メタノゲン純粋培養物と環境試料からのポリグルタミン酸尾長の分析のための補因子_F420 の抽出

_F420は、広く普及しているが、しばしば無視された補因子であり、これは、古細菌および細菌^1,2の両方の一次および二次代謝プロセスにおける義務的な2電子水素化物担体として機能^する。_F420は5-デアザフラビンであり、構造的にはフラビンに類似しており、それによってその化学的および生物学的特性はNAD⁺またはNADP⁺のものとより同等である。イソロキサジン環の位置5で窒素と炭素を置換するため、それは強力な還元剤であり、したがって-340 ^mV1,3の低標準酸化還元電位を示す。_F420は、5-デアザフラビン環と2-ホスホ-L-乳酸リンカーを含む(_F420-0)。n+1グルタミン酸モノマーを含むオリゴグルタミン酸尾を分子に結合させることができる(_F420-n+1)⁴。

長い間、補因子_F420は、単に古細菌とアクチノバクテリアと関連付けられてきた。これは主に覆されています。最近の分析では、_F420はフィラプロテオバクテリア、クロロルレクシの多様な嫌気性および好気性生物の間に分布し、土壌、湖、人間の腸のような無数の生息地に生息する可能性のあるフィルミキュートが明らかになりました^1,5.2019年、Bragaら.⁶は、プロテオバクテリウムパラブルクホルデリア・リゾキシニカが、様々な生息地で広まっている可能性のある2-ホスホラクテート尾の代わりに3-ホスホグリセリン酸を含むユニークな_F420誘導体を産生することを示した。ドメインアルカエアの中で、_F420は、メタノジェニック⁷、メトトロ^ピー8、9、硫酸還元^{オーダー10}を含むいくつかの系統で発見されており、タウマルカエオタ¹¹で生産されることになっている。_F420は、水素栄養学およびメチロトローフ性メタン新生において必須のレドックス補酵素として最もよく知られている。_F420(F420H2)の還元形態は、メチレンネテトラヒドロメタノプテリン(メチレン-_H4MPT、Mer)およびメテニル_H4MPT12,13の還元のための電子ドナーとして機能する。また、シトクロム^12,14を含有するメタノゲンの_H2非依存性電子輸送経路における電子担体として用いることができる。さらに、_F420の酸化型は、420nmでの励起時に特徴的な青色・緑色蛍光を有し、微小微小の微小化した微量体原の検出を容易にする(図1)。その低い酸化還元電位のために、_F420は(i)それ以外の場合は再カルシタントまたは有毒な有機化合物の広いスペクトルの外因性減少を促進し、 (ii)ストレプトマイセテ(フィラムアクチノバクテリア)におけるテトラサイクリンおよびリンコサミド抗生物質またはフィトトキシンの合成、および(iii)抗酸菌(フィラムアクチノバクテリア^{)における}酸化またはニトロ化ストレスまたはその他の不利な状態に対する耐性^、 16,17,18,19,20,21,22.その結果、_F420依存性酸化還元酵素は、工業および製薬の目的および汚染された環境のバイオレメディエーションのための有望な生体触媒^{である1,23}。これらの最近の知見にもかかわらず、補因子_F420の正確な役割は、アクシノバクテリアまたは他の細菌フィラでまだわずかに知られている。

_F420生合成には少なくとも3つの経路があります^2,6,24。初めに、生合成経路は5-デアザフラビン生合成および2-ホスホラク酸代謝分岐に分割される。_F420分子の反応性部分は、フィロシンと5-アミノ-6-リビチルアミノ-2,4(1H, 3H)-ピリミジンジオンの基質を用いて_FO-シンターゼを介して合成される。結果はリボフラビンレベルのクロモフォア_FOです。現在受け入れられている乳酸代謝ブランチ内では、L-乳酸はL-乳酸キナーゼ(CofB)によって2-ホスホ-L-乳酸にリン酸化される。2-ホスホ-L-乳酸は、今度は、2-ホスホ-L-乳酸グアニリルトランスファーゼ(CofC)によってL-ラクチル-2-ジホスホ-5'-グアノシンにグアニル化される。次のステップでは、L-ラクチル-2-ジホスホ-5'-グアノシンは、_F420-02を形成する2-ホスホ-L-乳酸トランスファーゼ(CofD)によって_FOにリンクされています。最後に、酵素_F420-0:ɣグルタミルリガーゼ(CofE)はグルタミン酸モノマーを_F420-0にリゲートし、異なる数^23,25で最終的な補因子⁶を形成する。異なる生物は、ミコバクテリア^2,25,26よりも安価な尾がメサノゲンに見られる短い尾で、付着したグルタミン酸残基の数で異なるパターンを示^す。一般的に、メタノゲンは2から3までの尾の長さを示し、アセトクラス性メタノゲン、メサノサルシナsp.で最大5つ、マイコバクテリウムspに見られる尾長は5〜7個のグルタミン酸残基^2,25,26,27の範囲でした。しかし、最近の知見では、長鎖_{F420が短鎖F420}よりも高い親和性を有する_F420依存性オキシド還元酵素に結合することが示された。また、結合長鎖_F420は基質親和性を高めるが、それぞれの酵素²³の回転率を低下させる。

補因子_F420の検出は、多くの場合、その蛍光に基づいています。それにより、そのオリゴグルタミン酸誘導体を逆相(RP)-^HPLC27,28を用いて分離した。最近、Ney et al. は、負に荷電したグルタミン酸尾のイオン対向試薬として水酸化テトラブチラモニウムを使用し、RP-HLPC上での分離を正常に促進した⁵。ここでは、純粋な培養物からだけでなく、異なる環境サンプル(土壌および消化剤汚泥)からの補因子_F420のサンプル、その後のリシス、抽出、精製、分離、定量の調製方法を提示する。

注: 補因子_F420 の抽出と分析は、サンプルの溶菌、固相抽出(SPE)による補因子予精製、蛍光検出によるイオンペアRP-HPLC(IP-RP-HPLC)による補因子検出を含む3段階のプロセスです。開始する前に、 表1に記載されている材料および試薬を準備します。

1. サンプルのリシス

1. 適切なチューブ(例えば、50 mL円錐管)にサンプルの5 gまで追加します。
2. 溶解バッファーの 5 mL (2x ストック溶液、 表 1) をサンプルに加えます。
3. 蒸留水で最終体積10mLに持ち込み、最終濃度0.5g・^mL-1に到達します。
4. 20 sの希釈サンプルを渦液。
5. 121 °Cで30分間オートクレーブ。
6. 森林土壌のような乾燥サンプルの場合は、オートクレーブ後に蒸留水で20mLの最終体積を持ち、希釈されたサンプルを渦巻きます。
   注意: オートクレーブの間に温度が上昇すると、チューブが破裂する可能性があります。

2. 固相抽出(SPE)による補因子F ₄₂₀ の予精製

注:SPEのすべてのステップは室温で行われます

1. サンプルを室温まで冷やします。
2. 11,000 x gで5分間オートクレーブサンプルを遠心分離 します。
3. 弱いアニオン混合モードポリマー吸着剤の100mgで満たされた5 mL SPEカラムを準備します。
4. 3 mLのメタノール(条件溶液、 表1)でアニオン交換器を条件にします。
5. 3 mLの蒸留水でアニオン交換器を平衡化する(平衡溶液、 表1)。
6. 遠心分離したリセートからSPEカラムに上清の9.0 mLまでロードします。
7. 25mM酢酸アンモニウム(SPE洗浄液1、 表1)の5mLで不純物を洗い流す。
8. 5mLのメタノールで不純物を洗い流す(SPE洗浄液2、 表1)。
9. 溶出バッファーの 1.0 mL で補因子 _F420 を溶出する(表 1)。
   注:新鮮な溶出バッファを準備してください。真空が適用され溶出バッファーの蒸気圧が高いため、溶出量はサンプルごとに異なる場合があります。すべてのサンプルで同じ最終容積を確保するために、溶出の前後に回収容器の重量を量り、有効溶出量を計算することを推奨します。溶出バッファーの添加により差のバランスを取る。

3. 補因子_F420の検出

1. オーブンを40°Cに、蛍光検出器を420 nmの絶滅波長および470 nmの発光波長に設定します。移動相AとBを用いて勾配モードで分離を達成する(表1):0-3分:26%B;3-24分:26%-50%B;24-25分:50%B;25-27分:50%-26%B;27-35分:0.75 mL·^min-1の流量で26%B。
   注: 少なくとも 74% 移動相 A および 26% 移動相 B の 3 列ボリュームで列をフラッシュして、サンプルを注入する前に列条件の平衡を保証します (表 1)。
   1. 0.22 μmの孔径のPTFEフィルターを使用して、SPEから溶出したサンプルをHPLCバイアルにフィルターします。
      注:0.22 μmの孔径のPTFEフィルタをお勧めします。
   2. 溶出したサンプル50 μLをHPLCシステムに注入し、補因子_F420 組成と濃度を分析します。
      注: このプロトコルでは定量的な標準が使用されていないので、サンプルとバリアントをピーク面積で比較する必要があります。

メタノサルシナ熱性菌およびメタノカレウス熱性の純粋な培養物は、いずれも好熱性の古大なものであり、以前に説明した好性の培地で増殖した。メタノールはエネルギー源としてメタノールを使用し、一方、メタノカレウスはH2/CO2で増殖した。成長は顕微鏡評価によって確認し、活性は、前述のガスクロマトグラフィーによるメタン(CH4)の測定を介して調べられた31。純粋な培養物は、提示されたプロトコルに従って補因子F420の抽出に使用された。また、2020年秋には、中球性バイオガス反応器スラッジ(廃水処理プラント、ジルル、オーストリア)のサンプルを含む環境試料を採取し、農業用牧草地(オーストリア、インスブルック、オーストリア)、森林土壌(オーストリアのランズ)を採取し、コファクターF420の抽出と分析を行いました。

純粋な培養物の成長は顕微鏡法によって検証されており(図1)、14日間のインキュベーション中にガスクロマトグラフィーを介して分析されたCH4 (データは示されていない)。純粋な培養物からの補因子F420 抽出の効率は、0.5-1.0 mmセラミックビートを使用したビートビート、超音波処理、および121°Cおよび1.2バー圧力(オートクレーブ)を使用した圧力温度崩壊(オートクレーブ)を使用して、異なる崩壊戦略を適用して試験されました。最大抽出効率は、プロトコルセクションに記載されているようにバッファを適用する圧力温度処理を用いて明らかになり、それ以降の実験すべてに対してさらに適用された(図2)。抽出効率試験は、成長性の高い メタノカレウス好熱性 培養物の異なる容積の標準的な添加を介して行った。さらに、異なるサンプルおよび変異体の比較は、クロマトグラムからのピーク面積に基づいていた。

続いて、細胞抽出物を固相抽出(SPE)手順に従った。この目的のために、異なるイオン交換器がテストされた。弱アニオン混合モードポリマー吸着剤が溶出後に最も高い分率F420 を生み出したことが判明した。さらに、異なる溶出バッファーおよび洗浄液を試験し、溶出バッファーとしてメタノール中のNH3 と混合液として25 mM酢酸アンモニウムに対して最良の結果を示した。溶出工程からのメタノールは、真空温度処理を介して水と溶出した後に交換することができる。

補因子F420 のHPLC分析は、NX C18カラムを用いた発表された研究の間に達成されたシステム構成に最適な結果を有する異なるC18カラムで試験された。様々なグルタミン酸尾長を有するF420 誘導体の既知の分布を含む標準が参考目的で使用された。この基準は、オーストラリア国立大学のコリン・ジャクソン教授によって親切に提供されました。グルタミン酸尾長の分析は、補因子F420 の全体的な濃度と、メタノジェニック純粋培養および環境試料のF420 尾長の分布の差を明らかにした(図3)。

表1:固相抽出(SPE)およびHPLC分析のためのバッファーおよび移動相組成。 

図1:蛍光性の清因性純粋な培養物。(A)相対比顕微鏡を介したメサノサルシナサーモフィラの可視化と(B)蛍光顕微鏡による補因子F420がUV光で励起される場合(395-440 nmで励起し、475-495nmで発光)。スケールバー:10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:標準追加。M.サーモフィルス培養物の異なる体積でスパイクされたマトリックスの1.0 gからSPE後に回収された補因子F420のピーク面積。マトリックスは、0 μL、250 μL、500 μL、750 μL、および 1000 μL の培養で修正され、ビート・ビート、超音波処理、および圧力温度崩壊 (オートクレーブ) という異なる崩壊戦略を行いました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:グルタミン酸尾部の長さ分布 純粋な培養物と環境試料の補因子F420 尾長分布。上から下へ:農業用草原(土壌)、森林(土壌)、中球性バイオガス反応器、 M.サーモフィルス の純粋な培養、 およびM.サーモフィラ の純粋な培養。相対吸光度は、示されたクロマトグラム内の最高峰での正規化によって算出した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは開示するものは何もない。