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方法論記事

単細胞およびリアルタイム分解能で初代ニューロン培養におけるニューロン生存を研究するためのスケーラブルな方法

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DOI：

10.3791/62759

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2021年7月26日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、一次皮質ニューロンの細胞傷害性ストレスに対するニューロンの生存を、リアルタイムまたは固定材料で細胞分解能で調査するための、シンプルで強力かつ汎用性の高い方法論を紹介します。

要約

神経細胞の喪失は、脳卒中、アルツハイマー病、パーキンソン病など、多くの神経病理の中核をなしています。細胞傷害性ストレスによるニューロンの生存過程を研究するために、さまざまな方法が開発されました。ほとんどの方法は、単一細胞の分離を可能にしない、または複雑で高価な方法論を伴う生化学的アプローチに基づいています。ここで紹介するのは、ニューロンの生存を研究するための、用途が広く、安価で、効果的な実験パラダイムです。この方法は、ニューロンのスパース蛍光標識とそれに続くライブイメージングと自動定量を利用します。この目的のために、ニューロンをエレクトロポレーションして蛍光マーカーを発現させ、非エレクトロポレーションニューロンと共培養して細胞密度を容易に調節し、生存率を高めます。

エレクトロポレーションによるスパースラベリングにより、シンプルで堅牢な自動定量が可能になります。さらに、蛍光標識を目的の遺伝子の共発現と組み合わせて、特定の分子経路を研究することができます。ここでは、神経毒性モデルとしての脳卒中のモデル、すなわち、手頃な価格で堅牢な自家製の低酸素チャンバーで実施された酸素-グルコース欠乏(OGD)アッセイを紹介します。最後に、IN Cell Analyzer 2200またはオープンソースのImageJを使用して、半自動データ処理のための画像解析を行う2つの異なるワークフローについて説明します。このワークフローは、さまざまな毒性実験モデルに容易に適応でき、ハイスループットスクリーニングのためにスケールアップできます。結論として、記載されているプロトコルは、神経毒性の親しみやすく、手頃な価格で、効果的な in vitro モデルを提供し、ライブイメージングにおける特定の遺伝子および経路の役割の試験およびハイスループット薬物スクリーニングに適している可能性があります。

概要

神経疾患の研究には、遺伝的、分子的、および細胞的分析に適した実験モデルが必要です。初代皮質ニューロンは、ニューロンの生存と毒性を研究するための非常に強力なモデルです1,2,3,4。適切な条件下では、初代ニューロンは徐々にシナプス接触を発達させ、成熟ニューロンの特徴を示します。したがって、このモデルは、ニューロンの生理機能をモデル化する上で不死化細胞株よりも信頼性が高く、動物モデルよりも操作に適しています。しかし、細胞株と比較して、初代皮質ニューロンはトランスフェクションが難しく、比較的脆弱です。さらに、皮質ニューロンの複雑な形態は、高密度培養におけるイメージングと分析を複雑にする可能性があります。逆に、低密度の初代ニューロン培養は解析が容易であるが、より脆弱になる傾向がある。

これらすべてを考慮に入れて、この論文では、ニューロンの生存をモデル化および調査するための、手頃な価格で汎用性が高く、スケーラブルな in vitro ワークフローを紹介します(図1)。このプロトコルの要点は、i)蛍光マーカーを用いたニューロンの in vitro エレクトロポレーションの方法であり、生細胞のスパース標識およびイメージングを可能にする方法;ii)細胞毒性のさまざまなモデルでのその汎用性。iii)半自動または自動分析。

エレクトロポレーションシステム(材料表参照)は、キットや特定の溶液を含まないオープンで安価な手順を提供します4,5,6。さらに、この方法は、エレクトロポレーションされた細胞と非エレクトロポレーションされた細胞を混合して、トランスフェクションされたニューロンの最適な形質転換効率と密度を得るために容易に適合させることができます。ナイーブ(非エレクトロポレーション)ニューロンとの共培養は、低密度培養と比較して、エレクトロポレーション細胞の生存率を有意に改善します。さらに、エレクトロポレーションされたニューロンの密度を調整できるスパース標識が可能になり、遺伝子発現のレベルを一定に保ちます。サバイバルアッセイでは、エレクトロポレーションニューロンの3〜5%を目指すことが重要です。

スパースラベリングを使用すると、細胞が十分に分離され、簡単に区別できるため、画像解析の自動化が基本的に促進されます。特に、この実験パラダイムは、異なる細胞質蛍光マーカー(例えば、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(RFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)など)と共エレクトロポレーションされたニューロンを同じウェル内で同時に共培養することにより、目的の複数の遺伝子を試験するように適応させることができる。他の細胞毒性アッセイ(例えば、ヨウ化プロピジウムまたは乳酸デヒドロゲナーゼ)と同様に、本明細書に記載のアッセイは、ニューロン死が細胞膜の破裂を伴うという事実に基づいている。これにより、拡散による細胞質タンパク質の放出が引き起こされ、その結果、GFP蛍光が失われます。

脳卒中のin vitroモデル、すなわちOGDモデルは、神経毒性の例として提示されています7,8,9。このプロトコルでは、一次ニューロンを人工脳脊髄液に似た塩緩衝液にさらす必要がありますが、酸素とグルコースが奪われています。このモデルは神経毒性ストレスの例として提示されていますが、同じワークフロー8,9でさまざまな細胞毒性条件をテストできます。最後に、スパースラベリングにより、自動イメージング分析の開発が容易になります。ここでは、標準的な免疫蛍光法とImageJ分析に基づいて、より小さなセットアップでプロトコールが確立されました。次に、このワークフローは、ミッドスループットおよびハイスループットモードでのライブイメージングでの自動解析を可能にする細胞イメージングシステムを使用して適応およびスケールアップされました。結論として、この論文は、ライブイメージングと自動定量化を使用して、毒性のさまざまな実験モデルでニューロンの生存を研究するための、柔軟で手頃な価格のスケーラブルな方法論を提示します。

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プロトコル

動物を使用するすべての手順は、研究所の生命倫理動物委員会によって監督され、地域の規制に準拠して実施されるべきです。ここに記載されている手順は、委任された当局によって承認され、スペインおよびヨーロッパの規制に準拠しています。

1. 初代神経細胞培養

注:すべてのステップは培養フード内で行われ、無菌状態を維持するために無菌材料と溶液を使用します。

  1. ポリ-L-リジン(PLL)コーティング
    1. カバースリップ(CV、15 mm)を70%エタノールで一晩(o / n)オービタルシェーカーで洗浄します。
      注意: オービタルシェーカーの速度は、CVを穏やかに動かすのに十分である必要がありますが、CVの損傷や引っかき傷を避けるために速すぎないようにする必要があります。特定のRPMは、シェーカーのモデルによって異なります。CVはエタノールで長期間(数ヶ月)保存できます。
    2. エタノールを取り出し、脱イオン水でそれぞれ10分間2回洗浄します。
    3. CVを100mmのペトリ皿(約13CV/プレート)で室温(RT)で乾燥させます。CV が互いに接触したり、プレートの端に接触したりしないようにしてください。
      注:ドライCVはRTで長期間(数ヶ月)保存できます。
    4. 5 mg/mL PLL原液を水で調製し、分注して-20°Cで保存します。 ストック溶液を1x PBSで0.1 mg/mLの使用濃度に希釈します。
      注:最大1 mg / mL PLLの高濃度を試験できます。
    5. CVの表面を覆うように最小体積のPLLを追加します( 表1のPLLの最適体積を参照)。PLL溶液を滴下して、液滴の形成を促進します。
      注:免疫蛍光法には、CVへのニューロンのプレーティングが必要です。タイムラプスイメージング(IN細胞など)では、CVがタイムラプス中に動く可能性があるため、細胞はCVなしでウェル上に直接播種されます。その場合は、各ウェルの表面を覆うように最小量のPLLを追加します。
表面PLL容量(mL)
カバースリップ 15 mm0.2
カバースリップ 13 mm0.18
96ウェルプレート0.07
24ウェルプレート0.3
6ウェルプレート2
60mmプレート4.5

表1:表面積に応じたポリ-L-リジンの最適量。

  1. 37°Cで最低1時間インキュベートします。
    注:潜伏期間はo/nまで長くなる可能性があります。
  2. CVからPLLを取り外し、CVを脱イオン水で2回、それぞれ10分間洗浄します。RTでCVを乾かします。
    注:PLL溶液は、再利用のために4°Cで保存できます(最大3倍)。
  3. 乾燥したCVを4°Cのシャーレ内に保存(最大7〜10日間)するか、めっき培地を入れたウェル内に置きます( 表2 の組成および 表3の作業量を参照)。12ウェルプレートのウェルにめっき培地を直接加えます(表3)。
    注:ニューロンは、ウシ胎児血清(FBS)の品質に非常に敏感です。FBSのさまざまなバッチをテストして、細胞がより健康に見えるバッチを特定する必要があります。良好なロットのFBSが特定されたら、大量に入手して-80°Cで保存することをお勧めします。 このプロトコルは、他のタイプのCVおよびプレートにも適合させることができます( 表3のさまざまな作業量を参照)。
めっき媒体
MEM42.5ミリリットル
10%馬用美容液またはFBS*5ミリリットル
30%グルコース(0,6%最終濃度)1ミリリットル
PS(ペニシリン、10000 U / mL;ストレプトマイシン、10 mg / mL);0.5ミリリットル
エレクトロポレーション媒体
オプティMEM
ニューロン媒体
神経基礎媒体48.5ミリリットル
B-271ミリリットル
グルタマックス 200 mM0.125ミリリットル
PS(ペニシリン、10000 U / mL;ストレプトマイシン、10 mg / mL);0.5ミリリットル
OGDミディアム (Tasca, et al. 2014)
CaCl21ミリメートル
KClの5ミリメートル
NaClの137ミリメートル
KH2PO40.4ミリメートル
Na2HPO40.3ミリメートル
MgCl20.5ミリメートル
MgSO40.4ミリメートル
ヘープス25ミリメートル
NaHCO34ミリメートル

表2:使用したさまざまなメディアの構成。

ウェルとプレートの表面積作業ボリューム
96ウェルプレート0.32センチ20.1ミリリットル
24ウェルプレート1.9センチ20.5ミリリットル
12ウェルプレート3.8センチ21ミリリットル
6ウェルプレート9.5センチ22.5ミリリットル
60mmプレート21.5センチ26ミリリットル

表3:さまざまなタイプのプレートの表面積と作業容積。

  1. 神経細胞培養の準備
    1. プレーティング培地、ニューロン培地、エレクトロポレーション培地(表2の組成を参照)を、細胞インキュベーター内の部分的に開いたボトル内で予温(37°C)し、平衡化(5%CO2雰囲気中)します。トリプシンをRTで温め、1x Hank's Balanced Salt Solution(HBSS)を37°Cのウォーターバスで予温します。
    2. エレクトロポレーションパラメータをプリセットします(表4)。
エレクトロポレーション条件:ポーリングパルス
長さV間ND. 料金極性
2ミリ秒17550210プラス
エレクトロポレーション条件:トランスファーパルス
長さV間ND. 料金極性
502050540プラス/マイナス

表4:NEPA21のエレクトロポレーション設定。

  1. E15 post-coitumにおけるCD-1マウスの脳解剖と回収
    1. 妊娠中の女性を鎮静剤なしで子宮頸部脱臼によって犠牲にします。70%エタノールで腹を滅菌します。鋭利なハサミで腹部を切って開きます。
    2. 子宮を取り出し、冷たい1x HBSSを入れたシャーレに入れます。一般的な鉗子で細胞培養フード内の氷の上に置きます。
    3. 鉗子とハサミの助けを借りて子宮から胚を取り出し、ハサミを使って一回の切り傷で斬首します。
    4. 頭を持って、鉗子(デュモン細鉗子など)を眼軌道に導入します。
    5. 針(30Gニードルシリンジ)を刃物として使用して、ブレグマを切断し、頭部の後部を突き破ります。
    6. 切開部から垂直に鋭い鉗子をブレグマに導入し、前部の皮膚の薄い層を壊します。鉗子を引っ張って、皮質を傷つけることなく、2つの半球の間の縦方向の亀裂をたどります。
    7. 小さな鉗子を前部から後部まで45°の角度で使用して、頭から脳を取り除きます。
    8. 実体顕微鏡下で、氷冷した1x HBSSを入れた3.5cmのシャーレに脳を移します。
  2. 皮質の解剖
    注:ニューロン培養のプロトコルは、DottiとBanker10によって記述された手順から適応されます。
    1. デュモン鉗子(11 cm)を使用して視床を保持し、針を45°の角度に傾けて、各半球の皮質を中脳から分離します。皮質が他の組織の痕跡を示さないようにしてください。鋭利な鉗子を使用して髄膜を取り除きます。
      注:髄膜は脳を包む薄い弾性膜を形成し、赤い色であるため簡単に認識できます。ジグザグに柔らかい動きをすると、髄膜を取り除くのに役立ちます。髄膜は培養に有毒であるため、すべての髄膜が除去されていることを確認してください。
    2. きれいな皮質を氷冷した1x HBSSを入れたきれいな3.5cmのシャーレに移し、氷の上に置きます。
  3. ディスアグリゲーション
    1. 各皮質を2つに切り刻み、鉗子または鋭利な針(30 G)を使用して、次のステップでトリプシンの効果を促進します。
    2. P1000ピペットを使用して、15mLチューブ内の室温で7mLのトリプシン-EDTAバッファーにピースを移します(先端の3〜4mmを切り取ります)。チップの底まで沈むまで待ってから、ピペットチップから放出します。傾けて混ぜます。
    3. 37°Cで12分間、水浴中でインキュベートします。4〜5分ごとに傾けて混ぜます。
      注:インキュベーション時間は12分から15分までさまざまです。
    4. 組織を重力で沈め、トリプシンを慎重に取り除きます。1x HBSSの8 mLでティッシュを2回洗浄し、傾けて穏やかに攪拌します。P1000ピペットを使用し、カットされていないピペットチップを使用して、1x HBSSを慎重に取り外します。
    5. ティッシュを5mLのメッキメディウムで一度洗います。傾けて攪拌します。P1000ピペットを使用して、めっき媒体を慎重に取り除きます。
    6. めっき用培地1.5mLを加えます。P1000ピペットを使用して、チューブの底から培地を吸引し、壁の上に最大8〜12回穏やかに放出することにより、混合物を機械的に分解します。
    7. 50 mLチューブに載せた滅菌セルストレーナー(70 μm)でろ過します。10 mLまたはその他の必要な量のめっき培地をチューブに加えます。
    8. 細胞懸濁液5 μLを細胞計数チャンバーに導入し、トリパンブルー(0.4% w / v)5 μLを添加して、細胞を計数します。
    9. 15 mLの遠心チューブにエレクトロポレーションに必要な数の細胞(例:106 細胞)を持つように、適切な量の細胞懸濁液を移すことにより、細胞をプレート化します(セクション1.6を参照)。細胞を250 × g で5分間遠心分離します。セクション 1.6 に進みます。
  4. めっきセル
    1. ステップ1.5.7の遠心分離されていない細胞懸濁液の所望の密度を、プレーティング培地を含む各ウェルにプレートします。
      注:このプロトコルでは、100,000〜200,000細胞/ウェルを12ウェルプレートに播種しました。参考として、実験条件ごとに少なくとも 3 CV をプレート化して、実験のばらつきを考慮します。一般的な実験設定では、CVあたり4〜5個のフィールドをイメージングする必要があります(たとえば、20倍の対物レンズを使用すると、各フィールドの幅は~1.3 mm2 であると予想されます)。
    2. 細胞培養フード内のプレートをすべての基本方向に動かして、細胞を均一に分布させます。
  5. エレクトロポレーション
    注:他のトランスフェクションシステムを使用することもできます。このプロトコルで使用されるNEPA21システムには、「オープンシステム」であるという利点があります。このプロトコルはユーザーが変更することができ、エレクトロポレーションに使用される特殊なキュベットのトランスフェクションに特定の試薬は必要ありません。このプロトコルは 5から変更されました。
    1. ステップ 1.5.9 から続行します。細胞ペレットを5 mLのエレクトロポレーション培地とともに15 mLチューブに再懸濁します。チューブを250 × gで5分間遠心分離します。
    2. 手順1.7.1を繰り返します。エレクトロポレーション培地で再懸濁し、各エレクトロポレーションキュベットに106 細胞/mLの濃度を得る。キュベット内で細胞を所望量のDNAと混合します。
      注:GFP発現については、100万細胞あたり3μgのプラスミドを使用しました。変動性が高いため、各プラスミドの最適な濃度をテストすることをお勧めします。100万細胞あたり2〜24μgのプラスミドが試験されています。多様なプラスミドを同じキュベットに組み合わせて、ダブルトランスフェクションを行うことができます。同時トランスフェクションの場合、目的の遺伝子をGFPと比較して過剰にトランスフェクションし(例えば、3:1が最適な比率でテストする必要があります)、ほとんどのGFP発現細胞が目的の遺伝子を共発現するようにします。
    3. キュベットをキュベットチャンバーに入れます(図2)。 スタート ボタンを押して、プリセットプログラムを実行します( 表4のエレクトロポレーション条件を参照)。 測定 フレームに表示される電流とジュールの値を記録します。
      注:ユーザーは特定の条件を変更する場合があります。例えば、電圧を下げるとトランスフェクションの効率は低下しますが、ニューロンの生存率は向上します。
    4. キュベットをチャンバーから取り出します。エレクトロポレーション直後に500 μLのめっき培地をキュベットに加え、ピペットを使用してキュベットからサンプルを1.5 mL遠心チューブに移します。
      注:培地の添加が速いほど、エレクトロポレーション後の生存率は向上し、細胞の損傷を回避するのに役立ちます。
    5. 各ウェルに所望の数のエレクトロポレーションセルをプレートします。
      注:12ウェルプレートで20,000〜100,000個の細胞をプレート化します。条件によっては、エレクトロポレーションされた細胞の5〜10%しか生き残れない可能性があります。正確な数は、ユーザーがテストして適応させる必要があります。
    6. 標準条件(37°C、5%CO2、飽和湿度)で2〜4時間インキュベートします。
      注:インキュベーション期間終了後、顕微鏡で細胞を観察します。培養が健康であれば、ほとんどの細胞が表面に付着し、目に見える神経突起伸長部を発芽させ始めているはずです。
    7. プレーティング培地をニューロン培地に変更します(それぞれ 表1 と 表2のボリュームと組成)。
  6. セルの保守
    1. 培地をリフレッシュするには、培地の半分を取り出し、7日間の培養後に等量の新鮮な平衡化済み培地を追加します。
    2. 培養の10日目に、ボリュームの半分をグルタミンサプリメントを含まない新鮮なニューロン培地と交換します( 材料の表を参照)。この手順を 10 日目以降、隔日で繰り返します。
      注:10日間の培養後、細胞は自らグルタミン酸を産生します。

2. 低酸素チャンバーの構築

  1. この目的のために、スクリュー蓋または同等のシーリングシステムを備えた任意の密閉容器を使用してください(図3A)。プラスチック容器の壁に2つの穴を開け、それぞれにプラスチックチューブを挿入します。容器が密閉されるように、それらをシリコンで密封します(図3)。
    注:ここでは、スクリュー蓋付きの円筒形のプラスチック容器(サイズ1リットル)を使用してチャンバーを構築しました。コンテナが実験に必要なCVを収容するのに十分な大きさであることを確認してください。同じスペースでより多くのCVを処理するために、プラスチック製のプラットフォームを互いに積み重ねることができます(図3A)。
  2. バブリングチャンバー(3.2を参照)を準備するには、チューブよりわずかに小さいドリルを備えた標準的な機械式ドリルを使用して、フラスコのキャップに穴を開け、穴からプラスチックチューブをフラスコに挿入します。穴をパラフィルムでシールして、ハーメチックシールを維持します(図3B)。
  3. 容器とフラスコを70%エタノールで滅菌し、紫外線を1サイクル照射してから使用してください。

3.酸素グルコース欠乏症(OGD)

注:OGDのプロトコルは、Tasca et al.7から採用されています。

  1. OGD溶液は、以前に抗生物質を補給したリン酸溶液(表2)で調製します。
    注:35 mmプレートごとに、5 mLを使用します。100 mmプレートの場合は、10 mLを使用します。
  2. バブリングチャンバー内にOGD溶液を追加し(図3B)、ウォーターバス(37°Cで予温済み)の中に置きます。フラスコを窒素源(N2、100%)に接続します。
    注:OGD溶液にはバッファーとしてHEPESが含まれているため、CO2は必要ありません。OGD溶液が重炭酸塩緩衝系に基づいている場合は、5%CO2 および95%N2 を使用して、低酸素溶液とチャンバーを飽和させます。
  3. OGD溶液を穏やかに泡立つ窒素で飽和させます。溶液を軽度の泡立ち状態で20〜30分間放置します。
  4. 直ちにフラスコを細胞培養フードに移し、35 mmプレートに酸素を含まないOGD溶液5 mLを、100 mm培養プレートに10 mLを加えます。
  5. 培養細胞の入ったCVをOGDの入ったプレートに移します。プレートを覆わずに、プレートを低酸素チャンバーに移動し、しっかりと慎重に閉じます。
    注: 手順 3.4 と 3.5 は、できるだけ早く完了する必要があります。インキュベーター内のウェルプレートでコントロールCV(正常酸素中のニューロン培地)を維持します。あるいは、対照ニューロンをグルコース(10 mM)を補充した正常酸素性OGD培地に曝露して、低酸素症とグルコース欠乏の影響をより選択的に調べます。
  6. 窒素システムを低酸素チャンバーに接続し、チューブが開いていることを確認します。チャンバーをN2 で数分間、2〜3バールの圧力で飽和させます(例:2〜3分、1バール= 750mmHg)(図3C)。
    注:複数の時点間で15分間、OGDソリューションを再度バブルすることを忘れないでください。
  7. 窒素圧力を1.3〜1.5バールに下げ、低酸素チャンバーの両方のチューブを閉じます(図3C)。チャンバーをインキュベーターに所定の時間(例:60分)放置し、37°C、5%CO2で放置します。
    注:OGDの期間は、実験条件や研究目標によっては調整が必要な場合があります。短いインキュベーション時間(例:30分)は、軽度の低酸素症をシミュレートします。通常、2時間のOGDはニューロンに対して非常に厳しいものです。研究を開始する前に、45〜90分のOGD期間をテストすることをお勧めします。もちろん、OGDの期間は、OGDから回復した後の全生存期間とニューロン死の相対的な発症に影響を与えます。神経細胞死をリアルタイムで解析することが目標である場合は、OGDからの回復後数時間で細胞死を引き起こすようなOGD状態を達成し、より効果的な解析を行うことを目指します。
  8. チャンバーを開き、CVを元のマルチウェルプレートに移動して回収します。このステップの後、2つの選択肢を検討します:1)小規模な実験の場合は、免疫蛍光および画像解析のセクション4に進みます。2) ハイコンテントスクリーニングの場合は、セクション5に進み、Cell Analyzer(または同等のプラットフォーム)での分析を行います。
    注:ライブイメージングは、さまざまな実験ポイントをリアルタイムでモニタリングできるため、より柔軟なアプローチを提供します。

4. 標準免疫蛍光法およびImageJ法による解析

注意: 回復時間は、条件に応じて1時間から24時間まで異なる場合があります。

  1. ニューロンを1x PBSで10分間洗浄します。
    注:この手順はオプションであり、画像の分析を続行して分析する方法がいくつかあります。
  2. ニューロンを4%パラホルムアルデヒドでRTで10分間固定し、1x PBSで1回の洗浄ごとに10分間3回洗浄します。
    注:パラホルムアルデヒドは有毒であるため、化学フードの下で作業してください。
  3. 0.1%のTriton X-100を含む1x PBSを10分間添加することにより、ニューロンを透過化します。細胞を1x PBSですばやく洗浄します。洗濯のステップを10分間、2回繰り返します。
  4. 350 μLのブロッキング溶液(2%ウシ血清アルブミンを含む1x PBS)をCVに添加し、少なくとも30分間放置します。一次抗体(AB)ストック(5 × g 、30秒)を遠心し、ブロッキング溶液と必要な希釈率(抗GFPなど)で1:600で混合します。
    1. カバースリップを加湿チャンバー(湿度を維持し、蒸発を防ぐために水に浸したティッシュが入った箱)のパラフィルムに移します。CVのサイズに応じて、各CVに希釈した一次抗体60または80 μLを慎重に追加し、細胞が抗体と接触していることを確認します。CVs o/nを4°Cでインキュベートします。
      注意: CV表面全体を覆うように、CV表面に液滴を形成する必要があります。CV上で抗体溶液をピペッティングする際に細胞を乱さないようにし、インキュベーション時間をRTで2時間に短縮することができます。
  5. CVを1x PBSでパラフィルム上で10分間洗浄します。洗濯手順を2回繰り返します。
  6. Alexa 488(1:500)および4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、1:2,000)などの二次ABをブロッキング溶液で希釈します。CVのサイズに応じて、細胞上に二次AB溶液の60〜80μLの液滴を加えます。室温でCVを暗所で1時間インキュベートし、ニューロンから二次ABおよびDAPIを1x PBSで10分間洗浄し、この手順を2回繰り返します。
  7. CVを免疫蛍光分析用の封入剤( 材料表を参照)にマウントし、乾燥後4°Cの暗所で保存します。
  8. 画像のキャプチャと分析。
    注:倒立顕微鏡を使用して、20倍で画像を撮影しました(図4A、 材料の表を参照)。
    1. オープンソースのImageJソフトウェアを使用して画像を分析し、GFPチャンネルのマスクを取得します(図4C)。
      注:ニューロンをイメージングおよび分析する方法は、機器の可用性と実験形式に応じて、いくつかあります。以下のワークフローは、画像内に存在する個々のGFP発現ニューロンの体細胞を同定することを目的とする基本的な例として提供されています。しきい値や粒子サイズなど、ここに示されている特定の値は、ユーザーが特定の実験条件に基づいてテストする必要があります。さらに、異なるフィルターと処理ステップが追加される場合があります。たとえば、ImageJ フィルターの [背景の減算 ] と [ 斑点除去 ] は、多くの場合、処理の開始時に画像のクリーニングに役立ちます。特定の実験条件に対するワークフローの最適化には、画像解析の経験と定量的画像解析の基本概念に関する知識が必要です。画像分析に関する詳細なガイドは現在のプロトコルの範囲外であるため、次のリソースをお勧めします: ImageJ ユーザーガイド、https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/;例とチュートリアルについては、https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm;MBF ImageJバンドル、https://imagej.net/mbf/index.htm。
    2. セグメンテーションには、ニューロンの最も明るい領域である体細胞を分離するために必要なパラメータを持つ Intensity セグメンテーションを選択します。 画像|調整 |しきい値 |最小しきい値の設定 (例: 100) | [適用]をクリックします。
    3. 4.8.2 のしきい値を繰り返します。ニューロンの体細胞のマスク(すなわち、セグメント化された画像)を見るために、すべての画像に(図4E)。
    4. 各画像内の生存セルの数を取得し、結果をスプレッドシートにエクスポートして計算を実行するには、 メニュー |アナライズ |粒子を分析し 、必要なパラメータ値を入力します(例: サイズ:50-無限大ピクセル; 真円度:0.5-1.00)。t = 0 h で、カウントされたセルの数が識別されたセルの総数であると考え、異なる時点で生き残ったセルの割合を計算します。
      注:サイズしきい値が小さいほど、体細胞よりも小さい物体(60〜80μm2など)をフィルタリングするのに役立ちます。
    5. ImageJの マクロ記録 機能を使って、解析を自動化して繰り返す: メニュー |プラグイン |マクロ |レコード |「作成」をクリックして マクロを生成します。

5. IN Cell Analyzer 2200によるリアルタイム解析

  1. 12ウェルプレートをセルアナライザーに挿入し、CO2 システムを接続して、温度を37°Cに設定します。
    注:このステップは、このプラットフォームで簡単にスケールアップでき、96ウェルプレートに播種したニューロンで同様の実験を行います。
  2. 20倍対物レンズを選択し、ウェルごとに5つのフィールド(この例ではウェルの2.33%をカバー)をランダムに選択し、蛍光チャネル(この場合はフルオレセインイソチオシアネート[FITC])ごとに自動的に焦点を合わせます。取得のパラメータを選択します(16時間の30分のタイムラプス)。 [開始 ]を押して待ちます。
    注:イメージングフィールドの数は研究者が決定する必要があり、1つのウェル内の変動性を説明するのに十分である必要があります。
  3. IN Cell Developertoolbox v1.9 を使用して、解析に適したワークフローを設定します。
  4. ニューロン画像(FITCチャネル)を解析して、ニューロンの体細胞のマスクを生成します(図4)。
    注:目的は、画像に存在する個々のニューロンの体細胞を特定することです。この分析は、ImageJ のセクション 4 で説明されている手順と同等の手順に従います。ワークフローと一般的な考慮事項については、セクション 4 を参照してください。強度閾値は、ニューロンの最も明るい領域である体細胞を選択するために決定されます。
    1. セグメンテーションには、必要なパラメータ(この場合は最小しきい値20005.40)を使用して 強度 セグメンテーションを選択します。
    2. 後処理では、 ふるい オプションを選択し、ターゲットを所定の値(ここでは189ピクセル(~80 μm2))より大きい領域に保ちます。
    3. [合計] パラメーターを選択して、マスクで識別されたすべてのニューロン (生存ニューロン) を、時間経過の各時点における井戸の各フィールドおよびすべてのフィールドについてカウントし、合計します。
    4. 結果をスプレッドシートにエクスポートします。t = 0 h で、カウントされたセルの数が識別されたセルの合計であると考え、異なる時点で生き残ったセルの割合を計算します。細胞の50%が死滅する時間を計算して、条件間の比較を容易にします。
      注:セグメンテーションおよび後処理ステップのパラメータは、同定する構造に応じて、異なる蛍光チャネルに対してユーザーが調整する必要があります。

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結果

このプロトコルは、脳卒中の in vitro モデルを確立することを目的としています。適切なニューロン密度を得ることが重要であり、これにより個々のエレクトロポレーションニューロンを認識してそれらを個別に分析することができます。めっき後の神経細胞培養の段階も重要です。培養中のニューロンの成熟は進行的です。成長因子、神経突起伸長、接続性、および電気生理学的活動への依存性は、病期によって大きく異なります。 in vitroで4〜6日のこれらの特定の条件では、神経突起は十分に伸びていますが、ニューロンはまだ非常に未熟で、成長因子に大きく依存しており、電気生理学的活性は比較的低くなっています。この段階では、OGDは胚発生に近い条件をシミュレートする可能性があります。樹状突起スパインおよび明瞭なシナプスクラスターは、 in vitro11 の 8 日目から 10 日目までに観察できます。これらの実験条件下で in vitro で14日目に、皮質ニューロンは成熟し、接続性と電気生理学的活性の完全な複雑さに達しています

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ディスカッション

このプロトコールは、 in vitroで脳卒中をモデル化する効果的な方法を示しています。この目標を達成するために、エレクトロポレーションシステムNEPA215を使用して皮質ニューロンのスパース標識を提案しました。これは、キットや特定のデバイスを使用する他のシステムと比較して、最小限の運用コストでプロトコルをカスタマイズできるオープンシステムです。ナイーブニューロンとエレクトロポレーションニューロンの混合培養は、低密度ニューロン培養と比較して、より高い柔軟性と堅牢性を可能にします。これにより、さまざまな遺伝子、構築物、タンパク質の影響を研究することができ、簡単に拡張できます。例えば、脳卒中4の細胞内シグナル伝達における皮質ニューロンによって発現される神経向性因子であるNrg1の役割を決定するために、同様のアプローチを使用しました。さらに、エレクトロポレーションされた細胞を異なる密度で非エレクトロポレーション細胞と混合して、研究の目的に応じてまばらで調整可能な数...

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開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

Carlos Dotti氏には、神経細胞培養に関する専門知識を共有していただいたことに感謝いたします。また、欧州フェデラーの資金提供を受けているCentro de Investigación Principe Felipe(CIPF)のCytomics Core FacilityのAlicia Martínez-Romero氏にも感謝します。このプロジェクトは、(SAF2017-89020-R)試薬、材料、およびYDCとPFの給与について、スペイン経済競争力省の支援を受けています。CGNとPFは、Generalitat ValencianaのConselleria de SanitatとAGM(ACIF/2019/015)によってサポートされています。アンヘラ・ロドリゲス・プリエトは、スペイン科学・イノベーション・大学省の助成を受けており、助成金PRE2018-083562を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 cmシャーFISHER SCIENTIFIC、S.L.1130-9283
3.5 cm シャーレステリリン
75 cm2 フラスココーニング430641U
B-27ライフテクノロジー17504-044
細胞培養プレートコーニング incorporation Costar®3513
セルインキュベーターサーモエレクトロンコーポレーションモデル371
セルストレーナー 70 & マイクロ;mFalcon352350
コールドライトショット223488KL 1500 LCD
カバースリップ (15 mm)Marienfeld111530
CU500 キュベットチャンバーNepa Gene
CU600 キュベットスタンドホルダーNepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, S. L.D9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Dumont Fine ForcepsFST11254-20
Dumont Fine ForcepsFST11252-00
EC-002S NEPA エレクトロポレーション キュベット、2mm ギャップNepa Gene
Filter ストレーナーFalcon352350
ファイン ハサミ - シャープ - ブラントFST14028-10
ファインハサミ-ToughCut rFST14058-09
GFP チキン IgYAves LabsGFP-10101:600
グルコースシグマ68769-100ml
GlutaMAX-I サプリメント 200 mM 100 mLフィッシャー サイエンティフィ35050-061
HBSSサーモフィッシャー14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 MThermoFisher15630-080
馬 血清Invitrogen26050088
MEMThermofisher11095080https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080
顕微鏡スライド (ポリライジン)VWR631-0107寸法:25 x 75 x 1 mm
Mowiol 4-88Sigma-Aldrich Quimica, S. L.81381-250G
ニードル イエロー、30ゲージBD Microlance™ 3304000
NEPA21 エレクトロポレーターNepa Gene
Neubauer chamberBlau Brand717805
Neurobasal MediumThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
ParafilmコールパーマーPM996
パラホルムアルデヒド(PFA)、95%シグマアルドリッチキミカ、S. L.158127-500G使用溶液:4%
PEIPolysciences23966-1
GFPpCMV-GFP-ires-Cre用プラスミド、Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-LysineSIGMAP2636
PS ( Penicillin, Streptomycin)ThermoFisher15140122
Serrate 鉗子FST11152-10
実体顕微鏡WORLD PRECISION INSTRUMENTS
シリンジBD Plastipak 1ml303176
Triton X-100Sigma-Aldrich Quimica, S. L.MDL番号: MFCD00128254非イオン性
トリプシン-EDTAサーモフィッシャー25300054
チューブ 15 mLフィッシャー05-539-4
チューブ 50 mLVWR21008-242
タッパーウェア--スクリュー蓋付き密閉タッパーウェア。SPバーナー - テーパー1 Lレドンドコンロスカ。同等の密閉型タッパーウェアは、どのスーパーマーケットでも購入できます。
ウォーターバスシェルドンラボラトリーモデル12241641951
レズ ック

参考文献

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  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
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  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

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