方法論記事

無細胞システムを用いたタンパク質プロトタイピングのための、最小の線形テンプレートの増幅のための迅速で酵素的な方法

DOI：

10.3791/62728

⸱

2021年6月14日

 , 
1Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、クローニングや生きている細胞を使用せずに、合成遺伝子断片からタンパク質スクリーニングキャンペーンのための大量(μg-mg)量のDNAを作成するためのプロトコルを記述しています。最小のテンプレートは酵素的に消化され、円形化され、等熱転がり円増幅を使用して増幅される。無細胞発現反応は、非精製物で行うことができる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、最小DNAテンプレートの設計と酵素増幅のステップを説明し、無細胞発現を用いて24時間未満でアッセイ可能タンパク質の迅速なプロトタイピングを可能にする。ベンダーからDNAを受け取った後、遺伝子断片はPCR増幅、切断、円形化、およびクライオバンクされる。少量のバンクDNAは、等温転環増幅(RCA)を使用して、希釈され、有意に増幅されます(最大106x)。RCAは、出発物質のピコグラムレベル(すべての開始合成フラグメントが使用されている場合はmgレベル)から最小発現テンプレートのマイクログラム量を得ることができます。この作業では、20 pgの開始量は最終製品の4 μgをもたらしました。得られたRCA製品(最小鋳型の連結物)を、精製工程なしで無細胞反応に直接添加することができる。この方法は完全にPCRベースであるため、自動液体処理システムと組み合わせることで、将来のハイスループットスクリーニングの取り組みが可能になる可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

無細胞遺伝子発現(CFE)は、多くの用途を備えた強力なツールとして登場しました。このような用途には、疾患検出1、2、3、4、5、6、微量栄養素および小分子検出7、8、9、10、11、12、バイオマニュファクチャリング13、14、15、16、17が含まれます。 ,18, 教育19,20,21, 製造難しいタンパク質17,22,23,24,25,26,27, およびバリアントスクリーニング23,28,29,30,32 、33.これは、無細胞システムの開放性と柔軟性が与えるためです。多くの偉大なレビュー記事は、技術上の歴史的教育と将来の展望を提供しています34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44.

典型的な無細胞反応は、細胞抽出物、エネルギーミックス、および遺伝的テンプレートの3つの主要な成分で構成されています。アクティブセル抽出物には、転写と翻訳(TXTL)に必要なすべての機械が含まれ、さまざまな方法で処理することができます36.解糖性中間体、電解質、アミノ酸、およびエネルギーミックスの補因子は、TXTLプロセスをサポートします。これは、無細胞実験45における変動の主要な源であり、多くの方法で34、46を調製することができる。遺伝的テンプレートの調製は、従来のクローニング法が優れた発現特性を有するプラスミドをもたらすため、改善が少なくなっています。これらの伝統的な方法の欠点は、それらを構築し、伝播するために必要な生物学的専門知識のターンアラウンドタイムと量です。最近の最適化の取り組みにより、エネルギーミックス調製49,50と並行して行うことができる細胞抽出製剤47,48の簡単な24時間のワークフローが生まれている。ただし、従来のクローニングは CFE プロトタイピングのタイムラインに複数の日を追加します (表 1)23.市販遺伝子断片から迅速に増幅されたPCR産物は直接51を使用できますが、約5つの反応(従来の15μL量)に相当するDNAの1μgしか生成されていないため、試作実験の数が制限されます。これらの追加の循環化と等温増幅のステップにより、DNAのミリグラム量より大きい(1mgの5,000反応以上)が可能です。これは、タンパク質または組み合わせ酵素ネットワーク(無細胞代謝工学)のハイスループットスクリーニングで行うことができるテストの数を劇的に増加させます。また、高濃度DNAとして線形テンプレートライブラリを効果的に保存することができます。さらに、材料科学の用途(タンパク質ベースの繊維およびヒドロゲル)に必要な大量のタンパク質を試作するために、テンプレートの量を増やす必要があります。線形テンプレートのいくつかの制限は、BL21 DE3 Starからの抽出物を使用するか、最近発見された方法を使用して、リニアテンプレートを劣化52、53、54から保護することで克服できます。しかし、これは、PCR増幅のためのベンダー製DNAの在庫が限られているか、クローン作成に必要な生物学的専門知識と機器の問題を持つことに対処していません。

この研究は、少量のベンダー生産遺伝子断片(通常は500〜1000ngの凍結乾燥粉末)から得ることができる発現テンプレートの量を増やすために明示的に設計されたプロトコルを提示する。記載された方法は、プラスミドでの伝統的なクローニングを行ったり、生きている細胞での変換および伝播を行うために必要なスキルを必要としない。メールで遺伝子断片を受信すると、ユーザは等温転環増幅(RCA)を採用することにより、多くの無細胞反応のための十分なテンプレートを生成することができる(図1)23。ベンダーから受け取ったDNAの量は限られたスクリーニング努力に十分かもしれませんが、すぐに枯渇し、遺伝子断片の再購入には時間とコストがかかります。この方法は、特に毒性があり、大腸菌でクローンを作成することが困難な遺伝子に適しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 遺伝子断片の設計

注:遺伝子断片は、プロモーター、リボソーム結合部位(RBS)、開始コドン、目的遺伝子、ターミネーターを含む、転写/翻訳に必要なすべての遺伝的要素を有するべきである。ターミネータは線形式テンプレート (LET) には必要ありませんが、ユーザーが配列をプラスミドに挿入することを決定した場合は重要です。これらの配列は、T7プロモーターを使用するpJL1-sfGFPプラスミド55( マイケル・ジュエットの研究室からの贈り物)から持ち上げられた。これらの必要な遺伝的要素に加えて、制限酵素カット部位は、プロモーター(5'カット部位)の前に6塩基対を追加し、ターミネーター(3'カット部位)後に別の6塩基対を追加し、この場合、HindIII(他の制限酵素を使用することができるが、ライブラリに保持するために必要な数を減らすために1つの高忠実度制限酵素で配列を標準化することは有用である)。プライマーサイトは、5'カットサイトの上流に10塩基対を追加し、この場合は標準化されたM13プライマーシーケンスを使用して3'カット部位の下流に10基対を追加します(プライマーは安価なストックアイテムです)。制限酵素部位および使用するプライマーは、ユーザの裁量で行われる。ただし、ユーザーは、シーケンスがテンプレート内の他の場所に存在しないことを確認する必要があります(不要なカットや増幅開始部位を作成したくない)。この作業で使用されるテンプレートの順序は、補足資料で詳述されています。これらの手順は、この基本テンプレートから変更するために使用されます。

  1. 発現する望ましい遺伝子を決定し、 大腸菌で発現された場合はアミノ酸配列または遺伝的配列を得る。
  2. アミノ酸配列の場合は、多くの標準的なベンダーツール56の1つを使用して大腸菌のコドン最適化を行う。サプリメントで提供されるテンプレートを使用する場合, 最適化されたシーケンスは、ヒンド III 制限サイト (AAGCTT) がないことを確認します。その場合は、HindIII サイトがなくなるまでシーケンスの最適化を続けます。
  3. シーケンスをコピーし、目的の遺伝子が示されている 補足シーケンス#1 の提供されたテンプレートに貼り付けます。sfGFP を表現する場合は、 補足シーケンス #1 を使用します。サチリシンを発現する場合は、 補助シーケンス#2 を使用します。
  4. 最小のテンプレートと必要なプライマーを好ましいDNA合成サービスから注文します。

2. 遺伝子断片とプライマーの再懸濁

注:遺伝子断片を受け取った後、再懸濁液のためのメーカーのプロトコルに従うか、DNAストックを作成するには、この簡単なガイドを使用してください。

  1. チューブを遠心分離(5sの場合は300 x g)、 底部にDNAペレットを集める。
  2. 二重蒸留水(ddH2O)を加え、DNAテンプレートの最終濃度を10 ng/μLにします。
  3. 5~10sの中の設定で溶液をボルテックスする。
  4. 50°Cで20分間インキュベートしてペレット全体を溶解します。
  5. 再び簡単に渦
  6. チューブの底部に溶液を収集するために5 sのための300 x g で遠心分離機。
  7. -20 °Cで保存するか、PCRで使用してください。
  8. プライマーをヌクレアーゼフリー水に再懸濁して、100 μMプライマーストックを準備します。添加する水の量を決定するには、凍結乾燥したプライマーのナノモルの数に10を掛けます。例えば、チューブに45 nMの凍結乾燥プライマーが含まれている場合、450 μLのddH2Oを加え、溶液を渦液に加えます。
  9. プライマーストック溶液を-20°Cで保管するか、増幅を継続します。

3. PCRによる遺伝子断片の増幅

注: 目的の遺伝子に適した PCR キットを決定します。より小さい遺伝子(<1,000 kb)は安価なTaqポリメラーゼに対してより適しているかもしれませんが、より大きな遺伝子(≥1,000 kb)はエラーを減らすために高忠実度ポリメラーゼの恩恵を受けるかもしれません。ユーザーが初期遺伝子断片の保存に関心がない場合、この初期PCR増幅は必要ありません(循環化で複数の試みを提供し、LETとRCA製品の比較研究を可能にします)。また、このPCR増幅LETは反応に直接使用できることに注意することも重要です。しかし、導入で述べたように、さらなる増幅ステップが無視された場合にのみ、反応の数に制限があります。消化およびライゲーションは、再懸濁された遺伝子断片57 に対して直接行うことができる(1つが確実であれば、追加の循環化ストックを実行するためにより多くのLETを必要としない)。この場合は、セクション 3 をスキップしてセクション 4 に進みます。PCR を実行するには、次の手順を実行します。

  1. ステップ2.8の100μMストックを使用して、10μMの動作ソリューションを作成します。多くの PCR キット プロトコルでは、プライマーの 10 μM ソリューションが必要です。
  2. サーマルサイクラーをプログラムして、キットメーカーのプロトコルに従って反応を行います。異なるキットは、わずかに変化したサイクリングパラメータを必要とします。 材料表に記載されているキットの場合、条件は初期変性の30 sのための94 °Cです。変性の30 sのための94°Cの30サイクル、プライマーアニーリングの30 sのための45°C、および拡張の60 sのための68°C;5分間68°Cで最終延長。そして最後に、10°Cの無期限保持。
    1. 正しい伸び時間(増幅される遺伝子の長さに応じて可変)を選択することを確認してください。1,000 bp ごとに 1 分の伸び時間を持ちます。
    2. プライマーの正しいアニーリング温度を入力するようにしてください。入力として両方のプライマーを使用するオンライン Tm 計算機を使用して、最適なアニーリング温度58を決定します。M13プライマーを使用する場合、45°Cの焼鈍温度で十分です。
    3. サイクル数を決定する場合は、製造元のプロトコルを参照してください。
  3. PCRを行う場合は、dNTPsを解凍して渦を出します。キットに用意されている PCR バッファーを使用します。
  4. 1 つの PCR チューブで、製造元のプロトコルで指示されたキット コンポーネントをすべて組み合わせます。増幅を成功させるには、1 μLの再懸濁したDNAストックを追加します(ステップ2.6)。
  5. 混合物を5~10sの中で渦を緩やかに均質化する。あるいは、ピペットは体積の半分を渦に10〜20回上下する。
  6. PCR反応を行います。
  7. PCR プロトコルに最終冷却ステップが含まれていない場合は、反応を 10 °C で 5 分間冷却してから、チューブの底部に凝縮を駆動させるため取り除きます。
  8. ベンダーの指示に従って PCR クリーンアップ キットを使用して反応を浄化します。
    1. 1.5 mLチューブに、DNA結合バッファーとPCRサンプルをそれぞれ5:1の比率で加えます。
    2. この混合物を16,000 x g でスピンカラムと遠心分離機に1分間移します。フロースルーを破棄します。
    3. 200 μL の DNA 洗浄バッファーをカラムに加え、室温で 1 分間インキュベートします。
    4. 16,000 x g で1分間遠心分離機を使用し、フロースルーを廃棄します。
    5. 1分インキュベーションステップなしでステップ2.8.3と2.8.4を繰り返します。
    6. 遠心分離機は16,000 x g で1〜2分を追加し、残りのバッファを除去する。
    7. ddH2Oの46 μLでDNAを溶出する。
  9. 分光光度計を用いて精製したDNAを定量化する。
  10. 精製したDNAを-20°Cに保存するか、次の工程に進みます。

4. 消化と回覧

注:さらに増幅は、RCAに続いてDNAを円形化することによって達成することができる。DNAを消化して、テンプレートを循環処理に備えます。これにより、プライマーシーケンスが削除され、テンプレートの 5' と 3' の両端にスティッキーエンドが作成されます。これらの末端をライゲーション反応により再び付着する。

  1. PCRチューブで、ステップ3.8から必要なバッファー5 μL、20 U の HindIII、精製された DNA の 45 μL を組み合わせます。
  2. この混合物をピペットで穏やかに均質化します。
  3. 37°Cで15分間、サーマルサイクラーで混合物をインキュベートします。
  4. 80°Cで20分間インキュベートすることにより、ヒンドIIIを不活性化します。
  5. チューブの底部に凝縮を駆動するために除去する前に10°Cに冷却する反応を可能にします。
  6. 5 μLのT4リガーゼバッファーと800 UのT4リガーゼを新たに消化したDNAに加えます。
    1. 必要に応じて、T7リガーゼを使用します。
  7. この混合物をピペットで穏やかに均質化します。
  8. 25°Cで1時間の混合物をインキュベートし、回覧反応を行う。
  9. ベンダーの指示に従って PCR クリーンアップ キットを使用して反応を浄化します。手順 3.8 で説明した同じプロトコルを使用します。
  10. 分光光度計を用いてDNAを定量化する。期待値は約 20 ng/μL です。
  11. -20°Cで保存するか、次のステップに進みます。

5. 等温圧圧円増幅

注:ローリングサークル増幅(RCA)は、市販のキットを使用するか、個別に購入したコンポーネントを使用して実行できます。メーカーのプロトコルに従うと、増幅が成功します。キットは、典型的には、サンプルバッファー、反応バッファー、およびφ29ポリメラーゼのようなストランド変位ポリメラーゼを含む。複数の反応チューブを組み合わせて、無細胞発現のための大量のDNAを生成することができます(出発物質の20 pgから4 μg)。次のプロトコルは効率的に動作します。

  1. 1つのチューブで、サンプルバッファーの20 μL、反応バッファーの20 μL、酵素の0.8 μL、およびステップ4.9からの円形発現テンプレート(CET)の1 μLを組み合わせます。
    注:これは〜20 ngの総DNA質量を有しますが、RCAはピコグラム量で働くことができるので、高スループットスクリーニングで材料が大幅に必要な場合はCETの希釈と極端な酵素増幅を可能にします。
  2. 混合物をピペットとアリコート10μLで均質化し、混合物を4つの別々のチューブに分けます。
  3. 30°Cで4〜18時間インキュベートする。
  4. 65°Cで10分間インキュベートすることにより、酵素を不活性化する熱。チューブの底部の結露を促すために、温度を12°Cに5分間下げます。
    注: サーマルサイクラー上の自動プロトコルですべての温度ステップを組み合わせるのが最も簡単です。
  5. 得られた溶液を、各チューブに15μLのddH2Oを加えて希釈します。
  6. すべてのチューブを組み合わせて、無細胞反応に直接追加します。
  7. 必要に応じて、PCRクリーンアップキットを使用して製品を精製し、36 μLのddH2Oで溶出して定量化します。テンプレート濃度が約100 ng/μLであることを確認します。

6. 無細胞反応

注: エネルギー バッファー、抽出、および RCA テンプレートを組み合わせてセルフリー式を実行します。PANOx-SPエネルギーバッファーを用いた一般的な無細胞反応は、1.2 mM ATP、0.85 mMそれぞれGMPで構成されており、 UMP、およびCMP、30 mMホスホエノールピルビン酸、130 mMカリウムグルタミン酸、10mMアンモニウムグルタミン酸、12mMマグネシウムグルタミン酸、1.5mMスペルミジン、1mMプトレシン、フォリン酸34 μg/mL、171μg/mLのフォリン酸、171 μg/mLのERNA混合物 20個の非標識アミノ酸、0.33 mM NAD、0.27 mM補酵素A(CoA)、4mMシュウ酸カリウム、57 mM HEPES-KOHバッファー(pH 7.5)、0.24%の大腸菌抽出物、および可変量のDNA23、49。反応の量はさまざまですが、15 μLの反応は試薬の使用量を節約でき、384の黒壁マイクロプレート49,50での使用に十分小さいです。

  1. sfGFPなどの蛍光タンパク質を発現する場合は、希望の励起/放出、温度、攪拌で読み取るプレートリーダーを用意します。
  2. 384ウェルプレートを使用する場合、湿度を維持し、エッジ効果を低減するために、空のサンプルによく接するウェルにH2Oのアリコート60 μL。
  3. 各サンプルのチューブに必要なさまざまなコンポーネントを追加します。トリプリケートを実行するのに十分な量を追加します。プレート内の複製は、変動の原因を特定するのに役立ちます。
    1. 抽出物、エネルギーバッファー、次にDNAを追加します。
    2. ddH2Oで最終的な必要なボリュームに希釈します。
  4. 溶液の半分を上下に10~20回ピペット処理して、この溶液を完全に混ぜます。
  5. 15 μL アリコートで反応混合物をマイクロティタープレート内の所望のウェルに移します。
  6. 耐湿を維持し、蒸発を防ぐために、無色のシールフィルムでプレートを密封します。
  7. プレートリーダーに密封プレートを置き、反応を完了させます。
    1. ライブ監視機能を持たないタンパク質を発現する場合は、熱ブロックなどの別の温度制御装置を用いてプレートをインキュベートする。

7. サブティリンアッセイ

注: 副配列#2でサブチリシンBPN'(SBT(n))遺伝子を発現する場合、このプロトコルに従って活性をアッセイする。

  1. ジメチルホルムアミド(DMF)でN-スクシニル-アラ-プロフェp-ニトロアニリドの10 μMストック溶液を調製します。
  2. プレートリーダーをセットし、25°Cの温度を保ちながら、20分ごとに410 nmで吸光度を測定します。
  3. 平らな底、無色96ウェルプレート、ddH2Oのアリコート94 μLおよびステップ7.1からのN-スクシニルアラアラ-プロ-Phe p-ニトロアニリドの1 μL。
  4. ステップ6.7から完成した無細胞反応の5μLを加え、ステップ7.2で説明したプロトコルにセットされたプレートリーダーを使用して読み取ります。

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結果

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RCAテンプレートからのsfGFPの発現は、15μL反応で0.30μLの未精製RCA DNAのみを使用した場合のpJL1プラスミドと同等であった(図2A)。実際、テンプレートの量を倍増して3倍にすることはBL21 DE3 Star抽出物では何のメリットも提供していないようで、反応あたり0.30 μLですでに飽和レベルのテンプレートを示唆しています。逆に、SHuffle株から供給される細胞抽出物に添加するとRCAテンプレートの量を増やす利点があるようです(図2B)28。一部のタンパク質では、結果は非常に迅速に観察することができ、ワークフロー全体(増幅およびアッファー)を24時間下に圧縮します。ただし、一部のタンパク質は温度が低いか、折り畳み時間が遅く、結果が得られるまでの時間は長くなりますが、ここで示すワークフローに影響を与えます。これは、4時間の発現後のアッシングがSBT(n)成熟に十分な長さではなかったサブチリシン(SBT(n))を表現する場合に観察することができます(...

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ディスカッション

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目的の遺伝子は任意の所望のタンパク質であり得るが、この方法の新しい採用者のためのウェルプレートリーダー上のリアルタイムまたはエンドポイント読み出しのための便利なレポーターとして蛍光タンパク質から始めることをお勧めします。新しいタンパク質配列については、所望のタンパク質のアミノ酸配列をコピーし、所望のコドン最適化ツール61,62に貼り付ける。コドン最適化ツールには通常多くの生物や大腸菌の株がありますが、一般的な大腸菌オプションを選択することが適しています。最適化後、遺伝子を再確認して、以前に選択した切断部位とプライマー配列が存在しないことを確認します。その場合、シーケンスが存在しなくなるまでシーケンスを最適化できます。状況によっては、最適化を繰り返し内部 HindIII カット サイトに一貫して発生する場合は、HindIII カット サイトを別の制限サイトに置き換える必要があります。プロセスを標準化し、複数の制限酵素を手元に保持するコストを削減するために、できるだけ頻繁に同じカットサイト...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ナイジェル・ロイエルは、抗体の設計に無細胞システムを使用するBigHat Biosciences Inc.の科学諮問委員会を務めています。

謝辞

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著者らは、このプロジェクトの部分的な支援に関するNIH 1R35GM138265-01およびNSF 2029532を認めている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AlalineFormediumDOC0102
グルタミン酸アンモニウムMP BiomedicalsMP21805951
アルギニンFormediumDOC0106
アスパラギンFormediumDOC0114
アスパラギン酸FormediumDOC0118
ATPSigmaA2383
Axygen シーリング フィルムコーニングPCR-SP
CMPシグマC1006
コエンザイム AシグマC3144
CutSmart バッファーNEBB7204SHindIII
システインフォーミディアムDOC0122
DNA クリーンおよびコンセントレーター キットを提供 Zymo ResearchD4004DNA の精製に使用
dNTPsNEBN0447
E. coli tRNASigma (Roche)10109541001
Folinic AcidSigma47612
遺伝子断片IDT
グルタミンFormediumDOC0134
GlutamineFormediumDOC0130
GlycineFormedium
GMPSigmaG8377
HEPESSigmaH3375
HindIII-HFNEBR3104L
ヒスチジンフォーミディアムDOC0142
イソロイシンフォーミディアムDOC0150
ロイシンフォーミディアムDOC0154
リジンFormediumDOC0158
グルタミン酸マグネシウムSigma49605
メチオニンFormediumDOC0166
マイクロタイタープレート (384 ウェル)Greiner781906
マイクロタイタープレート (96 ウェル)Greiner655809
マルチモード プレート リーダーBioTekSynergy Neo2
NADシグマN8535
ナノフォトメーターは、NP80
OneTaq DNAポリメラーゼNEBM0480
PCRチューブVWR20170-012
ニルアラニンFormediumDOC0170
ホスホエノールピルビン酸シグマ(ロシュ)10108294
グルタミン酸カリウムシグマを実装しますG1501
ウ酸カリウムフィッシャーサイエンティフィックP273
プロリンフォーミディアムDOC0174
プトレシンシグマP5780
リンフォーミディアムDOC0178
スペルミジンシグマS0266T4DNA
リガーゼNEBM0202S
T4DNAリガーゼ反応バッファーNEBB0202ST4 DNAリガーゼ
TempliPhi増幅キットRCA
サーマルサイクラーBioradC1000 Touch
ThermoblockエッペンドルフサーモミキサーFP
ThreonineFormediumDOC0182
TryptophanFormedium
DOC0186 チロシンフォーミディアムDOC0190
UMPシグマU6375
バリンフォーミディアDOC0194
DOC0138フェシュセを提供 に使用25640010 ム

参考文献

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