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方法論記事

ゼノプス・ラエビス胚の芽球に分泌される成長因子ßファミリー切断産物の分析

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DOI:

10.3791/62782

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2021年7月21日

 , 
1Department of Neurobiology, University of Utah, 2Departments of Neurobiology and Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Hematologic Malignancies, University of Utah, School of Medicine

この記事について

サマリー

変容成長因子ßファミリー前駆体タンパク質が ゼノプス・ラエビス 胚で異所性発現すると、二量体化し、切断され、後期芽胞から早期胃管ステージに至るブラストコエレに分泌される。免疫ブロット解析のためのブラストコア腔から切断産物を吸引する方法について述べている。

要約

Tgfß/Nodalまたは骨形態形成タンパク質(Bmp)リガンドに代表されるトランスフォーム成長因子ß(Tgfß)スーパーファミリーの2つの腕は、それぞれ胚発生および成人恒常性に不可欠な役割を果たす。Tgfßファミリーのメンバーは、小胞体内で二量体化および折り畳む不活性前駆体として作られる。前駆体は、その後、リガンドおよびプロドメイン断片に切断される。二量体リガンドだけがTgfß受容体を関与させ、下流シグナル伝達を活性化することができるが、プロドメイン部分がリガンド活性に寄与するという認識が高まっている。この記事では、Tgfß前駆体タンパク質の活性化中に生成された切断産物を同定するために使用できるプロトコルについて説明します。Tgfß前駆体をコードするRNAは、まず X.ラエビス 胚にマイクロインジェクションされる。翌日、切断産物はガストルラ期胚の芽球体から採取され、ウェスタンブロットで分析される。このプロトコルは、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供します。

概要

トランスフォーム成長因子 ß (Tgfß) スーパーファミリーのメンバーは、非活性で二量体化された前駆体タンパク質として合成されます。前駆体は、分泌経路内または細胞外のプロプロテインコンフォーターゼ(PC)ファミリーのメンバーによって切断される。これは、活性なジスルフィド結合リガンドダイマーと2つのプロドメインフラグメント1を作成する。Tgfßファミリー前駆体のプロドメインが活性リガンド2を生成するために必要とされているのは30年以上前から知られているが、プロドメインがリガンド機能にどのように寄与するかを理解することは不完全である。

Tgfßファミリーメンバーのタンパク質分解活性化のプロセスの理解は不完全なままであるが、どのPCコンセンサスモチーフが生体内で切断されるか、切断が特定の細胞内または細胞外区画で起こるか、そしてプロドメインが切断リガンド3と共有結合的にまたは非共変に関連しているかの理解に関心が高まっている。いくつかの研究は、プロドメインが切断4、5の前にリガンド折りたたみを導くだけでなく、成長因子の安定性と作用範囲6、7、8、9に影響を与え、ホモダイマーまたはヘテロ二量体10の形成を促進し、リガンドを細胞外マトリックスに固定してリガンド遅延11を維持し、場合によっては、アガンドとして機能することを示している。 シグナリング12.Tgfßファミリーの多くのメンバーのプロドメイン内のヘテロ接合点突然変異は、ヒトの眼、骨、腎臓、骨格または他の欠陥に関連している3。これらの知見は、プロドメインが活性リガンドを生成および維持する上で重要な役割を強調し、Tgfßファミリー前駆体のタンパク質分解性成熟中に開発された切断産物の役割を同定し、解読することの重要性を強調する。

ここでは、X.ラエビス胚の芽球からTgfßファミリー前駆体の成熟中に生成された切断産物を吸引し、免疫ブロットで分析するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、前駆体タンパク質の1つ以上のPCコンセンサスモチーフが生体内10、13で切断されているかどうかを判断するために使用され、各モチーフ13、14を切断する内因性PCを同定し、Tgfßファミリーホモダイマー対ヘテロダイマー10の生体内形成を比較するか、またはTgfのヒト疾患関連点突然変異をTgfおよびCgのヒト疾患関連点突然変異をTgfの前駆体に対して分析する。

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プロトコル

記載されているすべての手順は、ユタ大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。カエルはIACUC承認施設に収容されています。オスのカエルは、心臓の心室をクリッピングすることによって続くトリカインに浸漬することによって安楽死させられる。雌のカエルは、卵の採取を可能にするために産卵のホルモン誘導に続いて最大24時間実験室に収容され、その後、ケア施設に戻されます。

1. X.ラエビス 精巣のコレクション

  1. 動物が爪のピンチに反応しなくなるまで、0.2%トリケーヌ(表1)で性的に成熟した男性を30〜40分間麻酔します。
  2. 鈍い鉗子を使用して、皮膚を体壁から引き離します。手術用ハサミを使用して下腹部を横切って皮膚に水平切開を行います。下の体壁に平行な切開を行い、次に肋骨ケージを通して体壁を通して3番目の垂直切開を行います。
    1. 得られたフラップを折り返し、心臓の心室を見つけ、ベースを切り取って興奮させ、死を確実にします。
  3. 鈍い鉗子で腹部から黄色い脂肪体を引き出し、脂肪体の基部の下にある両側の精巣を見つけます。各精巣を取り除き、脂肪体や手術用ハサミを使用して付属の内臓から切り取ります。
  4. 1x修正バースの溶液(MBS)を含むペトリ皿に精巣を移す(表1)。接着性の血管や付属の内臓をすすいで除去します。
    1. 1つの試験を、すぐに使用するために、精巣バッファーを含む35mmペトリ皿(表1)に移し、後で使用するために精巣バッファーで満たされた10 mL円錐形のチューブにもう一方を保管します。精巣は使用しない場合は4°Cで保存する必要があり、少なくとも2週間は生存可能です。
      注: 精巣の分離の写真は、リファレンス 15 にあります。

2. X.ラエビス卵の採取と受精

注意:カエルは、カエルを扱う前と後に洗浄ビニール手袋や手で処理する必要があります。ラテックス手袋、ローション、洗剤残渣は、カエルの壊れやすい皮膚を損傷します。

  1. 産卵前の晩、26G針を装着した1mL注射器を用いて、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(表1)の0.3mL(1200 IU)を2~3匹の成熟した X.ラエビス メスの後部リンパ嚢に注入する。注射ごとに新しい針を使用します。
  2. 注射後、メスを密閉容器(気密ではない)に18°Cの生物学的インキュベーターに入れます。産卵は一般的に14-16時間後に始まる。
    注:蓋に切り取られた空気穴を持つプラスチック製の引き出しやプラスチック容器は、女性を一晩保持するためにうまく機能します。カエルがインキュベーターで逃げ出して乾燥するのを防ぐために、蓋がしっかりとついようにしてください。
  3. 1x MBSを含む100mmペトリ皿の上にメスを保持し、皿に卵を排出するためにカエルの腹部に穏やかな圧力を適用します。
  4. カミソリの刃を使用して精巣の小片(〜1/5)を切り、1x MBSの〜500μLを含む1.5 mLチューブに移します。ペレットの害虫や組織ホモジナイザーでつぶす。得られた精子懸濁液を氷上または4°Cで保管し、その後の受精を同日に行う。
  5. 100 mm のペトリ皿を傾けて、できるだけ多くの 1x MBS を注ぎ、残りをプラスチック製の転送ピペットを使用して取り除きます。約100μLの精子懸濁液を塗布し、0.1x MBSの約1mLを加え、混合するために渦巻く。
    1. 5分後、食器をフッ化した水道水または0.1x MBSであふれさせ、30分間放置します。
      注:水は、フィルターまたは市営水道水を使用してデクロリン化することができ、通常の塩素が水に添加されている領域で塩素が消散できるように、少なくとも24時間放置することができます。クロラミンを添加して飲料水を消毒する地域では、クロラミンを分解できる市販のコンディショナーで水を処理する必要があります。
      注:卵は高塩溶液(1x MBS)で採取され、受精の障壁となるゼリーコートの形成を防ぎます。受精後、低塩溶液(デクリエーション水または0.1x MBS)はゼリーコートの形成を可能にし、卵は互いに付着し、皿に付着します。受精した卵は、色素動物の棒が30分以内に上向きになるように回転します。これが起こらず、卵が顕微鏡の下で健康に見える場合、精子の生存率が疑われ、新しい精巣を収穫する必要があるかもしれません。
  6. 卵を覆う溶液を注ぎ、ペトリ皿に作りたての2%システイン溶液を充填する(表1)。ゼリーコートが溶けて卵が互いや皿にくっついてなくなるまで、皿の中で3〜5分間溶液を旋回させます。
    1. 皿を傾け、慎重にシステイン溶液を注ぐか、プラスチックピペットで取り出します。1x DeBoerの池水に置き換えます(表1)。すすいでデカントするために渦巻く。
    2. DeBoerの溶液(0.1x MBS)で1回の洗浄を繰り返し、0.1x MBSで皿を補充します。ゼリーコートを取り外した後、卵はより壊れやすくなり、空気と液体の界面にさらされてはならない。
  7. 受精卵を16°Cの生物学的インキュベーターに移すか、室温でベンチに置きます。室温で放置すると、受精後1~1.5時間で最初の切断が起こり、その後の切断は約30分ごとに起こります。対照的に、胚が15〜16°Cでインキュベートされた場合、切断はおよそ1時間ごとに起こり、所定のスポーンからより多くの胚を注入することが可能になる。

3. X.ラエビス胚の微小注入

  1. 次の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を加熱し、引っ張ります: 2ステッププル;熱1:67.4°C;熱2:62°C
    注:これらの設定は、ここで使用されるマイクロピペットの引き手とガラスの毛細血管に固有のものです(資料表)。
  2. 解剖顕微鏡の下で、Dumont #5鉗子を使用して端に近い引っ張られた針の先端を切り取ります。針は鋭くあるべきだが、先端が胚に接触したときに曲がるほど薄くはない。 図1 は、マイクロインジェクション(A)のためにクリップされていない適切に引っ張られた針と、クリップされた針(B)の例を示す。
  3. マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに針を挿入します。ニードルホルダーをマイクロマニピュレータに取り付けます。Tgfß前駆体タンパク質をコードする2~4 μLの合成RNAを、分析顕微鏡下の小さなパラフィルム上に置きます。
    1. マイクロマニピュレーターを使用して、針をドロップに下げ、マイクロインジェクターのフィル機能を使用してRNAを針に吸い込みます。針を落下面の下に置き、針に空気を吸い込まないように顕微鏡の下で進捗状況を見守るようにしてください。
      注:分析するTgfß前駆体のプロドメインおよび/またはリガンドドメインを認識する抗体が利用できない場合、エピトープタグ(V5、myc、Flagなど)をコードする配列を、RNA転写のテンプレートとして使用するcDNAにフレーム内に挿入することができます。タグ付きタンパク質の in vivo 生物活性は、エピトープが適切な折り畳み、切断または活性を妨げないように、タグなしタンパク質の生物活性と比較する必要があります。
  4. RNA溶液の滴を空気中に排出し、注入段階または顕微鏡の接眼部に取り付けられたマイクロメータを使用して、落下サイズを測定します。マイクロインジェクタの時間と圧力制御を利用して、ドロップサイズを約10 nLに調整します。
    注:5〜20 ng/μLの範囲のRNA濃度は、各胚に50〜200pgのRNAを送達するのに適しています。この量のRNAは、一般的に10〜20個の胚からの吸引における切断産物を検出するのに十分である。免疫ブロットで検出可能なシグナルを与えるRNAの最低用量を目指すことが最善です。RNAの量が多いほど、ガストルレーション欠陥を引き起こし、ブラストコアの膨張を妨げる可能性があります。
  5. 2-4細胞の段階に達すると、胚を0.1x MBS(表1)の5%Ficollを含む注射皿またはトレイに移動します。底部にナイロンメッシュの一部を取り付けた35mmペトリ皿は、胚を固定し続ける安価な注入皿として役立ちます。動物の棒の近くに針を挿入し、各胚の1つの細胞に10 nLのRNAを注入する。
    注:胚は1つから16の細胞の段階の間のいつでも容易に注入することができる。切断後に胚を注入すると、卵子が受精し、胚が健康であることを保証する。注射の正確な位置は必須ではありません。 X.ラエビス 胚へのRNAの産卵、培養およびマイクロインジェクションのより詳細な説明は、参照15で見つけることができます。
  6. 注入した胚を0.1x MBSで5%フィコールで満たされた35mmペトリ皿に移す(表1)。150 mm のペトリ皿の中に小皿を入れ、ふたでゆるやかに覆って、培養培地が蒸発するのを防ぎます。胚を15〜16°Cで一晩培養する。
    注:Ficollで胚を培養することは、注射部位を癒すのに役立ちます。細かい針を使用する場合、2〜3%Ficollでの培養で十分であるのに対し、見かけの損傷が認められる場合は5%Ficollが好ましい。注射後1〜2時間Ficoll溶液中の胚を保つことは治癒を助けるのに十分であるが、一晩のインキュベーションは、ガストルレーションの発症前に溶液が変化する限り胚に損傷を与えない。

4. Tgfß切断製品のブラストコーレ抽出と分析

  1. 注射の翌朝、Ficoll溶液を取り除き、死んだまたは死んでいる胚を取り除く。0.1x MBSで胚を1、2回リンスし、室温でベンチで0.1x MBSで胚を培養する。
    注:胚は、開発を遅くするために16°Cの生物学的インキュベーターに戻すこともできます。
  2. 次の設定でマイクロピペットプーラーを使用して細かい点にガラスの毛細血管を加熱し、引っ張ります: 2 ステッププル;熱1:67.4°C;熱2:62°C
    注:これらの設定は、ここで使用されるプーラーとガラスの毛管に固有のものです(資料表)。
  3. 解剖顕微鏡の下で、鉗子を使用して引っ張られた針の先端を切り取ります。詰まりを防ぐために、ブラストコア吸引に使用される針の開口部は、マイクロインジェクションに使用される針のそれよりも大きくする必要があります。ブラストコア吸引に使用される良好な引っ張りおよび切り取られた針の例を 図1Cに示す。マイクロインジェクターに接続された針ホルダーに吸引針を挿入し、マイクロマニピュレータに針ホルダーを取り付けます。
    注意:最適な針の直径は試行および誤りによって経験的に決定される。大口径の針はあまりにも速く充填し、細胞の破片が針に入る可能性が高くなります。対照的に、非常に小さい直径の針は詰まる可能性があります。適切な針が生成されると、同じ位置で切り取られた複数の針を生成することが有用です。
  4. 胚は、0.1x MBSで満たされたインジェクショントレイまたは皿に、早期から中期ガストルラ段階(ステージ10-11)に達したときに入れます。
  5. 動物の棒の近くの胚の表面の下に針を挿入します。解剖顕微鏡を見ながらマイクロインジェクターの充填ボタンを押して、針と胚に目を光らせておきます。数秒で、透明な液体のレベルが針で上昇し、胚が崩壊し、凹状になります。
    1. 曇った白質が針に入った場合は、充填ボタンを放し、注入ボタンを1回以上パルスして、プロテアーゼを含む可能性が高い細胞破片で構成される曇った物質を排出します。
      注:ブラストコアが崩壊し、充填ボタンを押すとすぐに細胞デブリが針に入った場合、針の開口部が大きすぎることを示します。ブラストコアレが崩壊しないが、白い物質がすぐに針に入った場合、針が深く挿入されすぎてブラストコエレの床に触れていることを示しています。白い物質を排出し、次の胚に移動します。吸引率は、連続的に押すのではなく、フィルボタンをパルスすることによってより慎重に制御することができます。これは、針の開口部が最適よりも大きい場合に特に重要です。
  6. 10~20個の胚の胚細胞から流体が吸引されるまで、ステップ4.5を繰り返します。
    注:一般的に、10〜20個の胚から吸引されたブラストコエレ液は、イムノブロット上の切断産物を検出するのに十分です。しかし、これは抗体の品質によって異なる場合があり、経験的に決定する必要があります。
  7. 注射トレイにパラフィンを1μL置き、ヌクレアーゼを含まない水をピペット1μLに置きます。水滴の下に針を水に沈め、水にブラストコア液を払拭するために注入ボタンを押してください。
    1. あるいは、流体を直接パラフィルムに排出しますが、この場合は、注入ボタンを押さえるのではなくパルスします。これは、より低い圧力で流体を排出し、パラフィルム上で平らにするのを防ぎ、ピペットで描くのを困難にします。
  8. ブラストコア液を氷上の無菌マイクロ遠心チューブに移します。胚当たり約0.3~0.5μLのブラストコア液を収穫することを期待します。ヌクレアーゼを含まない水を加えて、最終容積を30μLに調整します。
  9. 胚細胞を液体で枯渇させた胚を氷上の別のチューブに移します。過剰な0.1x MBSを取り除き、200μLのチルド(4°C)胚ライセートバッファー(胚当たり10μL)を加える(表1)。胚が完全に均質化され、塊が残らなくなるまで、マイクロピペットを使用して10〜20回胚を上下にピペットします。
  10. 冷蔵マイクロ遠心分離機中の均質化胚を10,000xgで10分間遠心分離する。P200ピペットを使用して上澄み物の160 μLを取り出し、氷上の新しいチューブに移し、チューブの下半分にある白い黄身タンパク質やその他の細胞の破片を避けるように注意してください。
    1. マイクロセントリフィケーションを一度繰り返し、清澄上清の128 μLを氷上の新しいチューブに移します。この時点で、クリアされた胚のライセートおよびブラストコア液は、所望の限り−80°Cで保存することができる。
      注:いくつかの例外を除いて、Tgfß前駆体タンパク質はブラストコアに分泌されず、枯渇した胚のライセートでのみ検出されます。対照的に、Tgfßファミリー切断産物は、主にブラストコア液中に見られる。ほとんどの目的で胚のライセートとブラストコア液の両方を収穫し、分析するのに役立ちます。少なくとも、前駆体が堅牢に翻訳され安定していることを確認するために、正のコントロールを提供します。さらに、異なる野生型または変異体タンパク質間の前駆体と切断産物の相対比を比較し、無傷の前駆体をブラストコア流体に分泌することを可能にする突然変異を同定することを可能にする(例えば、切断せずに適切な折りたたみおよび分泌を可能にするPCコンセンサスモチーフ内の突然変異、その場合は胚と胚体の両方で無傷の前駆体が検出される) 未開皮タンパク質(その場合、前駆体は胚のリセートで検出されますが、切断産物はブラストコア液に存在しません)。
  11. メーカーの指示に従って、この時点でPNGase Fを用いてブラストコア液中に存在するタンパク質を脱グリコシル化します。
    注 これらはPNGase Fによって除去された複雑なN結合オリゴ糖を欠いている前駆体の存在形態である小胞体(ER)を表すので、胚リセートに存在する前駆体タンパク質を脱グリコシル化する必要はない。対照的に、ブラストコアレ流体に存在する切断産物は、炭水化物がさらに改変され、PNGase Fによって除去することができるトランスゴルジネットワーク(TGN)を通過した。脱糖鎖処理に続いて、切断産物はSDSゲルのより緊密に凝縮されたバンドとして移行し、切断産物の可視化、定量化、正確な同定に役立てることができます。これは厳密には必要ではありませんが、例えば、移行パターンに基づいてホモダイマーとヘテロ二量体を区別しようとしている場合や、切断産物に広いファジィバンドとして移行する原因となる異種炭水化物が含まれている場合などに役立ちます。
  12. 4xサンプルバッファー(表1)を15μLのブラストコエイル液に5μL、透明化胚のリセートを15μL加えます。5 μL の非還元 4x サンプルバッファー (表 1) を、残りの 15 μL のブラストコア流体に加えます。100°Cに5分間加熱し、氷の上に置きます。
    注:非還元条件下でタンパク質を分析することは、切断されたホモジメリックまたはヘテロ二量体リガンドの形成を分析するために不可欠ですが、切断部位または切断タンパク質のレベルを分析する場合にのみ必要ではありません。いくつかの例外を除いて、プロドメインフラグメントはモノマーとして分泌されます。さらに、胚ライセートに存在する前駆体タンパク質が主に展開され、ER常駐モノマーが存在する。したがって、非還元条件下でこれらの製品を分析する必要はありません。
  13. 15%SDS/ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により、前駆体タンパク質および切断産物を解決します。
  14. 電気泳動移動を使用して、ゲルからPVDF膜にタンパク質を移管します。
  15. プロドメインとリガンドドメイン(またはそれらのドメインに挿入されたエピトープタグ)を認識する適切な抗体を持つ膜をインキュベートし、適切な二次抗体で洗浄およびインキュベートする。化学発光または蛍光イメージングでタンパク質を可視化します。

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結果

以下に説明する実験の目的は、Bmp4およびBmp7がヘテロダイマー(1つのBmp4リガンドと1つのBmp7リガンドで構成されるダイマー)、ホモダイマー(2つのBmp4または2つのBmp7リガンドで構成される)、またはそれらが Xで 共発現される場合のそれぞれの混合物を決定することであった。 図 2 に示すデータは、以前に発表されたスタディ10から抽出されます。 図2A は、Bmp4またはBmp7ホモジマー前駆体またはBmp4/7ヘテロダイマー前駆体のタンパク質分解性成熟によって生成された切断産物を示す図表である。Bmp4はプロドメイン内の2つの部位で切断され、SDS-PAGEゲル上で〜26kDaで移動する2つのプロドメイン断片(濃い緑色および黄色)および1つの二量体リガンド断片(ライトグリーン)を生成する。Bmp7は、1つの部位で切断され、1つのプロドメインフラグメント(マルーン)と、~35kDaで移動する1つのジメリックリガンドフラグメント(ピンク)を...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルの主な利点は、比較的迅速に完了することができ、高価な試薬を必要とせず、生理学的条件下で濃縮Tgfß切断製品の供給源を提供することです。もう一つの利点は、エピトープタグ付きタンパク質を分析し、ほとんどのTgfßファミリープロドメインを認識する市販の抗体の不足を回避できることです。また、トランスフェクトされた培養哺乳動物細胞におけるエピトープタグ付きTgfß前駆体タンパク質の切断を解析することも可能であるが、X.laevisを用いることはいくつかの利点がある。初期のX.ラエビス胚は、内因性Tgfßコンバーサーゼ(ふれん、Pcsk5、Pcsk6およびPcsk7)13、14、16の候補であるPCファミリーの4つのメンバーすべてを発現する。いくつかの哺乳動物細胞株は、1つ以上のPCを発現せず、切断17を調べるために前駆体タンパク質とそのコン転換体の両方の異...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、優れた動物のケアのためにメアリー・サンチェスに感謝します。著者らの研究は、国立衛生研究所(NIH/NICHD)の国立小児保健人間開発研究所がR01HD067473-08およびR21 HD102668-01を付与し、国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK/NIH)助成金R01DK128068-01によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ß-メルカプトエタノールッシャーAC125470100
ブロモフェノールブルーフィッシャーB392-5
カルシウムフィッシャーC79-500
硝酸カルシウムフィッシャーC109-500
ペレット乳棒/ティッシュグラインダーッシャー12-141-364
モン#5鉗子ファインサイエンスツール11251-10
シ血清アトランタバイオロジカルズS11150H
フィコール400シグマアルドリッチF9378-500G
ガラス毛細管、1 X 90ミリメートルNarshigeG-1
セロールフィッシャーG33-4
HEPESフィッシャーBP310-500
ヒト絨毛剤ゴナドトロピンSigma AldrichCG10-10VL
注射用シリンジ、1 mLフィッシャー8881501368
L-システインSigma AldrichC7352
硫酸マグネシウムフィッシャーM63-500
針、26 Gフィッシャー305111
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco15140148
ピコリットルマイクロインジェクターワーナーインスツルメンツPLI-100A
ピペットプーラー習志毛PC-100
塩化カリウムフィッシャーP217-500
PVDF メンブレンシグマ アルドリッチIPVH00010
重炭酸ナトリウムフィッシャーS233-500
塩化ナトリウムフィッシャーS271-10
ドデシル硫酸ナトリウムフィッシャーBP166-500
酸化ナトリウムフィッシャーS318-500
カイン-SペンテアTRS5
トリスフィッシャーBP152-5
フィ塩化使い捨てフィデュ胎児ウグリ水トリ

参考文献

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