ANSはCa2+-ATPase組換えNドメインに結合する。蛍光スペクトルは、295nmの波長で励起時にFRET様パターンを表示します。TrpのNBS媒介化学修飾は、Nドメインの蛍光を発し、Trp残基とANSとの間のエネルギー移動(FRET)の欠如をもたらす。
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この記事について
サマリー
要約
サルコ/小胞体Ca2+-ATPase(SERCA)は、様々な立体構造で結晶化されたP型ATPaseです。それにもかかわらず、詳細な機能情報は、分離組換えドメインから得ることができる。この組み換えヌクレオチド結合ドメイン(N-ドメイン)は、リガンド結合時に蛍光消光を表示する(Trp552LeuおよびTyr587Trp)。外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、アルグ、ヒス、アラ、ルー、およびPhe残基との静電および疎水性相互作用を介してヌクレオチド結合部位に結合する。ANS結合は、370nmの波長(λ)で励起された場合の蛍光強度の増加によって証明される。しかし、295nmのλで励起すると、蛍光強度の増加は、Nドメイン固有蛍光の急行に結合されるようである。蛍光スペクトルは、フェスター共鳴エネルギー伝達(FRET)様のパターンを示し、Trp-ANS FRETペアの存在を示唆し、Tyr587TrpとANSの間の短距離(〜20Å)によって支持されているように見える。本研究では、N-ブロモスハクイミド(NBS)によって媒介されるTrp化学修飾(および蛍光焼入れ)によるTrp-ANS FRET対の分析について説明する。化学修飾N-ドメインでは、ANS蛍光は295nmのλで励起されると増加し、λ370nmで励起された場合と同様である。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、TrpとANSの間のFRETの不在をプローブするために使用することができる。Trp蛍光がない場合、ANS蛍光の増加を観察すべきではありません。NBSによるタンパク質中のTrp残基の化学修飾は、結合ANSに近いTrp残基間のFRETを調べるのに有用であり得る。このアッセイは、他の蛍光ホルを使用する場合にも有用である可能性が高い。
概要
フェスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質構造および機能研究1、2、3、4における結合または相互作用後の分子構造間の距離を決定するための標準的な技術となっている。P型ATPAでは、FRETはサルコ・エンデュラム・Ca2+-ATPase(SERCA)2、5、6、7、8、例えば、FRET7によってタンパク質全体の構造と機能を調べるのに用いられている。
FRETドナーは多様であり、小さな蛍光(外因性)分子から蛍光タンパク質9,10まで多岐にわたります。トリプトファン(Trp)残基(蛍光による)は、タンパク質アミ....
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プロトコル
1. ANSとSERCA Nドメイン相互作用の決定(インシリコで)
- 好ましいタンパク質モデリングソフトウェア50を用いて分子モデリングによりタンパク質の3次元(3D)構造を生成する。
- 好ましい分子構造ソフトウェア51を用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、ArgおよびLys残基35の存在を決定する。これらは、ANS結合および蛍光強度(量子収率)を増加させるために必要とされる。
- 分子ドッキング(好ましいドッキングソフトウェアを使用して)52、53、54を用いてATP、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(ヌクレオチド結合部位を標識するLys515との共有結合を形成する)と、ヌクレオチド結合部位におけるアミノ酸残基を有するANSとの相互作用を決定する(図1)。
- 好ましいソフトウェアの測定ツールを使用して、Trp残基と結合ANSの間の分子距離(Å)を計算します。
- ANS-N-ドメイン複合体の分子動力学シミュレ....
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結果
分子ドッキングは、静電および疎水性相互作用を介したNドメインのヌクレオチド結合部位へのANSの結合を示す(図1)。Trp残基とANS(ヌクレオチド結合部位に結合)との間の分子距離(20Å)は、FRETの発生をサポートする(図1)。この設計された(設計された)組換えN-ドメインは、アフィニティークロマトグラフィー(図2)により高純度で得られ、蛍光実験に適したものである。ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、λ=295nmでの励起時にFRET様パターンを示した(図3A)。NBSによるTrp残基の化学修飾は、Nドメインの本来の蛍光の焼入れにつながった(図3B)。化学的にNBS修飾Nドメインにおいて、実験結果は、非修飾Nドメインで観察されたのと同様に、Λ=295nm(図3C)での励起時.......
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ディスカッション
ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された場合にFRET様パターンを表示し、一方、Trp残基とANSとの間の分子距離(20Å)はFRETの発生を支持しているようだ(図1)。NBSによるTrp化学修飾は、蛍光Nドメインの低下をもたらす(図3B、スペクトラムf)。したがって、エネルギー転送は不可能です。ANS蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された非修飾Nドメインのスペクトルと類似している(図3A及びC)。
したがって、295nmのλでのANSの直接励起は、ATP結合部位(図3C)に結合する際のANS蛍光の主な供給源であり、これは他の著者28によって提案されたメカニズムと一致している。したがって、Trp残基から結合ANSへのFRETは、N.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
謝辞
この作品は、FAI-UASLP助成金番号C19-FAI-05-89.89およびCONACYT助成金番号316463(アポヨス・ア・ラ・シエンシア・デ・フロンテーラ:フォルタレシミエント・イ・マンテニミエント・デ・インシュタエンストラス・デ・インベスティガシオン・デ・ウソ・コンン・イ・カパシタシオン・テクニツァン)によって部分的に資金提供されました。著者らは、ビデオ版でジュリアン・E・マタ・モラレスの技術的支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アクリルアミド | バイオ・ラッド | 1610107 | SDS-PAGE |
| 過硫酸アンモニウム | バイオ・ラッド | 1610700 | SDS-PAGE |
| 8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸 | シグマ・アルドリッチ | A1028 | フルオロフォア |
| ビスアクリルアミド | バイオ・ラッド | 1610125 | SDS-PAGE |
| N-ブロモスクシンイミド | シグマ・アルドリッチ | B81255 | 化学薬品修飾 |
| N,N-ジメチルホルムアミド | J.T. Baker | 9213-12 | 原液調製 |
| フルオレセインイソチオシアネート | Sigma-Aldrich | F7250 | 化学蛍光ラベル |
| 蛍光キュベット | ヘルマ | Z801291 | 蛍光アッセイ |
| 蛍光分光蛍光計 | 島津 | 製作所 RF 5301PC | 蛍光アッセイ |
| HisTrap™FF | GE Healtcare | 11-0004-59 | タンパク質精製 |
| IPTG、ジオキサンフリー | American Bionalytical | AB00841-00010 | タンパク質発現 |
| イミダゾール | Sigma-Aldrich | I5513-25G | タンパク質精製 |
| LB培地 | フィッシャーサイエンティフィック | 10000713 | 細胞培養 |
| Pipetman L P10L | Gilson | FA10002M | 蛍光アッセイ |
| Pipetman L P100L | Gilson | FA10004M | 蛍光アッセイ |
| Pipetman L P200L | Gilson | FA10005M | 蛍光アッセイ |
| Pipetman L P1000L | Gilson | FA10006M | 蛍光アッセイ |
| Pipetman L P5000L | Gilson | FA10007 | 蛍光アッセイ |
| Precision plus std | Bio-Rad | 1610374 | SDS-PAGE |
| ドデシル硫酸ナトリウム | Bio-Rad | 1610302 | SDS-PAGE |
| リン酸二塩基性 | J.T. Baker | 3828-19 | バッファー調製 |
| リン酸ナトリウム一塩基性 | J.T. Baker | 3818-01 | バッファー調製 |
| シリンジフィルター 0.2 | um ミリポア | GVWP04700 | 溶液ろ過 |
| Temed | Bio-Rad | 1610801 | SDSページ |
| トリス | ・バイオ・ラッド | 1610719 | SDS-PAGE |
参考文献
- Munishkina, L. A., Fink, A. L. Fluorescence as a method to reveal structures and membrane-interactions of amyloidogenic proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1768 (8), 1862-1885 (2007).
- Dong, X., Thomas, D. D.
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再版と許可
