領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

サマリー

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。

要約

ヒト多能性幹細胞由来のアストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学 をin vitroでモデル化するための強力なツールを提供します。多電極アレイ(MEA)記録は、ニューロンの大規模な集団からの電界ポテンシャルを記録し、時間の経過に伴うネットワーク活動を分析するための手段です。脊髄星状細胞の表現型を促進する技術を用いて分化したhiPSC-Aの存在は、hiPSC-Aなしまたはげっ歯類の星状細胞の存在下で培養されたものと比較して、領域特異的な脊髄hiPSC-運動ニューロン(MN)の成熟および電気生理学的活性を改善することが以前に実証されました。ここで説明するのは、脊髄hiPSC-AをhiPSC-MNと共培養し、MEA記録を用いて電気生理学的活性を記録する方法である。ここで説明する分化プロトコルは、脊髄に地域特異的な星状細胞およびニューロンに特異的であるが、共培養プラットフォームは、皮質hiPSC-AおよびhiPSC-Nを含む他の運命に特異的な技術で分化した星状細胞およびニューロンに適用することができる。これらのプロトコルは、グリアとニューロンの相互作用について知らせるための電気生理学的アッセイを提供し、ALSの治療の可能性を秘めた薬物をテストするためのプラットフォームを提供することを目的としています。

概要

ヒト多能性幹細胞由来アストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学をin vitroでモデル化するための強力なツールであり、創薬戦略のトランスレーショナルパラダイムを提供します¹。研究者らは、hiPSC-AとhiPSC-Nの共培養が、両方の細胞タイプの形態学的、分子的、電気生理学的、および薬理学的成熟を促進し、複雑なニューロンネットワークと、in vivo対応物に似た星状細胞-ニューロン相互作用を生成することを実証しました^2,3。同様の共培養実験は、星状細胞を介した神経毒性^4,5やニューロンの過剰興奮性⁶などのALS病理生物学の特徴を再現することができます。さらに、分化プロトコルの進歩により、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、皮質および脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-N ^7,8を含む領域特異的な神経サブタイプに分化することができます。これらの戦略は、ALSにおける皮質および脊髄運動ニューロンの病理、ならびに両方に対する星状細胞の影響をモデル化する可能性を提供します。しかしながら、これには、これらの効果を決定するための再現可能な機能アッセイが存在することが必要である。

最近、多電極アレイ(MEA)記録がニューロン-アストロサイト共培養の電気生理学的特性評価に特に適していることが示されました²。シングルセル電気生理学的分析とは対照的に、これらの高密度電極アレイは、培養条件を破壊したり、細胞膜の完全性を維持したりすることなく、ニューロンの大規模な集団からの細胞外野電位を受動的に記録します。これらのプラットフォームは、経時的および薬理学的操作に応答して培養物の細胞およびネットワーク活性を記録するのに特に有用である。最後に、アストロサイトの存在が培養変数である場合、MEA記録はアストロサイト-ニューロンの双方向相互作用に関する機能的な洞察を提供することができます^2,9。

ここで紹介するのは、以前に検証されたhiPSCを脊髄hiPSC-AおよびhiPSC運動ニューロン(MN)に分化させるための最適化されたプロトコルです²。脊髄hiPSC-A分化プロトコルは一貫して星状細胞培養をもたらし、S100カルシウム結合タンパク質B(S100β)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびホメオボックスB4(HOXB4)に対して陽性であり、それぞれ最大80%、50%、および90%の細胞で陽性であり、成熟グリアおよび脊髄の仕様を示しています^2,10.hiPSC-MN分化プロトコルは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対して>90%陽性のニューロンを生成し、成熟したα運動ニューロンの同一性を示唆しています²。さらに、このプロトコルでは、アストロサイトなしまたはげっ歯類のアストロサイトを使用したニューロン培養と比較した場合、ショール分析および免疫蛍光顕微鏡によって形態学的複雑さが増したニューロンをもたらすことが以前に実証されたhiPSC-A/MN共培養の生成技術について説明しています²。これらの説明は脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-Nに固有ですが、ユニークな利点は、星状細胞とニューロンの最初の独立した培養とそれに続く後の時点での共培養のステップを翻訳して、他の特定の領域および疾患特異的細胞からのニューロン-アストロサイト相互作用の影響を研究できることです^7,8.最後に、プロトコルは、細胞組成および培養条件を操作する能力を有する共培養組成物の因子としての機能的活性を経時的に研究できるように、MEAプレート上でこれらの培養物を増殖させる方法を記載している。

これらのプロトコルの目標は、星状細胞とニューロンの相互作用を調査し、疾患特異的な変化を調べ、ALSの分野で治療の可能性を秘めた薬物をテストするための機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、ビデオの説明が提供されています。

プロトコル

1. 細胞培養培地の調製

1. 表1に記載されている組成物を使用して個々の細胞培養培地を調製します。
2. 500 mLのろ過ボトルに培地を混合して滅菌ろ過し、光から保護して4°Cで最大2週間保管します。

2. 非コンフルエントヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の維持・継代

1. 基底膜マトリックス(-80°Cでアリコートで保存)を2〜8°Cの冷蔵庫で一晩解凍します。
2. 基底膜マトリックスを冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはダルベッコ改変イーグルス培地(DMEM)で1:100(v / v)に希釈します。
3. 組織培養プレートの底部をコーティングするのに十分な基底膜マトリックス(10 cmプレートの場合は5 mL、6ウェルプレートの単一ウェルの場合は2 mL)を追加し、37°Cで最低30分間一晩、または室温で最低1時間インキュベートします。
4. 希釈した基底膜マトリックスを吸引し、プレートをPBSで1回洗浄してから、培地を添加して細胞を播種します。
5. プレートを毎日調べて、いつ継代する準備ができているかを判断し、予測します。hiPSCの継代プレートは、コロニーの大部分が十分に密集し、コロニーの中心に散在する白い領域を表示するようになる。プレートがこの時点を超えて成熟しないようにしてください。それは過剰な分化を引き起こし、細胞の多層化、端部の細長い細胞の過剰、コロニー内の緩いコンパクトさ、または細胞死の増加により、コロニーの中心に黄色の領域が出現します。
6. 通過当日は、プレートの下部外面にマーカーでグリッド線を描き、プレート全体を正確にカバーできるようにします。
7. 200 μLのピペットチップで手動で削り取る位相差顕微鏡(倍率10倍)を使用して、培養フード内の分化したコロニーを剥離します。
8. プレートをPBSで2回すすぎます(10 cmプレートの場合は洗浄あたり5 mL)。
9. 5 mLの予温した組織解離プロテアーゼ(材料表)を加え、コロニーの端が切り上げ始めるまで(4〜7分)、コロニーがプレートから持ち上がる前に、細胞を37°Cでインキュベートします。
10. 解離プロテアーゼを注意深く吸引します。コロニーが外れないように注意しながら、プレートをPBSで2回静かにすすぎます。
11. 5 mL の予め温めた hiPSC 培地(表 1)を培養プレートに加えます。
12. コロニーを持ち上げながら、上から下に前後に動かして5 mLピペットの先端でプレート全体を引っ掻き、小さな細胞凝集体に分解します。
13. プレートを90°回転させ、上記の手順を繰り返します。
14. 5 mLピペットで上下にピペッティングして細胞凝集体を穏やかに粉砕し、細胞凝集体の大部分が約50〜100細胞になるまで顕微鏡で定期的に凝集体のサイズを確認します。
15. 細胞凝集体をプレコーティングされた基底膜マトリックスプレートに播種し、追加のhiPSC培地を使用して元のプレートを洗浄します。ほとんどの細胞凝集体を回収し、5 mLピペットを使用して新しいプレートに移します。
    注:プロトコルが一貫して適用される場合、継代前に元のプレートに培養表面の約50%を覆うiPS細胞コロニーが含まれている必要があります。この場合、分割比率は1枚のプレートから5枚の新しいプレートにする必要があります。 ただし、これは、増殖条件および細胞株特異的増殖速度に応じて調整する必要があるかもしれない。
16. 新しく播種したプレートを前後に振って、骨材を均等に分散させます。
17. プレートをインキュベーター(37°Cおよび5%_CO2)に移し、適切な細胞接着を可能にするために一晩邪魔されないままにします。
18. 10 mLのhiPSC培地で毎日完全な培地交換を行います。継代の翌日に過剰な細胞破片がある場合は、培地交換前に5 mLの培地で1回洗浄してください。
19. iPS細胞コロニーの大部分の中心に白い領域が現れたら、次に通過するように計画します(ステップ2.5)。これは各通過の4〜6日後に起こります。

3. 凍結ハイPSC

1. hiPSC継代の手順2.5〜2.14と同様に初期手順を実行します。
2. 細胞凝集体を15 mLチューブに集め、200 x g で2分間回転させます。
3. 上清を吸引し、ペレットを凍結培地に再懸濁し、5 mLピペットを使用してクライオチューブに移します。
   注:継代ステップと同様に、通常の分割比は、コロニーの密度に応じて、1つのiPSプレートと5つのクライオチューブです。クライオチューブごとに総容量1 mLの凍結培地を使用します。
4. クライオチューブを冷やした凍結保存容器に入れ、一晩-80°Cに移します。
5. 24時間後に細胞を液体窒素に移します。

4. ハイPSCの解凍

1. 10cmのプレートに基底膜マトリックスをコーティングします(2.1〜2.3を参照)。
2. iPSCクライオチューブを液体窒素から取り出し、すぐに37°Cの水浴に最大2分間入れて素早く解凍します。バイアルが部分的に解凍され、液体に囲まれた氷の小片が含まれるまで、バイアルをバスで振ってください。
3. 1000 μLピペットを使用して、細胞凝集体をクライオチューブから15 mLコニカルチューブに移します。予め温めたhiPS細胞培地を最大15 mL加え、凍結培地中のジメチルスルホキシド(DMSO)を希釈します。
4. 15 mLコニカルチューブを200 x g で2分間遠心分離します。
5. 上清を吸引し、5 mLピペットを使用して、20 μMのRho関連コイルドコイル形成タンパク質セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(ROCK-I、化合物Y-27632)を含むhiPSC培地に細胞ペレットを再懸濁し、細胞凝集体のさらなる粉砕を回避します。
6. 細胞凝集体を5 mLピペットを使用して基底膜マトリックスコーティングされた10 cmプレートに移します。
   注:プロトコルが一貫して適用されている場合、1つのクライオチューブ内の細胞を単一の10cmプレートに移すことができます。
7. プレートを振って、骨材を均等に分散させます。
8. プレートをインキュベーターに移し、適切な細胞接着を可能にするために一晩邪魔されないようにします。
9. ROCK-Iを含まない10 mLのhiPS細胞培地で解凍した翌日に完全培地交換を行います。

5. hiPS細胞を脊髄神経前駆細胞(NPC)に分化させる

1. 分化を開始する前に、基底膜マトリックスでコーティングされた6ウェルプレートが使用できる状態であることを確認してください。
2. 解凍後に少なくとも1回、できれば2回継代されたiPSCと、少なくとも4枚の10 cmプレートから始めます(ステップ5.11の説明を参照)。
3. hiPSC継代のステップ2.5〜2.14と同様に初期ステップを実行します。
4. 細胞凝集体を少なくとも2つの10 cmプレートから5mLピペットを使用して15 mLチューブに移します。
5. 200 x g で2分間遠心分離します。
6. 上清を吸引し、10 mLピペットを使用して細胞ペレットを10 mLのhiPSC培地で再懸濁した後、200 x g で2分間遠心分離して、各凝集体の細胞間接着を緩めます。
7. 上清を吸引し、1000 μLピペットを使用して、20 μM ROCK-Iを含む1 mLのhiPSc培地に細胞ペレットを再懸濁します。
8. 1000 μLのピペットで上下にピペットし、細胞凝集体を粉砕します。細胞懸濁液の大部分が単一細胞または<10細胞の小さな凝集体を含むまで、顕微鏡下で凝集体のサイズを定期的にチェックします。
9. 血球計算盤(推奨)または自動セルカウンターで細胞をカウントし、細胞懸濁液中の細胞密度を計算します。
10. プレート3.0 x 10 基底膜マトリックスでプレコートされた6ウェルプレートの各ウェルに⁶ 個の細胞。1000 μLのピペットを使用して細胞懸濁液を移します。
    注:プロトコルが一貫して適用される場合、これは6ウェル/プレートの1つのウェルに対する2つの10cmプレートの比率に相当します。
11. 2つの10 cmプレートの2番目のバッチで手順5.3〜5.10を繰り返し、最終製品を2番目の6ウェルプレートの地下膜マトリックスコーティングウェルにプレートします。1000 μLのピペットを使用して細胞懸濁液を移します。
    注:脊髄NPCプロトコルの理想的な完成には、4つの10cmプレートに等しい2つのウェルが必要です。ワークフローを容易にするために、ステップ5.3〜5.10を2つのプレートの2つのバッチで完了し、それぞれが最終製品である2つの別々の6ウェルプレートであり、それぞれに3.0 x 10⁶ セルを含む1つのウェルがあります。
12. 得られたヒトiPS細胞単層を、コンフルエントが>90%に達するまで、通常は翌日、ただし最初のめっき後3日以内に、20 μM ROCK-Iを含むhiPSC培地に維持し、自発的な(制御されていない)分化を回避します。
13. 細胞プレーティングの翌日に分化を開始できない場合は、細胞をPBSで1回洗浄し、20 μM ROCK-Iを含む新鮮なhiPS細胞培地に毎日培地を交換してください。メッキから3日以内に>90%コンフルエントにならない場合は、セルを廃棄してプロトコルを最初からやり直してください。
14. >90%の合流に達したら、分化を開始します。これは、分化プロトコルのイン ビトロ 1日目(DIV1)です。
15. DIV 1では、20 μM ROCK-Iを含むhiPS細胞培地を廃棄し、PBSで2回すすぎ、幹細胞培地に存在する胎児成長因子(FGF)およびトランスフォーミング成長因子ベータ(TGFβ)を除去します。
16. 培地を、0.2 μMのLDN193189(LDN)および10 μMのSB431542(SB)を添加したWiCell培地(表1)に48時間交換します。
17. DIV 3で、PBSで1回洗浄し、培地をLDN(0.5 μM)+ SB(10 μM)+レチノイン酸(RA; 1μM)を添加したWiCell培地に48時間交換します。
18. DIV 5で、PBSで1回洗浄し、培地をWiCell:神経誘導培地(NIM)ベース(表1)(50%:50%、v / v)にLDN(0.5μM)+ SB(10μM)+ RA(1μM)を添加して48時間交換します。
19. DIV 7 で、ステップ 5.18 と同じ培地で培地交換を行います。
20. DIV 8では、PBSで1回洗浄し、培地をWiCell:NIMベース(50%:50%)にRA(1 μM)+ピューロモルファミン(PMN)(1 μM)+組換えヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)(10 ng / mL)+アスコルビン酸(ASAC)(0.4 μg / mL)を添加して48時間交換します。
21. DIV 10で、PBSで1回洗浄し、手順5.20に記載されているように培地を補充したNIMベース(100%)に48時間交換します。
22. DIV 11または12上に、継代の準備として^25cm2 の滅菌培養フラスコを基底膜マトリックスでコーティングする。
23. 6ウェルプレートlの各ウェルから培地を吸引し、細胞をPBSで1回すすぐ。
24. 2 mLの0.05%トリプシンを各ウェルに加え、37°Cで5〜15分間インキュベートします。プレートを断続的に振とうすると、細胞の剥離に役立つ場合があります。
25. それでも細胞が懸濁していない場合は、1000 μLのピペットチップからNIM培地を円運動で細胞に排出するか(必ず表面全体を覆う)、または細胞スクレーパーでこすることによって機械的に剥離します(好ましくありません)。
26. 細胞を2ウェルから15 mLチューブに移し、5 mLピペットを使用して使用するトリプシンの量に適切な割合でトリプシン阻害剤を追加します。
27. 200 x g で2分間遠心分離し、上清を吸引した後、10 mLピペットを使用して10 mLのNIM塩基で再懸濁します。
28. 200 x g で2分間再度遠心分離し、細胞間接着を緩めます。
29. 2番目の遠心分離ステップの後、上清を取り除き、RA(1 μM)+ PMN(1 μM)+ BDNF(10 ng / mL)+ ASAC(0.4 μg / mL)およびROCK-I(20 μM)を添加した1 mLのNIM培地(100%)でペレットを再懸濁します。1000 μLのピペットチップを使用して、濁った懸濁液が得られるまで細胞を約5回上下に粉砕します。
30. この培地中の凝集体を基底膜マトリックスコーティングされた25cm2滅菌培養フラスコに再播種し、最終結果が6ウェルプレートの2つのウェルから単一の基底膜マトリックスコーティングされた25cm2滅菌培養フラスコへの細胞の組み合わせになるようにする(2:1継代)。1000 μLのピペットを使用して細胞懸濁液を移します。
    注:細胞はDIV 13で>90%コンフルエントである必要があり、14日目までそれ以上の手順は必要ありません。細胞がコンフルエントでない場合は、ROCK-Iをさらに1〜2日間培地に保持します。
31. DIV 14 で、培地を新しい NIM 培地 + RA (1 μM) + PMN (1 μM) + BDNF (10 ng/mL) + ASAC (0.4 μg/mL) に変更します。
32. DIV 15 で、培地を NIM に変更します: RA (1 μM) + PMN (1 μM) + ASAC (0.4 μg/mL) + サプリメント B (50x) + BDNF (10 ng/mL) + グリア細胞株由来神経栄養因子 (GDNF) (10 ng/mL) + インスリン様成長因子 1 (IGF-1) (10 ng/mL) + 毛様体神経栄養因子 (CNTF) (10 ng/mL) を含む神経分化培地 (NDM) ベース (表 1) (50%:50%)。一日おきに新鮮な培地で交換してください。
33. DIV 21では、ステップ5.32のように培地をNDMベース(100%)に交換し、1日おきに新しい培地で交換します。
34. DIV 25-30では、NPCを収集し、それらを凍結するか、終末分化のために10cmプレートに通過させます。
35. T-25フラスコをPBSですすぎ、0.05%トリプシンを加えます。
36. 37°Cで5分間インキュベートします。
37. トリプシンと細胞をNDMベースですすぎ、15 mLコニカルチューブに移します。トリプシン阻害剤を適切な割合でトリプシンに加え、300 x g で5分間遠心分離します。
38. 細胞ペレットを運動ニューロンまたはアストロサイト分化培地(表1)で再懸濁し、1000 μLピペットを使用して上下に粉砕し、単一細胞懸濁液を得ます(通常、最大5回)。
39. 細胞をカウントし、セクション6に記載のようにコーティングされた10cmプレートに移し、分化培地+Rock-Iのいずれかを用いて、hiPSC-MNとhiPSC-Aを分化させた。
40. あるいは、成長因子(ステップ5.32〜5.33のように)および10%DMSOを含む90%NDM培地からなる凍結培地に再懸濁して培養物を凍結し、同様に粉砕してからクライオチューブに移します。クライオチューブあたり6 x 10⁶ NPCを分注します。

6.NPC文化の解凍

1. 細胞を解凍する前日に、10 cmプレートにポリオルニチン(PLO)とラミニンをコーティングします。
   1. PBSまたは蒸留水(dH₂O)で100 μg/mLに希釈した5 mLのPLOをプレートに加えます。37°Cで最低1時間から一晩インキュベートします。
   2. PLO溶液を吸引し、プレートをPBSで3回すすぎます。(PLOは適切に洗浄しないと有毒です。
   3. PBSで希釈したラミニンを10 μg/mLの濃度でPLOコーティングプレートに加えます。37°Cで最低1時間、できれば一晩インキュベートします。インキュベーション後、リンスせずにラミニン溶液を吸引して細胞接着を強化します。
      注:プレートは事前にPLOでコーティングし、水で3回洗浄し、滅菌フードで乾燥させ、4°Cで保存できます。
2. 10 cm細胞培養プレートごとに6 x 10⁶ 細胞/バイアルを含む1つのNPCバイアル(すなわち、DIV 25または30)を解凍します。
3. NPCクライオチューブを液体窒素から取り出し、すぐに37°Cの水浴に最大2分間入れます。液体に囲まれた小さな氷片ができるまでバイアルを振ってすばやく解凍します。
4. 1000 μLのピペットを使用して細胞凝集体を15 mLの円錐形に移し、予熱したNDMまたはダルベッコの改変イーグルス培地(DMEM)/ハムのF21 F12サプリメントを最大15 mL加えてDMSOを希釈します。
5. 300 x g で5分間遠心分離します。
6. 上清を吸引し、アストロサイトまたはMN分化培地(表1)+ ROCK-I(20 μM)のいずれかで細胞ペレットを再懸濁し、1000 μLピペットを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで上下に粉砕します(最大5回)。
7. シングルセル懸濁液をPLO-ラミニンコーティングされた10cmプレートに移します。
8. プレートをインキュベーターに移し、適切な細胞接着を可能にするために一晩邪魔されないままにします。

7.脊髄NPCを運動ニューロンに分化させる

1. 手順6.1〜6.8で説明したように最初の手順を実行し、最終培地はMN分化培地+ ROCK-I(20 μM)です。
2. プレーティングの翌日、ROCK-Iを含まないMN分化培地と培地の完全な交換を行い、その後1日おきに培地を交換します。週末には、金曜日に細胞に餌を与え、次に月曜日に再び細胞に餌を与えます。細胞の破片を除去するために、必要に応じてPBSで細胞をすすぎます。
3. MN分化培地+シトシンアラビノシド(ARA-C)(0.02 μM)で培地を交換し、グリアコミット前駆細胞が細胞クラスターに凝集した後の有糸分裂後のMN前駆細胞の下で単一の増殖扁平細胞として出現したら48時間インキュベートします。
   注:通常、これは最初のプレーティング後の最初の7日以内に発生しますが、細胞株によっては変動する場合があります。
4. 48時間後、ARA-Cを含む培地を吸引し、培養物をPBSで3回穏やかにすすぎ、培地をARA-Cを含まない新鮮なMN培地に交換した。
5. ARA-Cによる治療後、ニューロンクラスターの早期剥離を防ぐために、真空吸引器ではなく手動ピペットで古い培地を除去することにより、隔日(または月曜日、水曜日、金曜日)に培地交換を行います。さらに、MN培地にラミニン1 μg/mLを週に1回濃縮して、培養プレートへの神経細胞の付着をさらに高めます。

8. NPCを脊髄アストロサイトへの分化

1. セクション6と同様に、アストロサイト分化培地(表1)を使用し、体積濃度1%(NS + 1%FBS)のウシ胎児血清(FBS)とプレーティング用のROCK-I(20 μM)を添加して、NPC培養液を解凍します。
   注:市販の血清代替物(表1)は、同じ希釈係数を使用してFBSの代わりに使用できます。
2. プレーティングの翌日に、ROCK阻害剤を含まないNS+1%FBS培地で培養液を交換し、その後1日おきに培地を交換してください。週末には、金曜日に細胞に餌を与え、次に月曜日に再び細胞を給餌します。細胞の破片を除去するために、必要に応じてPBSで細胞をすすぎます。細胞が死滅し続ける場合は、細胞の生存を促進するためにROCK-I(10 μM)を培地に補給します。不死化細胞を選択する可能性があるため、ROCK-Iを頻繁に使用したり、長すぎたりしないように注意してください。
3. 継代する前に、星状細胞がコンフルエントになるのを待ちます。
   注:セルサイズは時間の経過とともに増加するため、通過する数は設定されていません。典型的な継代比は1:2または1:3です。生存率が低い場合、またはプレートが多すぎる場合は、2つ(または必要に応じて複数)の10 cmプレートを1つの10 cmプレートに組み合わせて、コンフルエントを維持します。
4. アストロサイト前駆細胞培養物を継代するには、プレートをPBSで1回洗浄し(FBSを除去するため)、0.05%トリプシンで5分間インキュベートし、NS培地+ 1%FBS(FBSはトリプシンを不活性化します)で細胞を収集し、300 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞をNS培地+ 1%FBSに再懸濁した後、単一細胞懸濁液に粉砕します。NS + 1% FBSの細胞を新しい10 cmプレートに分配します。
   注:アストロサイト培養の拡大に加えて、プレートの繰り返し継代は、ニューロンの運命を選択した残りの前駆細胞を殺す目的を果たします。したがって、有糸分裂率がそれほど高くなくても、ニューロン汚染があると思われる場合は、プレートを1:1の比率で継代することができます。
5. 以下のように、差別化の過程でコーティングを変更し、歩留まりを向上させます。
   1. 最初に解凍したNPC培養物と最初のプレーティング後の最初の継代をPLO /ラミニンにプレートします。
   2. 未熟な星状細胞を基底膜マトリックスコーティングプレートにプレートします。
   3. より成熟した星状細胞(すなわち、90日目以降)を基底膜マトリックス、PLO /ラミニンコーティングプレート(通常はニューロンとの共培養用)、またはコーティングされていないプレートのいずれかにプレートします。
6. 60日間の成熟期間の任意の時点で星状細胞の前駆細胞を凍結して、培養を同期させたり、後の実験のために保存したりします。NPC段階を超えて解凍する場合は、アストロサイト前駆細胞をPLO/ラミニンではなく基底膜マトリックスコーティングプレートに解凍します。
7. DIV 90以降で、培地をNS + 1%FBSからNS + 5%FBSに切り替えて、星状細胞の生存を促進し、増殖を減少させます。

9. 多電極アレイプレートにおけるMNと脊髄アストロサイトの共培養

1. 運動ニューロンとアストロサイトを同じ日に使用する準備ができたら、運動ニューロンの場合はDIV 60、アストロサイトの場合はDIV 90に老化させたら、区別してプレートします。
2. 24ウェルプラスチックプレートで作業する場合は、次のようにメッキの前日または当日にMEAプレートをコーティングします(材料表)。
3. PLOを水またはPBSで100 μg / mLに希釈します。
   1. 各ウェルに15〜20 μLを加え(ピペットの快適性レベルによって異なります)、ウェルの中央に電極の領域とその周辺領域をカバーする液滴を形成しますが、ウェル全体はカバーしません。
   2. ピペットチップで電極を傷つけないように注意してください。各ウェルで同じ表面積を確実にカバーするために、ウェル間の体積と一貫性を持たせてください。
   3. PLOを37°Cで最低1時間(できれば2時間)インキュベートします。
      注意: プレートに十分な湿度がない場合、少量は乾燥します。井戸を囲むコンパートメントに水を追加して、コーティングと記録の過程で十分な湿度を確保します。
4. プラスチック製のマイクロピペットチップを使用して、できるだけ多くのPLOを吸引します。電極に触れないように注意してください。250μLの水で3回洗浄します。洗浄に真空アスピレーターを使用する場合は、チップを電極アレイに近づけないでください。3回目の洗浄後、必要に応じてピペットチップを使用して、できるだけ多くの水を取り除きます。蓋を外した状態で、細胞培養フードの下で表面を乾燥させます。
5. プレート表面が乾いたら、PBSで10 μg/mLに希釈したラミニンを加えます。各電極アレイをカバーするために15〜20μLを使用してください。湿度コンパートメントに水を加え、蓋を元に戻し、プレートを37°Cのインキュベーションに戻し、最低2時間から一晩インキュベートします。
6. プレーティング当日、MNおよびアストロサイト培養物をPBSで1回すすぎ、トリプシン0.05%を37°Cで添加して細胞を持ち上げます(5分間)。トリプシン阻害剤を含む15 mLのコニカルチューブに集め、プレートを培地またはベースで洗浄して、すべての細胞を確実に収集します。300 x g で5分間遠心分離し、1000 μLピペットで再懸濁して、1 mLの単一細胞懸濁液を生成します。MNおよびアストロサイトを再懸濁する場合は、20 μM ROCK-Iを添加した共培養培地(表1)に切り替えます。
7. 血球計算盤を用いてMNとアストロサイトを並行してカウントする。カウントと計算を行いながら、セル懸濁液をキャップし、4°Cの発泡スチロールラックに入れます。
8. 運動ニューロンの場合は5 μLあたり5 x 10 4細胞、星状細胞の場合は5 μLあたり2.5 x 10⁴細胞の濃度に培養物を再懸濁するのに必要な量を計算します。1 mL 細胞懸濁液を 300 x g で 5 分間遠心分離し、計算された容量で再懸濁します。
9. 播種するウェルの数を計算し、それに各細胞懸濁液の5 μLを掛けます。必要な量のニューロンとアストロサイト懸濁液を1:1の比率で組み合わせ、完全に結合するまで(通常は2回)ピペッティングで混合しますが、攻撃的になりすぎないようにしてください。
10. ピペットチップを使用してMEAプレートの各ウェルからラミニンを除去します。10 μLの最終結合細胞懸濁液を各ウェルに移し、電極アレイを覆う小さな液滴を形成して、ウェルあたり5 x 10 4 MNおよび2.5 x 10⁴アストロサイトの細胞密度を提供します。
    注:複合懸濁液中の細胞密度が高い場合は、正確で一貫した細胞数を確保するために、播種ステップ中にウェル間で頻繁に再懸濁する必要があります。
11. プレートをインキュベーターに20〜30分間戻します。細胞液滴を乱さないように注意し、細胞がプレート上に最初の付着物を形成できるようにします。
12. 20〜30分後、各ウェルの壁に250 μLをピペッティングし、次に反対側の同じウェルの壁にさらに250 μLをピペッティングして、温かい共培養培地+ ROCK-Iを各ウェルに追加します。プレートをインキュベーターに戻します。
13. 播種の翌日(共培養1日目)にプレートを調べます。著しい細胞破片または死細胞がある場合は、ROCK-Iを含む新しい共培養培地と培地を交換してください。それ以外の場合は、播種後2日目(共培養2日目)の培地をROCK-Iを含まない共培養培地に変更します。週に2回、ハーフミディアム交換(50%を吸引し、蒸発を考慮して最終量の60%を追加する)を実行します。
14. 単一ウェル30 mmガラスプレート(材料表)を備えたMEAシステムを使用する場合、プレートの準備には2日以上かかる場合があります。これを行うには、以下の手順に従います。
15. 以前のMEA培養物から細胞と細胞破片を0.05%トリプシンで5〜15分間持ち上げます。
16. トリプシンを吸引し、水で3回すすいでください。
17. 70%エタノールを加えて滅菌し、フード内で10分間インキュベートします。エタノールを吸引し、水で3回すすいでください。
18. プロテアーゼ酵素を含む1%陰イオン界面活性剤を水に塗布します。プレートを蓋で覆い、熱可塑性フィルムとアルミホイルで包み、ロッカーに室温で一晩放置します。
19. 洗剤を吸引してから、水で3回すすいでください。
20. プレートを保管する場合は、十分な量の水を追加してください。プレートを蓋で覆い、熱可塑性フィルムとアルミホイルで包み、次の使用まで冷蔵庫に置いておきます。
21. コーティングする場合は、細胞培養フードの下で表面を乾燥させます。
22. 追加の滅菌が必要な場合(以前の感染や最近以外の使用など)、この時点でのみ、MEAプレートをフードの下で紫外線(UV)に30〜60分間さらします。
    注意: 頻繁なUV光を避けると、電極の損傷を防ぐことができます。プレートに血清があるときにUV光を使用すると、電極が機能しなくなるため、洗浄したプレートにのみ使用する必要があります。
23. プレートが完全に乾いたら、プラズマ洗浄を1分間進めて、MEAプレートのガラス表面を充電し、コーティング効果を高めます。プラズマ洗浄は、MEAプレート洗浄-めっきサイクルの4〜5サイクルごとに少なくとも1回行います。
    1. 別の方法として、プラズマ洗浄が不可能または保証されない場合は、MEAプレートの表面を覆うのに十分な量のFBS含有培地を追加し、一晩インキュベーターに戻します。
24. 上記のセクション6で説明したようにPLO /ラミニンコーティングを使用してください。プラズマ洗浄または吸引直後にPLO溶液(PBS溶液100 μg)を加え、FBS含有培地を洗い流します。
25. 上記のように細胞を次の密度でプレートします:1 x 10 5 hiPSC-A /プレートおよび5 x 10⁵ hiPSC-MN /プレート。

10. 多電極アレイ記録

1. 200 Hzのハイパスフィルタと3 kHzのローパスフィルタを備えたバターワースフィルタを使用して、12.5 kHzのサンプリング周波数で生の電圧データを抽出します。スパイク認識を、ベースラインから≥6標準偏差の電圧の瞬間的な時点として設定します。バーストを、100 ミリ秒で >5 スパイクのアクティビティとして識別します。アクティブな電極全体の35%以上が100ミリ秒以内に発火し、ネットワークバーストごとに最低50スパイクが発生した場合のネットワークアクティビティを定義します。
2. コカルチャー(CC)1日目からできるだけ早く録音を開始してください。
   注意: 電気的活動は、CC3日目の前にめったに記録されません。
3. 同様の密度でプレート並行培養を行い、生化学的アッセイ、免疫細胞化学(ICC)、またはqPCR用の適切な培養プレートまたはカバーガラスで複製します。
4. 温度を37°C、5%の広告_CO2 に設定して録音を実行します。プレートを機械に移し、記録する前に少なくとも5分間平衡化させます。
5. ベースラインアクティビティを隔日または毎週、実験デザインに応じて1〜15分以上記録します。メディア交換後、少なくとも1時間は録画せず、理想的にはメディア交換のたびに24時間待ちます。
6. 汚染を防ぐために、滅菌プレートの蓋を滅菌フードの外側で開く必要がある記録(つまり、薬物化合物の塗布)の後に培地を交換します(つまり、ステップ9.14のように半分の培地交換)。プレートが薬物治療を超えて使用され続ける場合は、完全な培地交換と洗浄を実行して薬物を洗い流します。
7. 分析の目的で、各条件に対して少なくとも3つの技術的および生物学的反復を使用します。電気生理学的データをn≥3回の反復の手段として表す。

11. 多電極アレイの薬理学的アッセイ

1. 実験の質問に応じて、ALSニューロンとコントロールアストロサイト、コントロールニューロンとALSアストロサイト、ALSニューロンとアストロサイト、コントロールニューロンとアストロサイトなど、異なる共培養の組み合わせを使用します。
2. ニューロンまたはアストロサイトのいずれかを標的とする化合物の一時的な電気生理学的効果を調べる場合は、プレートの蓋を外し、機械の蓋を閉じた状態で、ベースラインアクティビティを最低1分間記録します。
3. 電気生理学的記録を停止せずに手動で機械の蓋を開き、複数のウェルを処理する場合はマルチチャンネルピペットを使用して25 μLの培地を適切な薬剤ビヒクル(通常は新鮮な培地)と交換します。蓋を手動で閉めます。
4. さらに1分間記録します(または、培養を回復する必要がある重大な車両誘発性の変化がある場合はそれ以上)。
5. 手動で蓋を再度開き、25 μLの培地を同じビヒクル内の目的の薬剤と交換します。マシンの蓋を閉じて、録音を続行します。
   注:記録期間と投与された薬物/ビヒクルの量は、実験の質問に応じて異なるか、最適化する必要があります。.
6. 分析目的で、車両の追加が電気生理学的パラメータの有意な変化を引き起こさないことを確認してください。ビヒクル添加後と比較した薬物投与後の活動の変化率を計算し、条件間で比較します。
7. 候補疾患修飾薬などの縦断的電気生理学的効果を調査するために、ステップ11.2で概説したベースライン活性を記録する。このためには、適切なビヒクルに目的の薬物を含む共培養培地を使用するか、ビヒクルのみを含む培地を使用します。
8. 分析の目的で、薬物で縦断的に処理されたALSまたは対照共培養からの時点記録を互いに比較し、条件を対照します。

結果

hiPSC-MNおよび脊髄hiPSC-Aを生成するための脊髄パターニングプロトコルを 図1に概説します。このプロトコルでは、hiPS細胞は非コンフルエントなコロニーとして維持され、継代されます(図2A)。神経新生は、LDN193189およびSB431542の添加による二重SMAD阻害によって開始され(神経誘導)、それぞれ骨形成タンパク質(BMP)およびトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)経路を不活性化する。このステップでは、単層ベースの方法が使用され、hiPSCを付着性マトリックス、つまり基底膜マトリックス上に播種して、神経上皮様の2D培養を生成します。形態学的には、神経誘導は、大きな核と丸い形状のiPS細胞から、大きな細胞質と円筒形のしっかりと圧縮された神経上皮(幹)細胞への移行によって特徴付けられます。これらの細胞は水平方向と垂直方向に分裂し、多層上皮を生成します(図2B、i)。

ディスカッション

今日まで、星状細胞とニューロンの共培養の電気生理学的記録のためのhiPSCおよびMEAベースの方法は、てんかん⁹のin vitroモデリングのためのより広範な使用とは対照的に、ALS⁶の分野では限られた用途であり、完全なヒトプラットフォームではまだ適用されていません。しかし、このプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズム、神経毒性への星状細胞の寄与、または疾患の進行におけるネットワーク活動の役割など、ALS研究における病態生理学的に関連する質問に対処する可能性を秘めています。さらに、このプラットフォームは、in vitroで9か月以上にわたって将来の電気生理学的データを収集できるため、治療の可能性を秘めた化合物を試験するためのアプローチを提供します²。

文献に見られるhiPSC-NおよびhiPSC-Aの生成プロトコルは、培地条件、培養のタイミング、収量、成熟プロファイルなどの要因に関して大きく異...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm 滅菌培養プレート	ファルコン	353003
25 cm2 滅菌培養フラスコ	ファルコン	353136
2-メルカプトエタノール (β-ME)	サーモフィッシャー	21985023	作業濃度 110 & マイクロ;M
500 mL 0.2 µm CA フィルターシステム	コーニング	430769
5 mL ピペット	ファルコン	357543
6 ウェル滅菌培養プレート	ファルコン	3046
アムホテリシン B	ギブコ	15290018	作業濃度 2.0 μg/mL
陰イオン性界面活性剤 プロテアーゼ酵素 - Terg-A-Zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	使用濃度 1% m/v
アスコルビン酸 (ASAC)	Sigma	A4403	100 mg を 250 mL の dH2O に溶解して、0.4mg/ml ストックを得ます。0.22 µmフィルター、分注し、-80°Cで凍結します。1:1000で希釈して使用します。(作業濃度0.4&マイクロ;g/mL)です。
アクシオン CytoView MEA 24 プレート (M384-tMEA-24W)	アクシオン	OPT-24
アクシオン エッジ MEA プラットフォーム	アクシオン	マエストロ エッジ
ベースメント メンブレン マトリックス - マトリゲル	コーニング	354277	プロトコルの詳細
卓上顕微鏡 (細胞培養フードの下で滅菌)	ツァイス	415510-1100-000	プリモ バート
バイキュクリン	シグマ アルドリッチ	14340	作業濃度10 μM
毛様体神経栄養因子 (CNTF)	Peprotech	450-13	100 & micro;gを滅菌PBS1mLに注入し、次いで9mLの滅菌0.1%BSA-PBSを10 µに加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
AirGas/Harris	9296NC		CO2 タンクとレギュレータ
			2.0387 mLのDMSOにgを入れて、250 µM株。-80°Cでアリコートして凍結し、1:2000に希釈して使用します。(作業濃度125 nM)。
シアンキサリン (CNQXの)	シグマ アルドリッチ	C239	作業濃度 50 μM
ジヒドロカイニン酸 (DHK)	Tocris	111	使用濃度 50 μM および 300 μM
DMEM/F12	サーモフィッシャー	113300	使用濃度 1x
エッセンシャル 8 培地 + エッセンシャル 8 サプリメント	サーモフィッシャー	A1517001	10 mL のエッセンシャル 8 (10x)   サプリメントと 500 mL のエッセンシャル 8 成長培地 (1x)
ウシ胎児血清 (FBS)	サーモフィッシャー	16140071	使用濃度 1x
グリア細胞株由来神経栄養 (GDNF)	Peprotech	450-10	ディゾルブ 100 & マイクロ;1mLのPBS中のgを100μ未満;g/mL に添加し、9 mL の滅菌 0.1% BSA-PBS を 10 µ に加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
血球計算盤	Election Microscopy Sciences	63510-20
Heparin	Millipore-sigma	H3149-100KU	PBS100 mLに200 mgを溶解して、2 mg/mLのストック溶液を得ます。15 mLと500 µのストックを分注します。Lチューブ。1:1000に希釈して使用します。(作業濃度2 & マイクロ;g/mL)です。
湿度制御された細胞培養インキュベータ	ーThermoFisher	370	37 ºに設定。C, 5 % CO2
インスリン様成長因子 1 (IGF-1)	R&Dシステム	291-G1-200	ディゾルブ200µgを2mLのPBSから100µに。g/mL に添加し、18 mL の 0.1% BSA-PBS を加えて 10 µ にします。g/mL ストックし、-80°Cで保存し、アリコートして-80°Cで凍結し、10°Cを希釈します。1:1000で使用するためのg / mLストック。(使用濃度10 ng / mL)。
Kainc acid	Abcam	ab144490	使用濃度 5 μM
ノックアウト血清交換 (KSR)	サーモフィッシャー	10828	使用濃度 1x
ラミニン	サーモフィッシャー	23017-015	原液 1 mg/mL、使用濃度 10 & マイクロ;g / mL(コーティング)、1&マイクロ;g/mL (細胞培地)
LDN193189	Stemgent	04-0074	2 mg の LDN を 500 µ10 mMストックを得るためのクロロホルムのL。これをアリコートし、-80°Cで凍結します。使用するには、まずストックを1〜10でDMSO[1 mM]に希釈し、次に1 mMの1:5000を目的の培地に希釈して0.2 & microにします。Mワーキングソリューション
L-グルタミン	サーモフィッシャー	25030	使用濃度 100x
MEAガラスプレート	マルチチャンネルシステム	60MEA200/30iR-Ti-gr
マルチチャンネルピペット P200	ギルソン	PJ22224
ニューロベース	サーモフィッシャー	21103049	使用濃度 1x
非必須アミノ酸 (NEAA)	サーモフィッシャー	11140050	使用濃度 100x
ペンシルリン/ストレプトマイシン	サーモフィッシャー	15140122	使用濃度 100x
ポリオルニチン (PLO)	Sigma-Aldrich	P3655	100 mg を ddW 1 mL に溶解して、100 mg/mL のストック溶液を得ます。100µで在庫を分注します。Lチューブ。(作業濃度100&マイクロ;g/mL)
塩化カリウム (KCl)	NA	NA	使用濃度100 mM
プルモルファミン (PMN)	ミリポアシグマ	540223	5 mg を 9.6 mL の DMSO に溶解して 1 mM 溶液を得る。-80°Cでアリコートして凍結し、1:1000に希釈して使用します。(作業濃度1 & マイクロ;M)。
組換えヒト脳由来神経栄養因子(BDNF)	Peprotech	450-02	再構成前に短時間遠心分離します。100 & micro を溶解します。1mLのPBSにgを100μに;g/mL に添加し、9 mL の滅菌 0.1% BSA-PBS を 10 µ に加えます。g/mLです。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(使用濃度10 ng / mL)。
レチノイン酸(RA)	Sigma	R2625	100 mgを3.3 mLのDMSOに溶解して、100 mMのストック溶液を得ます。在庫100µをアリコートします。L /チューブで-80°Cで凍結します。200 & マイクロを取ります。100 mMストックをL化し、10倍に希釈(DMSO1.8 mLを添加)して10 mMストックを調製します。アリコート50 & マイクロ;L /チューブ -80°Cで保管し、1:10000で希釈して使用します。(作業濃度2 & マイクロ;M)。
ROCK-I nhibitor	Peprotech	1293823	5 mg を 1480 & micro に溶解します。10 mMのストックを得るためにdH2OのL、アリコートして-80°Cで凍結します。(作業濃度20&マイクロ;M)。
SB431542	Sigma	S4317	5mgを1.3mLのDMSOに溶解して、10 mMのストック溶液を得ます。-80°Cで希釈して凍結し、1:1000で希釈して使用します。(ワーキングコン10&マイクロ;M)
無菌細胞培養フード	ベイカー社	SG-600
サプリメント B - B27 サプリメント	サーモフィッシャー	21985023	使用濃度 50倍
サプリメント N - N2 サプリメント	サーモフィッシャー	17502048	使用濃度 100倍
テーブルトップ細胞培養遠心分離機	サーモフィッシャー	75004261	ソーバル レジェンド X1R
熱可塑性プラスチック フィルム - Parafilm	PARAFILM	P7793
組織解離プロテアーゼ - Dispase	StemCell Technologies	7923	作業濃度 1x
トリプシン阻害剤	Σ	T6522-1G	1g 1g 100mL ddH2O に溶解して 10mg/mL ストックを得る。アリコートして4°Cで保存し、トリプシンの量を1:10に希釈して使用します。(使用濃度1mg / mL)。
トリプシン-EDTA(0.05%)	サーモフィッシャー	2530054	作業濃度1x
ウォーターバス	サーモフィ	ッシャー2332	アイソテンプ