ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。
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方法論記事
悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義
この記事について
サマリー
要約
ヒトがんの主要タンパク質を正確に標的とする新薬の開発は、がん治療薬を根本的に変えています。しかし、これらの薬剤を使用する前に、それらの標的タンパク質を特定のがんタイプの治療標的として検証する必要があります。この検証は、多くの場合、がんの遺伝子操作マウス(GEM)モデルで治療標的候補をコードする遺伝子をノックアウトし、これが腫瘍増殖にどのような影響を与えるかを決定することによって行われます。残念なことに、従来のノックアウトにおける胚致死性や条件付きノックアウトにおけるモザイク性などの技術的問題により、このアプローチが制限されることがよくあります。これらの制限を克服するために、GEMモデルで生成された悪性末梢神経鞘腫瘍(MPNST)の短期培養において、目的のフロックス胚致死遺伝子を切除するアプローチが開発された。
この論文では、適切な遺伝子型を持つマウスモデルを確立し、これらの動物から短期間の腫瘍培養物を導き出し、Creリコンビナーゼと増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)を発現するアデノウイルスベクターを使用して、フロックス胚致死遺伝子をアブレーションする方法を説明します。蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いたアデノウイルスを導入した細胞の精製、および遺伝子アブレーションが細胞増殖、生存率、トランスクリプトーム、および同所性同種移植片増殖に及ぼす影響の定量化が詳述される。これらの方法論は、イン ビトロおよびインビボで 治療標的を同定および検証するための効果的かつ一般化可能なアプローチを提供する 。 これらのアプローチはまた、 インビトロ 増殖アーチファクトを減少させた低継代腫瘍由来細胞の再生可能な供給源を提供する。これにより、セクレトームによって媒介される遊走、浸潤、転移、細胞間通信などの多様な生物学的プロセスにおける標的遺伝子の生物学的役割を研究することができる。
概要
過去20年以前、ヒトのがんの治療は、DNAを損傷したり、DNA合成を阻害したりすることによって急速に増殖する細胞集団を広く標的とする放射線療法および化学療法剤に大きく依存していました。これらのアプローチは癌細胞の増殖を阻害したが、腸上皮細胞や毛包細胞などの正常な急速に増殖する細胞型にも有害な副作用をもたらした。より最近では、がん治療は、個々の患者の新生物の増殖にとって決定的に重要なシグナル伝達経路内のタンパク質を正確に標的とする化学療法剤を利用し始めている。一般に「プレシジョンメディシン」と呼ばれるこのアプローチは、モノクローナル抗体と小分子阻害剤のレパートリーの拡大を続ける開発につながっています。これらの薬剤は、腫瘍細胞の増殖および生存を効果的に阻害する一方で、従来の化学療法剤および放射線療法で見られる正常な細胞型に対する有害な副作用を回避する。ヒト癌の治療に使用されるモノクローナル抗体は、最も一般的には、成長因子受容体1(例えば、膜貫通受容体チロシンキナーゼの大ファミリー)および免疫応答モジュレーター2(例えば、プログラム細胞死タンパク質1、プログラム死リガンド1)などの細胞表面分子を標的とする。小分子阻害剤は、細胞内に位置する細胞表面タンパク質またはシグナル伝達タンパク質のいずれかを阻害することができる3。しかしながら、これらの新しい治療薬を効果的に採用するためには、特定の癌が候補治....
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プロトコル
マウスで処置を行う前に、すべての処置は、施設動物管理および使用委員会によって検討および承認されなければならない。この原稿に記載されているプロトコルは、サウスカロライナ医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。このプロトコルは、MUSCの施設動物ケアガイドラインに従って、適切に訓練された人員によって実施されました。
1. Erbb4 flox 対立遺伝子に対してホモ接合型のMPNSTを発育するマウスの作製
- P0-GGFβ3のF1世代を産生する;Trp53+/-;P0-GGFβ3を交配させることによるErbb4fl/+動物;Trp53+/-マウス7とErbb4 fl/flマウス11。Punnettの正方形(図1)を使用して、所望のP 0-GGFβ3で十分な雄および雌のF1子犬が生成されるように繁殖計画を導く。Trp53+/-;Erbb4fl/....
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結果
図4は、P0-GGFβ3を形質導入するときに得られる典型的な結果を示す;Trp53-/+;Ad5CMV-eGFPアデノウイルスまたはAd5CMV-Cre/eGFPアデノウイルスのいずれかを有するErbb4fl/fl MPNST細胞(図4A)。培養物を蛍光顕微鏡で観察してeGFP発現細胞を同定し、位相差顕微鏡で10倍(上)と40倍(下)で同じフィールドに存在する細胞の総数を決定します。次に、eGFPを発現する細胞の割合を、所望により計算することができる。代表的なFACS出力データを補足図S2に示す。FACSに続いて、eGFP発現細胞の割合は著しく増加し、各分野の事実上すべての細胞がeGFPを発現します。Cre媒介遺伝子アブレーション後に期待される典型的なPCRジェノタイピング結果は、トランスフェクション効率に応じて、完全な遺伝子ノックアウト(100%効率)または誘導細胞と非誘導細胞の不均.......
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ディスカッション
ここで紹介する詳細な方法は、MPNSTのGEMモデルを使用して開発されました。しかしながら、目的の腫瘍組織を個々の細胞に分散させることができる場合、これらの方法論は、GEMSにおいて生じる様々な腫瘍タイプに容易に適応可能である。フロックス対立遺伝子が、i)腫瘍をスクリーニングするのに十分なマウスを得ることを困難にする生存率の低下、またはii)十分な担癌マウスを得ることを困難にする腫瘍潜伏時間の増加をもたらさないようにすることが重要である。フロックス対立遺伝子が生存に影響を及ぼさない場合、両方のコホートの生存率は同等になります。腫瘍潜伏期間に影響を及ぼさない場合、同様の時間経過を有する両方のコホートにおいて同等の数の担癌マウスが生じるはずである。
同様のアプローチが、誘導性条件付きノックアウト動物を生成するために条件付きノックアウトおよびタモキシフェン誘導性Cre動物を用いて神経線維腫およびMPNSTを研究するために使用されている33,34。これらの研究と今回の研究と.......
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開示事項
著者らは、開示すべき利益相反はありません。
謝辞
この研究は、国立神経疾患・脳卒中研究所(R01 NS048353、R01 NS109655)、国立がん研究所(R01 CA122804)、国防総省(X81XWH-09-1-0086、W81XWH-11-1-0498、W81XWH-12-1-0164、W81XWH-14-1-0073、およびW81XWH-15-1-0193)、および小児腫瘍財団(2014-04-001および2015-05-007)からの助成金によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of | Iowa VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor オープンソースソフトウェア for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | ステップ4.4に使用される代替統計分析ツール |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | キレート剤の混合物 |
| DAB染色キット | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | ステップ4.5 | ||
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaqおよびバッファー(ジェノタイピングPCR) | Thermo/Fisher | EP0701およびK1072 | |
| erbB4抗体 | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4抗体 | Abcam | ab35374 | |
| erbB4に使用されるDAVID https://david.ncifcrf.gov 機能濃縮分析ソフトウェア抗体 | ミリポア | HFR1: 05-1133 | |
| FACS ソーター | BD バイオサイエンス | アリア II | |
| フォルスコリン | シグマ | F6886 | |
| GenomeSpace ツールとデータソース | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | ステップ4.5 |
| グルタミン | コーニング | 25-005- | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (旧 Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (次世代 DNA シーケンサー) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA シーケンサーをステップ 4.2 |
| に使用 Lasergene: ArrayStar 遺伝子発現およびバリアント解析 | DNAStar LaserGene ソフトウェア | N/A | ソフトウェア ステップ 4.4 に使用したソフトウェア統計および正規化解析 |
| Lasergene: SeqMan NGen 配列アラインメントアセンブリ | ステップ4.3に使用されるソフトウェアアライメント | N / A | ソフトウェアアライメントステップ4.3 |
| トリゲル、低成長因子基底膜マトリックス | コーニング | 354230 | |
| NRG1-ベータ | 社内 | でSLCによって生成され、R&からも市販されていますDシステムズ(396-HB-050 / CF)。 | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-CL | |
| プライマー1:5′-CAAATGCTCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ | ユーロフィンゲノミクス | プライマー1 + 2:250 bp ErbB4ヌル積と350 bp Floxed ErbB4製品; | |
| 入門書2:5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ | ユーロフィンゲノミクス | プライマー1 + 2:250 bp ErbB4ヌル積と350 bp Floxed ErbB4製品; | |
| プライマー3:5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA | Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp野生型ErbB4製品。 | |
| プロピジウムヨウ素 | フィ | ッシャー51-351-0 | |
| プロテオムプロファイラーホスホキナーゼアレイ | R&D Systems | ARY003B | |
| リアルタイム glo | Promega | G9712 | 生物発光細胞生存率アッセイ |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | ステップ4.5 |
| Trizol(酸-クアニジニウム-フェノールおよびクロロホルムベースの試薬) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | パーキン・エルマー | ・NEL721001EA |
参考文献
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblast....
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