方法論記事

ホスト細胞への細菌の付着を自動的に、ハイスループットで検出

DOI：

10.3791/62764

⸱

2021年9月17日

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1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center, 2College of Veterinary Medicine, Texas A&M University

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サマリー

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高スループット蛍光標識イメージングを用いた表形性付着に基づく宿主菌病原体相互作用の検出と、自動化された統計解析法により、宿主細胞との潜在的な細菌相互作用の迅速な評価が可能になります。

要約

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新興細菌病原体の同定は、人間の健康と安全のために重要です。宿主細胞への細菌の付着は、細菌感染に不可欠なステップであり、潜在的な脅威の特徴を構成する。したがって、宿主細胞への細菌の付着を調べることは、細菌の脅威評価の構成要素として使用することができる。宿主細胞への細菌付着を列挙する標準的な方法は、細菌を宿主細胞と共培養し、接着細菌を収穫し、採取した細胞を固体培地にプレートし、次いで得られたコロニー形成単位(CFU)を数える。あるいは、宿主細胞への細菌付着は、免疫蛍光顕微鏡ベースのアプローチを用いて評価することができる。しかし、これらのアプローチを実装するための従来の戦略は、時間がかかり、非効率的です。ここでは、最近開発された自動蛍光顕微鏡ベースのイメージング方法について説明する。高スループット画像処理と統計解析と組み合わせると、宿主細胞に付着する細菌の迅速な定量が可能になります。2つの細菌種、グラム陰性 シュードモナス緑膿菌 およびグラム陽性 リステリア単球遺伝子 および対応する陰性対照を、プロトコルを実証するために試験した。この結果は、このアプローチが迅速かつ正確に付着細菌を列挙し、実験的な作業負荷とタイムラインを大幅に減少させることを示しています。

概要

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細菌接着は、細菌が他の細胞または表面に付着するプロセスです。細菌病原体による感染の確立に成功するには、宿主細胞への接着、組織のコロニー形成、および場合によっては宿主細胞1、2、3の侵入が必要である。最近のCOVID-19パンデミック4、5、6によって証明されるように、新興の感染症は、主要な公衆衛生上の脅威を構成します。重要なことに、新しい病原体または新興病原体は、特に検出を回避するように設計された場合、または病原体として識別するゲノムシグネチャを含まない場合に、ゲノムベースのアプローチを使用して容易に識別できない可能性があります。したがって、宿主細胞への細菌付着のような病原性の特徴を直接評価する方法を用いて潜在的な病原体の同定は、病原体の同定において重要な役割を果たすことができる。

宿主細胞への細菌の付着は、数十年にわたり細菌病態のメカニズムを評価するために用いられてきた。顕微鏡イメージング8、9および細菌コロニー形成ユニット(CFU)10、11、12、13の列挙体は、感染後めっきによる、宿主細胞14の微生物の付着および/または感染を試験するための2つのよく発達した実験室法である。細菌細胞のマイクロメートルスケールサイズを考慮すると、接着性細菌細胞の列挙体は、一般的に高度な高倍率顕微鏡技術の使用と、電子顕微鏡、拡張顕微鏡(ExM)15、拡張顕微鏡検査(ExM)15、16、3次元画像化を含む高解像イメージングアプローチを使用する必要があります。.あるいは、宿主細胞内に結合または内在化された細菌の列挙は、固体寒天上に収穫された細菌の希釈系列をめっきし、得られたCFUs10、12、13を数えることによって行うことができる。この方法は面倒で、多くの手動ステップが含まれており、高スループット分析18、19に必要な標準化されたまたは自動化された手順を確立するのが困難になります。したがって、ホスト セルの添付ファイルを評価するための新しいメソッドの開発は、フィールドの現在の制限に対処します。

ここでは、高スループットの画像処理と統計解析を組み合わせて、自動ハイスループット顕微鏡を使用する方法の1つについて説明します。このアプローチを実証するために、ヒト、動物、植物14,20の日和見グラム陰性細菌病原体である緑膿菌を含むいくつかの細菌病原体を用いた実験が行われ、宿主防御機能障害を有する患者の気道を植民地化することが頻繁に見出される。このアプローチは、これまでの研究14,20に記載された顕微鏡イメージングプロセスを最適化した。蛍光標識された宿主細胞および細菌によって画像検出が単純化され、それらの近接性を迅速に追跡し、顕微鏡の作業負荷を劇的に減少させ、細菌を区別するための高解像度画像を得た。さらに、ホスト細胞および細菌を計数中の画像の自動統計分析は、細菌CFUめっきの手実験に取って代わり、宿主細胞あたりの付着細菌数の比率を推定した。この方法の適合性を確認するために、リステリア単球遺伝子、黄色ブドウ球菌、セレウス属、肺炎のクレブシエラ、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)など、複数の細菌株および宿主細胞タイプも試験されており、その結果、この方法の多様性と有効性を裏付けています。

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プロトコル

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1. A549細胞培養

  1. 10%胎児ウシ血清(FBS)を補充したF-12K培地でA549細胞株を維持し、37°C、5%CO2でインキュベートする。
  2. 3~4日ごとに培地を交換し、85%~95%の合流度で通過します。
  3. 簡単に言えば、リン酸緩衝生理食塩水1個(PBS、pH 7.4、特に指示がない限り)で細胞をすすい、0.25%トリプシン-0.53 mMエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)溶液(細胞層を37°Cで約2分間浸水)で処理する。
  4. 完全な成長培地(F-12K培地+10%FBS)を6 mL追加してプロテアーゼ活性を停止します。次に、細胞を無菌ポリスチレンT-75組織培養フラスコに1:3-1:8のサブ栽培比でプレートします。培養の最終容積は12mLである。
  5. 約1 x 104 A549 細胞(細胞濃度:〜1 x 105 細胞/mL)を、付着アッセイの1日前に96ウェルプレートの各ウェルにシードします。

2. 細菌の増殖と染色

  1. バイオセーフティキャビネット、バイオセーフティレベル2の実験室ですべての細菌の仕事を行います。
  2. P.エルギノーサ(PAO1)、大腸菌、L.モノサイトゲネス、B.サブチリスなどを含むすべての細菌培養物を冷凍グリセロールストックから接種し、トリプティック大豆ブロス(TSB、3 mL)で250rpmで一晩揺動インキュベーターで増殖させる。
  3. 翌日、一晩培養物の1:100希釈を用いてサブカルチャーを接種し、TSB(1mL)で3時間指数相まで成長させ、600nm(OD600)でODを測定し、確認した。OD600が 0.4 ~ 0.6 の範囲であることを確認します。
  4. 細菌宿主の付着アッセイを行う前に、細菌懸濁液のプレートシリアル希釈をTSB寒天プレートに、37°Cで一晩インキュベートし、コロニー数から細菌CFUsを確立する。 P.エルギノーザの場合、1.0のOD600 は2 x 108 の生存可能な細菌細胞/mLに対応し 、L.モノサイトゲネスの場合、1.0のOD600 は9 x 108の 生存可能な細菌細胞/mLに相当する。
  5. 室温(RT)で2分間13,000 x gで遠心分離して指数相で細菌培養物を収穫し、1x PBS(1 mL)を使用して1回洗浄します。1x PBSの1mLで細菌ペレットを再懸濁し、細菌懸濁液のOD600を測定することによって濃度を決定する。例えば、0.5のOD600を有するP.緑素吸皮症は、1 x 108個の細菌細胞/mLの濃度を表す。
  6. 暗闇の中で穏やかな回転で30分間RTで緑色または赤色の蛍光色素を使用して細菌懸濁液を染色します。この場合、500倍の濃縮ストック染色染料を1mLの細菌懸濁液に2μL加え、染料を1倍に希釈します。染色染料を洗い流すために、染色した菌を13,000xgで2分間遠心し、1mLの1mLでペレットを3回再懸濁する。
    注:蛍光-(GFP-、RFP-、mCherry-など)タグ付き細菌が実験で使用されている場合は、この細菌染色ステップをスキップしてください。GFPタグ付き P.緑素吸葉および 赤色蛍光色素染色 L.単球遺伝子 は、このプロトコルで使用された。
  7. 染色された細菌細胞またはGFPタグ付き細菌を13,000 x g で2分間遠心分離して収集します。新鮮なF-12K培地(1mL)で再懸濁し、各培養のOD600 を測定する。感染の多重度(MOI)および宿主細胞濃度に基づいて、所望の濃度に培養液を後で希釈する。この実験で使用した最終容積は500μLです。
    注:例えば、トリパンブルー染色を使用してカウントされた宿主細胞濃度が1 x 105細胞/mLの場合、100のMOIでの細菌細胞の所望の濃度は1 x 107細胞/mLになります。0.5OD600におけるP.緑分化の濃度は1 x 108/mLである。所望の濃度を得るために、P.緑素吸皮化培養を10倍に希釈し、50μLの再懸濁培養液を450μLの新鮮なF-12K培地に加える。

3. 細菌の付着と宿主細胞染色

  1. まず、播種したA549細胞単層を温かい1倍のPBSで3回洗浄する。洗浄ごとに100μLの1x PBSを各ウェルに加え、ピペットを3回上下に軽く加え、1x PBSを処分するか、添加後10秒待ってから1x PBSを取り除きます。細菌の関連の運動を決定するには、異なるMOI(0、1、10、および100)で細菌懸濁液の所望の濃度の100 μLで細胞をオーバーレイします。200 x g で 10 分間細菌をスピンダウンし、感染した A549 細胞を 37 °C でインキュベートし、さらに 1 時間の CO2 を 5% にします。
    注: この実験では、各条件に技術的な三重が付いていました。
  2. 上記のように温かい1x PBSで単層を5回洗浄して非結合菌を除去する。96ウェルプレートのウェルに4%ホルムアルデヒド(1x PBS)の100 μLを加えて細胞を固定します。プレートを氷の上に15分間座らせ、1x PBSを使用して固定溶液を3回洗い流します。
  3. 核を染色するには、4′、6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI)の50 ng/mLを加え、RTで10分間インキュベートします。インキュベーション後、1x PBSを使用してウェルを3回洗浄します。乾燥を避けるために、感染したA549細胞を100 μLの1x PBSで覆います。次のステップのプロセスまたは暗闇の中で最大2日間4°Cでプレートを保存します。

4. 自動蛍光イメージング、処理、解析

  1. データの整合性を維持するには、ランダムに手動で各ウェルの5つの場所を選択し、20倍の倍率で画像をキャプチャします。DAPIおよびGFPチャネルの下で、A549細胞と細菌の蛍光画像をそれぞれキャプチャします。赤色蛍光色素で染色された細菌にはPE-Cy5チャネルを使用してください。
  2. 解像度を高めるには、背景の平坦化とデコンボリューションのすべての画像を処理します。平滑化のためのローリングボールの直径68μmにパラメータを設定し、目的に基づいて画像デコンボリューションの点広がり関数(PSF)を自動測定します。
  3. すべての修飾された細胞および細菌を数えるために、宿主細胞および細菌の蛍光強度を測定し、宿主細胞および細菌の最も弱い蛍光強度を細胞数の閾値として設定する。A549細胞の直径が10.59-14.93 μm21であるため、15μm以内の宿主細胞に近接するすべての細菌を、接着性細菌として数える。
    注:イメージングシステムのデフォルト設定では、直径が5~100μmの宿主細胞と、0.2~5μmの大きさ(幅と長さ)の範囲の細菌を選択的にカウントします。
  4. 上記の手動画像処理結果に基づいて、画像のスムージング、デコンボリューション、オブジェクトサイズ、距離、蛍光強度のパラメータを、残りの自動化画像に適用します。自動分析の後、ホスト細胞の総数、細胞のサイズと形状、総細菌数、最も重要な指標となった宿主細胞あたりの平均細菌数などの重要な読み出しを検討し、細菌の付着を決定します。
  5. データエクスポートと統計分析
    1. すべての画像から分析された結果をスプレッドシートにエクスポートします(例えば、'xlsx'フォーマット)。自動化システムは、2組の結果を生成します: 1) 各画像からの平均付着細菌数;2)各単一宿主細胞の有益なデータは、単一細胞上の付着性細菌数、宿主サイズ、宿主細胞および細菌の平均蛍光強度、対応する画像からである。
    2. すべての画像から付着細菌数の平均数と標準偏差を計算し、負のコントロールと比較して細菌の付着レベルを表します。この方法では、 大腸菌 および B.サブティリス は、それぞれグラム陰性およびグラム陽性細菌付着の試験において陰性対照として機能した。3つの独立した実験のための処置間のデータポイント間の有意な変動をテストするために二方ANOVAを行う。

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結果

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蛍光イメージングベースの細菌付着アッセイを開発するために、P.緑素吸株PAO1およびその陰性付着対応大腸菌を用いてプロトコル有効性を試験し、これらの細菌をA549細胞に付着させたように、14、20、22と報告された。まず、GFP-標識P.緑素吸皮症(PAO1)およびGFP標識大腸菌を、それぞれ様々なMOIでヒト不死化上皮細胞株A549と共培養した。結果は、PAO1が用量依存的な方法でA549細胞に付着したことを示した(図1A、B)。その間、大腸菌の近いヌル付着も検証された(図1A、B)。MOIごとに50枚の画像が撮影され、分析されました。3つの独立した実験からの有意な変動をテスト...

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ディスカッション

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このプロトコルは、ホスト細胞への細菌の愛着を列挙するための自動化されたアプローチを記述します。記載されたアプローチは、従来の方法に比していくつかの魅力的な利点を有する。まず、このアプローチにより、個々の宿主細胞に結合する微生物病原菌細胞の数を正確に定量化することが可能となる。重要なことに、この定量は、面倒な細菌収穫、連続希釈、固体培地上のめっき、およびCFUs10、11、12の決定を必要とせずに行うことができる。そのため、記載された技術は、細菌の付着を定量化するために必要な全体的な作業負荷を軽減します。この方法を調節する変異体またはCRISPRライブラリーにおける細菌または宿主遺伝子の同定を含む大規模スクリーニング実験において、提案されたアプローチの利点が増幅されることを理解すべきである。第二に、蛍光顕微鏡を用いた宿主細胞と細菌細胞間の相互作用の直接評価は、宿主または細菌細胞生存、形態、またはダイナミクスにおける変化を含む細菌病原性の解明機構に関する情...

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開示事項

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すべての著者は、開示する利益相反を持っていません。

謝辞

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バイオテック社のカイテ・ズロトコフスキ博士の技術サポートに感謝しています。この作業は、PdF、国防高等研究プロジェクト庁(DARPA)、およびPdFへの契約番号140D6319C0029の下で内務省に契約番号W911NF1920013の下で国防総省によってサポートされました。情報の内容は、必ずしも政府の立場や政策を反映しているものではなく、公式の支持を推測してはならない。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x PBSVWR45001-130
4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)サーモフィッシャー62248宿主細胞染色色素
96 ウェルプレートコーニング3882ハーフエリアウェル、フラットクリアボトム
A549 細胞ATCC CCL 185哺乳類細胞株
BactoView Live RedBiotium40101バクテリアスタン色素
CentrifugeEppendorf5810R
CFSE cell division trackerBioLegend423801
Cytation 5 BioTekCytation 5 細胞イメージングマルチモードリーダー
大腸菌研究所株 
EGM bulletKitロンザCC-3124HUVEC 細胞培養培地
EHECNIST コレクション
F-12k 培地ATCC 302004A549 細胞培養液
ウシ胎児血清Corning35-016-CV
HUVECLaboratory stock 
L. monocytogenesNIST collections
OD600 DiluPhotometerIMPLEN
P. aeruginosaDr. Lori Burrows laboratory
stock P. aeruginosa & Delta;pilADr. Lori Burrows, laboratory stock
S. agalactiaeNIST collections
S. aureusBEINR-46543
S. aureus ΔsaeRBEINR-48164
S. rubidaeaNISTコレクション
典型的な大豆ブロスGrowcellsMBPE-4040
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参考文献

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  1. Pizarro-Cerda, J., Cossart, P. Bacterial adhesion and entry into host cells. Cell. 124, 715-727 (2006).
  2. Kipnis, E., Sawa, T., Wiener-Kronish, J. Targeting mechanisms of Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Médecine et Maladies Infectieuses. 36 (2), 78-91 (2006).
  3. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: Fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433(2017).
  4. Cabibbo, G., Rizzo, G. E. M., Stornello, C., Craxì, A. SARS-CoV-2 infection in patients with a normal or abnormal liver. Journal of Viral Hepatitis. 28 (1), 4-11 (2021).
  5. Ortiz-Prado, E., et al. Clinical, molecular, and epidemiological characterization of the SARS-CoV-2 virus and the Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), a comprehensive literature review. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 98 (1), 115094(2020).
  6. Chang, C. C., Senining, R., Kim, J., Goyal, R. An acute pulmonary coccidioidomycosis coinfection in a patient presenting with multifocal pneumonia with COVID-19. Journal of Investigative Medicine High Impact Case Reports. 8, (2020).
  7. Woo, V., et al. Microbiota inhibit epithelial pathogen adherence by epigenetically regulating C-type lectin expression. Frontiers in Immunology. 10, 928(2019).
  8. Pandey, A., et al. Global reprogramming of host kinase signaling in response to fungal infection. Cell Host Microbe. 21 (5), 637-649 (2017).
  9. Ding, S., et al. Interactions between fungal hyaluronic acid and host CD44 promote internalization by recruiting host autophagy proteins to forming phagosomes. iScience. 24 (3), 102192(2021).
  10. Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000110(2008).
  11. Qin, Q. M., et al. Functional analysis of host factors that mediate the intracellular lifestyle of Cryptococcus neoformans. PLoS Pathogens. 7 (6), 1002078(2011).
  12. Qin, Q. M., et al. A tractable Drosophila cell system enables rapid identification of Acinetobacter baumannii host factors. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 240(2020).
  13. Pandey, A., et al. Activation of host IRE1α-dependent signaling axis contributes the intracellular parasitism of Brucella melitensis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 103(2018).
  14. Chi, E., Mehl, T., Nunn, D., Lory, S. Interaction of Pseudomonas aeruginosa with A549 pneumocyte cells. Infection and Immunity. 59 (3), 822-828 (1990).
  15. Götz, R., et al. Nanoscale imaging of bacterial infections by sphingolipid expansion microscopy. Nature Communications. 11, 6173(2020).
  16. Lim, Y., et al. Mechanically resolved imaging of bacteria using expansion microscopy. PLOS Biology. 17 (10), 3000268(2019).
  17. Bratton, B. P., Barton, B., Morgenstein, R. M. Three-dimensional Imaging of bacterial cells for accurate cellular representations and precise protein localization. Journal of Visualized Experiments. (152), e60350(2019).
  18. Hoffmann, S., et al. High-throughput quantification of bacterial-cell interactions using virtual colony counts. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8, 43(2018).
  19. Hazan, R., Que, Y. -A., Maura, D., Rahme, L. G. A method for high throughput determination of viable bacteria cell counts in 96-well plates. BMC Microbiology. 12 (1), 259(2012).
  20. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67, 159-173 (2013).
  21. Jiang, R. D., Shen, H., Piao, Y. J. The morphometrical analysis on the ultrastructure of A549 cells. Romanian Journal of Morphology and Embryology. 51 (4), 663-667 (2010).
  22. Farinha, M. A., et al. Alteration of the pilin adhesin of Pseudomonas aeruginosa PAO results in normal pilus biogenesis but a loss of adherence to human pneumocyte cells and decreased virulence in mice. Infection and Immunity. 62 (10), 4118-4123 (1994).
  23. Réglier-Poupet, H., Pellegrini, E., Charbit, A., Berche, P. Identification of LpeA, a PsaA-Like membrane protein that promotes cell entry by Listeria monocytogenes. Infection and immunity. 71 (1), 474-482 (2003).
  24. Ortega, F. E., et al. Adhesion to the host cell surface is sufficient to mediate Listeria monocytogenes entry into epithelial cells. Molecular Biology of the Cell. 28 (22), 2945-2957 (2017).

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Formal Correction: Erratum: Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells
Posted by JoVE Editors on 2/08/2022. Citeable Link.

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The Authors section was updated from:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

to:

Jing Yang1, Qing-Ming Qin1, Erin Van Schaik1, James E. Samuel1, Paul de Figueiredo1,2
1Department of Microbial Pathogenesis and Immunology, Texas A&M Health Science Center
2Department of Veterinary Pathobiology, Texas A&M College of Veterinary Medicine

タグ

A549 Pseudomonas aeruginosa

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