蛍光標識End結合タンパク質を用いて 生体内で 動的微小管をイメージングするプロトコルが提示された。 我々は、C.エレガンスの後方微小管(PLM)ニューロンにおける動的微小管の標識、画像化、および分析の方法を説明した。
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この記事について
サマリー
要約
ニューロンでは、微小管配向は、一般的に配向が混在するプラスエンドアウト微小管と樹状突起を有する軸索を同定するための重要な査定者であった。ここでは 、C.エレガンス におけるタッチニューロンの発達と再生中の微小管ダイナミクスおよび成長を標識、画像化、分析する方法について説明する。微小管先端の遺伝的にコードされた蛍光レポーターを用いて、軸索微小管を画像化した。このプロトコルを使用して、奇数に続いて軸索再生を開始する微小管挙動の局所的変化を定量化することができる。このアッセイは、様々な細胞プロセスにおける微小管ダイナミクスの調節を調査するために、他のニューロンおよび遺伝的背景に適応可能である。
概要
ニューロンは、樹状突起、細胞体、軸索、シナプスなどの特殊なコンパートメントを備えた精巧なアーキテクチャを持っています。ニューロン細胞骨格は、微小管、マイクロフィラメント、および神経フィラメントと、その明確な組織が、神経区画を構造的および機能的に支持する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 .長年にわたり、微小管組織は、神経極性および機能の重要な決定要因として同定されてきた。ニューロンが開発中または再生中に構造リモデリングを受けるにつれて、微小管のダイナミクスと配向は、様々なニューロンコンパートメントのアイデンティティ、偏光輸送、成長、および発達を決定する。したがって、ニューロンリモデリングプロセスと相関させるために....
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プロトコル
1. レポーター株:文化とメンテナンス
注:PLMニューロンの微小管のダイナミクスと向きを測定するために、我々はEBP-2を発現するワーム株を使用しました::GFPはタッチニューロン特異的プロモーター mec-4(juIs338アレーレ)18、25、26の下で。私たちは、この株27のための標準的なワームの培養とメンテナンス方法を使用しています。
- ネマトード成長培地(3.0 g/L塩化ナトリウム、2.5 g/Lペプトン、20.0 g/L寒天、10mg/Lコレステロール(10mg/mLのストック溶液から希釈)を水に調製し、混合物をオートクレーブします。
- 1 mM塩化カルシウム、1 mM硫酸マグネシウム、25.0 mMリン酸カリウム単塩基pH 6.0で補う前に、混合物を10〜15分間短時間冷却します。
- 滅菌ディスペンサーを使用して60mmペトリ皿に約9 mLの混合物を注ぎ、その後室温で保存し、1日の無菌条件で保存し、その後4°Cで貯蔵します。
- 5....
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結果
代表的な例として、PLMニューロンの定常状態および再生軸索におけるEBP彗星のインビボ観察について説明した。PLMニューロンは、シナプスと短い後工程を形成する長い前工程を有するワームの尾領域に位置する。PLMニューロンは表皮に近い前部後方向に成長し、ワームの穏やかな接触感覚を担う。PLMニューロンは、その構造が単純化され、イメージングとマイクロサージャリーに対する無分別性のために、微小管細胞骨格29、軸索輸送30、31、および再生19、32、神経極性24、33、34、挙動および老化35、36について広範囲に調査されてきた
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ディスカッション
微小管ダイナミクスを理解することは、長年にわたって細胞骨格研究の分野で重要な焦点となっています。微小管は、動的不安定性44、45、46、47の連続的なプロセスと共に核形成および大惨事を起こす。この情報の多くは、遊離対重合チューブリンの光散乱読み出し、蛍光チューブリンからの微小管成長アッセイ等のインビトロアッセイを通じて得られた。薄い細胞では蛍光性および非蛍光性微小管の実生観察が可能であるが、生体内での微小管ダイナミクスの測定は困難である。
このトランスジェニック株を用いて、PVM、ALM、およびAVMのような他のタッチニューロンも微小管の配向について評価することができる。ここで説明するイメージング、および分析手順は、.......
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開示事項
著者らは利益相反を宣言しない。
謝辞
私たちは、初期のサポートと研究で使用される緊張のためにイーシ・ジンとアンドリュー・チザムに感謝します。細菌株OP50は、研究インフラプログラムのNIH事務所(P40 OD010440)が資金を提供するカエノハブディティス遺伝学センター(CGC)から商業的に利用されました。また、実験手順の標準化に対するダルメンドラ・プリに感謝します。この研究は、国立脳研究センター(インドのバイオテクノロジー省、インド政府の支援)、DBT/ウェルカム・トラスト・インディア・アライアンス早期キャリア・グラント(グラント#IA/E/18/1/504331)のS.D.、ウェルカム・トラストDBTインド同盟中間助成金(グラント#IA/I/13/1/500874)のコアグラントによって資金提供されています。 CRG/2019/002194) から A.G.-R へ。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| CZ18975ワーム株 | Yishi Jin lab | CZ18975 | Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | マウンティング ワーム |
| カバースリップ (18 mm x 18 mm) | Zeiss | 474030-9010-000 | マウンティング ワーム |
| ドライバー ヒーティング ブロック付き | Neolab | ウンティング ワー | |
| ム ガラス スライド (35 mm x 25 mm) | ブルースター | 埋込虫 | |
| ポリスチレンビーズ溶液(界面活性剤最小含有水媒体中4.55 x 10^13粒子/ml) | 株式会社ポリサイエンス | 00876 | 取り付けワーム |
| 試験管 | 取り付けワーム | ||
| OP50 細菌株 | Caenorhabditis 遺伝学センター (CGC) | OP50 | ワームハンドリング |
| 60mm ペトリプレート | Praveen Scientific | 20440 | ワームハンドリング |
| アスピレーター/キャピラリー | VWR | 53432-921 | ワームハンドリング |
| インキュベーター | パナソニック | MIR554E | ウォームハンドリング |
| プラチナワイヤー | ウォームハンドリング | ||
| 蛍光アタッチメント付き実体顕微鏡 | ライカ | M165FC | ウォームハンドリング |
| 0.3% 塩化ナトリウム | Σ | 71376 | 線虫増殖培地 |
| 0.25% ペプトン | T M 培地 | 1506 | 線虫増殖培地 |
| 10mg/mL コレステロール | Σ | C8667 | 線虫増殖培地 |
| 1mM 塩化カルシウム二水和物 | Sigma | 223506 | 線虫増殖培地 |
| 1mM 硫酸マグネシウム七水和物 | Sigma | M2773 | 線虫増殖培地 |
| 2% 寒天 | T M 培地 | 1202 | 線虫増殖培地 |
| 25mM 一塩基性リン酸二水素カリウム | Sigma | P9791 | 線虫増殖培地 |
| 0.1M 一塩基性リン酸二水素カリウム | Sigma | P9791 | 1X M9 バッファー |
| 0.04M 塩化ナトリウム | Σ | 71376 | 1X M9 バッファー |
| 0.1M 塩化アンモニウム | Fisher Scientific | 21405 | 1X M9 バッファー |
| 0.2M 二塩基性リン酸水素ナトリウム七水和物 | Sigma | S9390 | 1X M9 バッファー |
| ガラス瓶 | ボロシル | バッファストレージ | |
| 488 nm レーザー | ツァイス | イメージング | |
| 5X 対物レンズ | ツァイス | イメージング | |
| 63X 対物 | ツァイス | イメージング | |
| カメラ | フォトメトリクス | 進化 512 デルタ | イメージング |
| スピニング ディスク ユニット | HP | Intel ®Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | イメージング |
| 落射蛍光顕微鏡 | Zeiss | Observer.Z1 | イメージング |
| ハロゲンランプ | Zeiss | イメージング | |
| 水銀アークランプ | Zeiss | イメージング | |
| スピニングディスクユニット | 横河電機 | CSU-X1 | イメージング |
| ZEN2 ソフトウェア | Zeiss | イメージング | |
| イメージJ(フィジー)バージョン) | 画像解析と処理 | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe | 画像解析と処理 | |
| 解析用コンピュータシステム | Dell | Intel ®コア&トレード;i7-9700 CPU 3.00GHz | 画像処理・表現 |
参考文献
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
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