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方法論記事

遺伝子発現測定のためのバイオフィルム内緑 膿菌 からのTotal RNAの単離

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DOI:

10.3791/62755

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2021年9月24日

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1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

この記事について

サマリー

このプロトコルは、チャンバースライドで成長した 緑膿菌バイオ フィルムからRNAを単離し、ハイスループットシーケンシングを行う方法を提示します。

要約

緑膿菌 は、嚢胞性線維症(CF)患者の気道に感染症を引き起こす日和見性細菌性病原体です。 緑膿菌は 、エキソ多糖のマトリックスによって保護されるバイオフィルムを形成する能力で知られています。このマトリックスにより、微生物は抗生物質治療などの外的要因に対してより回復力を持つことができます。研究用のバイオフィルム成長の最も一般的な方法の1つは、マイクロタイタープレートまたはチャンバースライドです。これらのシステムの利点は、複数の増殖条件を試験できることですが、欠点は、RNA抽出のためのバイオフィルムの生成量が限られていることです。この記事の目的は、ハイスループットシーケンシングに十分な品質と量の少量のバイオフィルムから全RNAを抽出する方法について、詳細なステップバイステップのプロトコルを提供することです。このプロトコルにより、これらのバイオフィルムシステム内での遺伝子発現の研究が可能になります。

概要

嚢胞性線維症(CF)患者の肺感染症やプロテーゼ関連感染症など、ほとんどの慢性細菌感染症は、バイオフィルム内の生物の増殖を特徴としています。バイオフィルム1 は、主に多糖類2からなるマトリックスに包まれた細菌の群集である。バイオフィルム内の細菌は、成長が遅く、代謝的に休眠しており、嫌気性、低酸素状態にある可能性があります。バイオフィルムは、抗生物質の浸透性の低下、薬物排出ポンプの発現の増加、細胞分裂の減少などの要因により、抗生物質に対してより耐性があります3。これらの理由やその他の理由から、それらは非常に研究上の関心を集めています。

CF患者における慢性緑膿菌感染症などの持続性感染症を正確に研究するためには、バイオフィルム形成に見られる成長条件をin vitroで正確に反映する必要があります。一般的なハイスループットな方法は、チャンバースライドやマイクロタイタープレートでそれらを成長させ、共焦点顕微鏡4でバイオフィルム形成をモニターすることです。プランクトン性または自由浮遊性からバイオフィルム細菌生活への移行における主要な調節因子は、二次メッセンジャーである環状ジ

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プロトコル

研究倫理委員会(REB)は、ヒト被験者からの喀痰サンプルの収集と処理に必要です。この研究は、Hospital for Sick Children(REB#1000019444)によって承認されました。研究倫理委員会(REB)は、ヒトを対象とする喀痰サンプルを収集し、保存することが義務付けられています。これらの研究は、Hospital for Sick Children REB#1000058579によって承認されました。

1.バイオフィルム形成

  1. この研究で使用したCF患者の喀痰サンプルから得られた 緑膿菌 分離株を、37°Cのインキュベーター内のLuria Broth(LB)寒天プレートで一晩育てます。
    注:適切なストリーキング技術は、単一の細菌コロニーを得るために重要です。プレートを回転させながらストリーキングをすると、バクテリア細胞が十分に希釈され、単一のコロニーが成長できるようになります。
    1. 新鮮なLBプレートの上端にジグザグパターンの接種ループを使用して、プレートの約1/4が覆われるまでストリークバクテリア。
    2. プレートを約60°回転させます。新しい接種ループを取り、それを縞模様の領域に一度通し、プレートの2番目のきれいな領域に通し、ジグザグパターンを繰り返します。
    3. 手順1.1.2を繰り返し、プ....

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結果

このメソッドの一般的な概要を図 1 に示します。我々は以前、8ウェルチャンバースライドを使用して緑膿菌のバイオフィルムを増殖させ、それらを抗生物質に曝露した後、異なる時点で共焦点顕微鏡でそれらを調べていた12,13。この方法は、このシステムで成長したバイオフィルムから直接トータルRNAを抽出し、処理後の遺伝子発現変化を研究するために使用できます。このプロトコールは緑膿菌に最適化されていますが、他の細菌種にも簡単に適応できます。

少量のバイオフィルムから十分な量の良質なRNAを抽出することは、rRNAの枯渇とハイスループットシーケンシングのために困難な場合があります。このプロトコルを使用して、17種類の 緑膿菌 バイオフィルム分離株からトータルRNAを三重に抽出し、合計51の別々のサンプルに成功裏に抽出します。高収量と低収量を表す抽出RNAの量を

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ディスカッション

17種類の細菌バイオフィルムサンプルからトータルRNAを三重に抽出し、合計51のサンプルが得られます。49のRNAライブラリーがプールされ、成功裏に配列決定されました。全体として、これは、サンプルの半分以上が存在量が少なく、最適ではない品質であると考えられているにもかかわらず、96%の成功率で私たちの品質基準を検証しています34,35,36,37。

意味
このRNA抽出プロトコルは、チャンバースライドで成長した限られた量のバイオフィルムからRNAを抽出する詳細な説明においてユニークです。8ウェルチャンバースライドにおけるバイオフィルムの成長は、バイオフィルムへの外因的に添加された因子の影響やバイオフィルム形成における微生物.......

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開示事項

著者には、宣言する開示はありません。

謝辞

著者の貢献:P.W.、Y.Y.、V.W.が研究の概念化に関与しました。K.G.、L.J.、A.M.、P.W.は、ラボのプロトコルを最適化しました。K.G.の資金は、BioTalent CanadaによるStudent Work Placement Program補助金によって支えられました。

....

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Agilent 2100 バイオアナライザーAgilentG2939BA生体分子の自動電気泳動
Agilent RNA 6000 pico kitAgilent5067-1513を生成する高感度RNA電気泳動チップ
Zymo ResearchD7001-1-50核酸精製キットの一部として販売されているチオシアン酸グアニジニウムおよびN-ラウロイルサルコシンベースの溶解バッファー
DNA/RNA調製バッファーZymo ResearchD7010-2-10DNAおよびRNAの精製に使用されるグアニジンHClおよびエタノール緩衝液
DNA/RNAシールドZymo ResearchR1100-50DNAおよびRNA保存/保護試薬
DNA/RNA洗浄バッファーZymo ResearchD7010-3-6DNAおよびRNAの精製に使用される塩およびエタノール緩衝液
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSハイスループットシーケンサー
MGIEasy RNA Directional Library Prep SetMGI1000006386トータルRNAからMGIハイスループットシーケンシングプラットフォーム用のライブラリを生成します。
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001高エネルギー、高スループットの細胞かく乱物質
NEBNext rRNA 枯渇キット (バクテリア)New England BiolabsE7850X細菌 rRNA の効率的かつ特異的な枯渇 (5S、16S、23S)
Nunc Lab-Tek II チャンバースライドシステムサーモフィッシャーサイエンティフィック1545348 ウェルチャンバースライド、取り外し可能なウェル付き
Qubit FluorometerサーモフィッシャーサイエンティフィックQ33238DNA、RNAおよびタンパク質用蛍光光度計
Qubit RNA HSアッセイキットサーモフィッシャーサイエンティフィックQ32852RNA濃度を測定する高感度蛍光測定アッセイ
スピンアウェイフィルターザイモリサーチC1006-50-F主にゲノムDNAの結合または除去に使用されるシリカベースのスピンカラム
滅菌接種ループ、1 uLSarstedt86.1567.050微生物の操作のための無菌、使い捨て接種ループ
ZR BashingBead 溶解チューブZymo ResearchS6003-500.1mmと0.5mmのビーズ溶解マトリックスを含む2mLチューブで、生体サンプルを均質化
Zymo Spin IIICGカラムZymo ResearchC1006-50-GDNAおよびRNAの精製用シリカベースのスピンカラム
Zymo-Spin III-HRCフィルターZymo ResearchC1058-50ポリフェノール化合物、フミン酸/フルボ酸、タンニン、メラニンなどの阻害剤を除去します。
Zymobiomics DNA/RNA Miniprep kitZymo ResearchR2002DNAおよびRNAデュアル抽出キット
Zymobiomics HRC Prep solutionZymo ResearchD4300-7-30PCR阻害剤を除去するためにZymo-Spin III-HRCフィルターと併用
RIN DNA/RNA 溶解バッファー

参考文献

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm.

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