS vol/vol)	ハイクローン	SH30070.03トン	非必須アミノ酸(Corning 11140050)を使用し、4°Cで保存します。塩基性3日目培地:RPMI 1640 500 mL、NEAA 500 mL、および2%血清10 mL。アクチビン3日目培地を調製するときは、12.5 mLの塩基性3日目と12.5日目&マイクロを加えます。LのアクチビンA(100µg/mL)。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
Alexa Fluor 488 ロバアンチヤギ	サーモサイエンティフィック	A11055	1:500希釈(二次抗体)
Alexa Fluor 488 ロバ アンチラビット	サーモサイエンティフィック	A21206	1:500希釈(二次抗体)
Alexa Fluor 546 ドンキーアンチマウス	サーモサイエンティフィック	A10036	1:500希釈(二次抗体)
Alexa Fluor 647 ロバアンチマウス	サーモサイエンティフィック	A31571	1:500希釈(二次抗体)
ベース金型	漁夫	22-363-552	該当なし
基本的な腸内培地(高度なDMEM)	ギブコ	12491015	塩基性腸内培地を調製するときは、500 mLのDMEM、500 mLのN2(Gibco 17-502-048)、500 mLのB27(Gibco)、500 mLのL-グルタミンを加えて2 mM L-グルタミン(Corning A2916801)、5 mLの100 U / mLペニシリン-ストレプトマイシン(Gibco 15-140-122)、および7.5 mLの 1 M HEPES で 15 mM HEPES が得られます。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
Biorad CFX96 タッチリアルタイムPCR検出システム	バイオラッド	該当なし	他のqRT-PCRシステムも使用できます。
細胞回収ソリューション	コーニング	354253	ECM劣化ソリューション
CHIR99021	リプロセル	4000410	2.15 mLのDMSOを10 mMで添加して再構成します。50&マイクロを用意します。Lアリコートし、-20°Cで保存します。粉末を4度で保管します。C、光から保護されています。
CTRL HIOパターニング媒体	該当なし	該当なし	塩基性腸培地と100 ng / mL EGF。
DAPIの	シグマ・アルドリッチ	D9542	1:100希釈(二次抗体)
DE単層	該当なし	該当なし	単層は前のステップで生成されました(セクション4.4)。
分散	ギブコ	17105041	凍結乾燥粉末をアドバンスドDMEM(Gibco MT15090CV)に最終濃度1 mg/mLに再懸濁します。ミリポアフィルター滅菌チューブを使用して真空吸いして滅菌用の溶液をろ過します。10 mLのアリコート(1 mg / mL)を作成し、-20°Cで保存します。Cは最長6ヶ月間。4度に配置します。使用前にCを一晩。
EGFの	サーモサイエンティフィック	236-EG-01M	100 ng/mL EGF を調製する場合、500 & micro を再構成します。滅菌PBS中のg / mL。次に、2 mLの滅菌PBSを1 mg EGFに加え、500µg/mL EGF 溶液。アリコート100&マイクロ;20本のチューブに入ったLのEGF。
フィッシャーブランド 6cmシャーレ 透明蓋付き	漁夫	FB0875713A	該当なし
フィッシャーブランドセルリフター	漁夫	08-100-240	該当なし
フィッシャーブランド クラス B 透明ガラスねじ付きバイアル、クロージャー付き	漁夫	03-338B	該当なし
Fisherbrand 使い捨てホウケイ酸ガラスパスツールピペット	漁夫	〒13-678-2D0	該当なし
Fluoromount G スライド封入媒体	VWRの	100241-874	該当なし
Gibco アドバンスド DMEM	ギブコ	12-491-023	該当なし
ヤギ抗E-カドヘリン	R&Dシステム	AF648	1:400希釈(一次抗体)
ヤギ用抗SOX17	R&Dシステム	AF1924	1:500希釈(一次抗体)
HCOパターニング培地	該当なし	該当なし	塩基性腸内培地、100 ng/mL EGFおよび100 ng/mL BMP2。BMP2を調製するときは、1 mLの滅菌4 mM HCl 0.1%BSAをBMP2バイアル(100µアリコート25&マイクロ;4本のチューブに入ったLのBMP4溶液。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
血球計算器	シグマ・アルドリッチ	Z359629	該当なし
ヒト多能性幹細胞(hPSC)	多能性幹細胞施設	該当なし	マトリゲルでコーティングされた24ウェルプレート(Thermo Scientific 73520-906)に細胞を播種しました。
氷冷4%パラホルムアルデヒド溶液(PFA)	該当なし	該当なし	該当なし
氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	該当なし	該当なし	pHは7.4でなければなりません。
ImmEdge 疎水性バリアペン	ベクター研究所	101098-065	該当なし
人工多能性幹細胞(iPSC)	多能性幹細胞施設(シンシナティ小児病院医療センター)	該当なし	他のhESCまたはiPS細胞株を使用することもできますが、プロトコルは細胞株ごとに最適化する必要があります。
ライカミクロトーム	該当なし	該当なし	該当なし
LSM880			共焦点顕微鏡
マトリゲル基底膜マトリックス	コーニング	354234	該当なし
Matrigel hESC認定マトリックス	コーニング	354277	4 x 6ウェルディッシュに十分な希釈マトリゲルを作るのに十分な量に対応する4 xマトリゲルアリコートを準備します。
中後腸誘導培地(RPMI 1640)	コーニング	MT10041CV	非必須アミノ酸 (Corning 11140050)、2% FBS vol/vol (Hyclone SH30070.03T)、3 &M CHIR99021および500 ng / mL FGF4。ベース培地は最大3週間安定ですが、成長因子を添加した直後に使用する必要があります。
中央後腸スフェロイド	該当なし	該当なし	該当なし
MilliporeSigma Steriflip滅菌使い捨て真空フィルターユニット	ミリポアシグマ	SCGP00525	該当なし
マウス抗CDX2	バイオジェネックス	MU392-UCシリーズ	1:300希釈(一次抗体)
マウスアンチFOXA2	アブノヴァ/ノバス	H00003170-M01	1:500希釈
mTeSR1完全増殖培地	幹細胞技術	85870	100 mLのmTeSRサプリメント(85870)を1つの400 mL mTeSR培地(85870)に加え、汚染を避けながら50 mLチューブにアリコートします。4°で保管してください。使用までC。
マレーのクリアソリューション(BABBとも呼ばれます)	マレーズ	該当なし	1:2安息香酸ベンジルとベンジルアルコール。
NOG HIOパターニング培地	該当なし	該当なし	塩基性腸培地、100 ng/mL EGFおよび100 ng/mL NOGGIN(ディスペンス25&マイクロ;250&マイクロのNOGGINのg。l 0.1% BSA を含む滅菌 PBS)。
ヌクレオスピンRNA	タカラ	740955.25	他のRNA単離キットを使用することもできます。
Nunclon delta表面組織培養皿24ウェル(Nunc)	サーモサイエンティフィック	73521-004	該当なし
マトリゲルでコーティングされたNunclon delta表面組織培養皿24ウェル	サーモサイエンティフィック	73521-004	該当なし
Nunclon デルタ表面組織培養皿 6ウェル(Nunc)	サーモサイエンティフィック	73520-906	該当なし
Nunclon delta表面組織培養皿 でコーティングされた6ウェル;マトリゲル。	サーモサイエンティフィック	73520-906	該当なし
HIO、CTRL HIO、およびHCOの成長培地	該当なし	該当なし	塩基性腸培地および100 ng / mL EGF(最終濃度)
リン酸緩衝生理食塩水、0.5% Triton X (PBS-T)	該当なし	該当なし	該当なし
プライマー	インテグレーテッドDNAテクノロジーズ株式会社(IDT)	該当なし	プライマーは、プロトコルの表2にリストされています。
ウサギ用抗CDX2	セル マーク	EPR22764Y	1:100希釈(一次抗体)
ウサギ用抗SATB2	セル マーク	第281話	1:100希釈(一次抗体)
組換えヒトBMP-4タンパク質	R&Dシステム	314-BP-010	凍結乾燥粉末を100µで再構成します。0.1% ウシ血清アルブミン (BSA) を含む滅菌 4 mM HCl 中の g/mL。4.17 mL HCl 溶液を 45.83 mL 分子水に加え、合計 50 mL の 1 M HCl に加えます。次に、200 & micro を追加します。L の 1 M HCl から 49.8 mL の分子グレードの水、合計 50 mL の 4 mM HCl に相当します。次に、50 mLの4 mM HClに0.05 g BSAを加え、ろ過して滅菌します。滅菌4 mM HCl 0.1%BSAを33マイクロ遠心チューブに分注し、-20°Cで保存します。100&μmを追加します。l の滅菌 4 mM HCl 0.1% BSA を BMP4 バイアル (10 & micro;g)100µでBMP4溶液を作る。g/mLです。
組換えヒトFGF-4タンパク質	R&Dシステム	235-F4-01M	100µで再構成します。0.1%ウシ血清アルブミンを含む滅菌PBS中のg / mL。50 mLのPBSに0.05 gのBSAを加えて、0.1%BSAを作ります。フィルター 0.22 & マイクロ;BSAを滅菌するためのM BSA。10 mLの0.1%BSAを5本のチューブにアリコートします。10 mLの滅菌0.1%BSAに1 mgのFGF-4を加えます。アリコート250&マイクロ;Lを予冷した40本の微量遠心チューブに入れ、-80°Cで保存します。
ROCK阻害剤 Y-27632	トクリス	1254	最終濃度は10 mM(10 mmol / L)です。DMSOに10 mMで再懸濁し、フィルター滅菌します。各バイアルに3 mLの滅菌PBSを加えます。アリクアウト 100 & マイクロ;L の ROCK 阻害剤を 30 チューブに入れ、-20 °C で保存します。
SuperScript VILO cDNA合成キット	サーモサイエンティフィック	11-754-250	該当なし
SuperFrost Plus顕微鏡スライド
Tissue Tek OCT コンパウンド	VWRの	25608-930	該当なし