ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。
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この記事について
サマリー
要約
細胞外小胞(EV)は、血小板リセート(PL)などの細胞源に由来する貨物による無細胞治療としての可能性を証明するために、異なる研究で使用されています。治療として使用すると、EVは標的細胞に入り、これらからの応答に影響を与える見込みです。本研究では、変形性関節症(OA)の無細胞治療としてPL由来のEVが研究されている。したがって、EVにラベルを付け、軟骨の外植木への取り込みをテストする方法を設定しました。PL誘導EVは、親油性色素PKH26で標識され、カラムを通して2回洗浄され、ナノ粒子追跡分析(NTA)による粒子定量後5時間 のインビトロ 炎症駆動OAモデルで試験される。毎時、軟骨の外植は固定され、パラフィングされ、6μmのセクションに切断されてスライドに取り付けられ、共焦点顕微鏡で観察されます。これにより、この期間中にEVが標的細胞(軟骨細胞)に入るかどうかの検証と、その直接的な効果の分析が可能になります。
概要
変形性関節症(OA)は、関節軟骨1の細胞外マトリックスの進行性および不可逆的な炎症および破壊を意味する関節変性疾患である。関節炎の様々な形態は、多数の治療法を持っていますが2,3,4,これらは、その副作用と限られた有効性によって制限されています.自家軟骨細胞移植を用いた組織工学技術は、OA初期の軟骨病変における負傷軟骨の再生治療のために日常的に適用される。細胞ベースの治療法は、主に、軟骨3を効果的に修復することができる限られた数の平種安定な軟骨細胞またはチョンドロゲニターのために制限される。したがって、疾患の進行を予防し、大きな軟骨病変を再生するための新しい治療戦略の開発が最も重要である。
細胞外小胞(EV)は、異なる著者5,6によってOAの治療法として提案されている。EVは、細胞型の大部分によって分泌される膜状体であり、細胞間シグナル伝達に関与しており、そして、それらは最近再生医療への....
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プロトコル
注意:軟骨外植は、CEI-IB(IB 3656118 PI)によるプロジェクトの倫理的承認後、機関ガイドラインに準拠したIdISBaバイオバンク(IB 1995/12 BIO)から取得されました。
1. カラムの準備
- 製造元の指示に従って、または次のように列を平衡化します。
- 列のキャップを取り外し、列を平衡にします。溶出によってストレージバッファを取り外します。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)の2.5mLでカラムを3回洗浄します。各洗浄中に、カラムが全容を吸収するのを待ちます。
メモ:カラムを乾かしてはなりません。 - 最後の洗浄後、サンプル調製まで、キャップでカラムを覆います。
2. EVラベリング
注: この EV ラベリング プロトコルは、以前に説明した条件21,22のサイズ除外クロマトグラフィー (SEC) によって分離された PL-EV サンプルを使用します。ただし、任意のソースからの EV サンプルは、このプロトコルで使用できます。
- 濃縮チューブを使用してEVサンプルとコントロール(PBS)を濃縮しま....
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結果
図 1に、EV ラベリングと取り込み監視の概略図の概要を示します。 表1 においてNTAによって検出された粒子濃度およびEVサイズは、カラムで標識した後に2回行った精製工程によるプロセス中にEV濃度が低下することを示す。しかし、得られる量は、処理に使用する粒子数の最適な範囲にある。この粒子濃度は、変形性関節症軟骨外植の治療に使用されるPKH-PL-EVおよび制御の体積を計算するために使用されます。
軟骨外植は、EVまたは対照群で処理されると、異なる期間(0、1、2、3、4、および5時間)に固定されます。各グループは、パラフィン化、スライス、DAPIを含む取り付け媒体と共焦点顕微鏡のために調製されます。各時点の各グループの代表的な画像を 図2に示し、EVが軟骨細胞に到達し、時間の経過とともにそれらを入力するまで、EVがどのように組織に入るかを示しています。
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ディスカッション
EVイメージングは、EVの放出や取り込みメカニズムなどのEV特性を理解するのに役立ちます。彼らのイメージングは、彼らの生体分布の監視と薬物動態特性の薬剤車としての特徴を可能にする。しかし、EVイメージングおよび追跡は、そのサイズが小さいため困難である可能性がありますが、多くのイメージングデバイスおよびラベリング技術は、研究者がin vitroおよびin vivo条件23、24、25の下でEVを監視するのを助けるために開発されています。
光顕微鏡でEVを追跡する場合、生物発光と蛍光イメージングの2つの可能性があります。どちらも可視光スペクトル(390~700 nm)内のEVを検出するために使用されます。生物発光は、ルシファーゼがその基質の酸化を触媒した後に生成される化学発光の一種です。この信号は検出のために超高感度電荷結合デバイス(CCD)カメラを必要とするが、信.......
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開示事項
著者らは開示する利益相反はない。
謝辞
この研究は、ESF欧州社会基金とERDF欧州地域開発基金(MS16/00124)が共同出資する、インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世、エコノミア・イ・コンペティビビダード大臣(MS16/00124;CP16/00124);プログラムによってジュニアデルプロイエクトタレントプラス,コンストラクションイェルドSALUD, ジェネランドヴァロル (JUNIOR01/18), バレアレス諸島の持続可能な観光税によって資金調達;ディレッキオ・ジェネラル・デインベスティガシオ、コンセラーリア・デ・インベスティガシオ、ガリア統治(FPI/2046/2017);FUTURMed内のFOLIUMポスダリックプログラム(FOLIUM 17/01)によって、バレアレス諸島の持続可能な観光税によって50%、ESFによって50%で賄われた。そして、コミシオ・デ・ドチェンシア・イ・インベスティガシオ・デ・ラ・フンダシオ・バンク・デ・サン・イ・テイシッツ・デ・レ・イレス・バリアーズ(CDI21/03)。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| 1.5 mL 遠心分離管 | SPL ライフサイエンス | PLC60015 | |
| 1 mL シリンジ BD Plastipak | BD | 303174 | |
| 2-プロパノール (イソプロパノール) | Panreac AppliChem | 1.310.901.211 | Milli-Q 水 |
| 96 ウェル培養プレート | SPL ライフサイエンスで | 20% で調製 | |
| 無水エタノール Pharmpur | Scharlab | ET0006005P | |
| ウシ血清で 96% および 75% エタノールを調製するために使用されます。アルブミン(BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | PBS |
| 軟骨外植片 | IdISBa バイオバンク | ||
| 濃縮チューブ 15 mL ナノセップ 100 kD オメガ | ポール | MCP100C41 | |
| 濃縮チューブ 500 µL Nanosep 100 kD オメガ | ポール | OD003C33 | |
| カバーガラス 24 x 60 mm | Deltalab | D102460 | |
| DMEM-F12 -GlutaMAX medium | Biowest | L0092 | |
| Dulbecco's PBS (1x) | Capricorn Scientific | PBS-1A | |
| 埋め込みパラフィン組織ブロック | IdISBa Biobank | サービス料金 | |
| Exo-spin mini-HD カラム | 細胞誘導システム | EX05 | |
| フェザー S35 ミクロトームブレード | フェザー | 43037 | |
| フィルトロプール S 0.2 &マイクロ;mシリンジ | フィルターSarstedt | 83.1826.001 | |
| DAPI | シグマアルドリッチ | F-6057 | |
| オンコスタチンMヒューマン | シグマアルドリッチ | O9635-10UG | 0.1 & マイクロの最終濃度にストック溶液を準備します。g/µL PBS-0.1% BSA |
| パラホルムアルデヒド | Sigma-Aldrich | 8.18715.1000 | PBS で 4% で調製し、4 °Cで保存。C |
| ペニシリン-ストレプトマイシン溶液 100x | Biowest | L0022 | |
| PKH26 一般細胞膜標識用赤色蛍光セルリンカーキット | Sigma-Aldrich | MINI26 | PKH26 および Dliuent C 付属 |
| クエン酸ナトリウム二水和物 | Scharlab | SO019911000 | |
| Superfrost Plus 顕微鏡スライド | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| TNF&アルファ; | R&Dシステム | 210-TA-005 | 濃度0.01µのストック溶液を準備します。g/µPBS-0.1% BSA |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Milli-Q 水 |
| Xylene | Scharlab | XI0050005P | |
| EquipmentCentrifuge | |||
| 5430 R | Eppendorf | 5428000210 | F-45-48-11 ローター |
| NanoSight NS300 | マルバーン | NS300 | デバイス&ラムダ;= 532 nmおよびカメラsCMOS |
| Shandon Finesse 325マニュアルミクロトーム | Thermo Scientific&tradeに | ||
| TCS-SPE 共焦点顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | 5200000271 |
参考文献
- Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
- Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, Ł, Szponder, T.
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再版と許可
