Method Article

エキノコッカス顆粒症のストロビレー化形態の一過性形質導入

DOI:

10.3791/62783

⸱

September 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Student Research Committee, School of Medicine, Kerman University of Medical Sciences, 2Research Center for Hydatid Disease in Iran, Kerman University of Medical Sciences, 3Department of Parasitology and Mycology, Faculty of Medicine, Kurdistan University of Medical Sciences, 4State Key Laboratory for Zoonotic Diseases, Key Laboratory of Zoonosis Research, Ministry of Education, Institute of Zoonosis, College of Veterinary Medicine, Jilin University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、第3世代レンチウイルスベクターを用いた エキノコッカス顆粒症 のさまざまな発生段階における迅速な一過性形質導入技術について記載する。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嚢胞性エキノコックス症または包虫症は、犬の腸内に生息する小さなサナダムシである エキノコッカス・グラニュローサス によって引き起こされる最も重要な人獣共通感染症の1つである。病因や疾患の制御・予防のメカニズムを理解するための応用遺伝学的研究が急務です。しかし、効果的な遺伝子評価システムの欠如は、 エキノコッカス 種を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈を妨げる。本研究は、 顆粒菌のメタセストードおよびストロビレーテッド形態におけるレンチウイルス遺伝子一過性形質導入の可能性を実証する。プロトスコレース(PSC)を胞状嚢胞から単離し、特定の二相性培養培地に移してストロビレー化ワームに発達させた。ワームを、形質導入プロセス制御としてHEK293T細胞と共に回収した第3世代レンチウイルスでトランスフェクトした。ストロビレーテッドワームにおいて24時間および48時間にわたって顕著な蛍光が検出され、 E. granulosusにおける一過性のレンチウイルス形質導入を示した。この研究は、サナダムシにおけるレンチウイルスベースの一過性形質導入の最初の試みを提示し、扁平虫生物学に関する実験的研究における潜在的な意味合いを持つ有望な結果を示す。

Introduction

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嚢胞性エキノコックス症(CE)は、テニイ科1,2科内の小さなサナダムシであるエキノコッカス・グラニュローサスによって引き起こされる最も重要な蠕虫疾患の1つである。顆粒菌の免疫診断およびワクチン開発に関する広範な研究が行われている。しかし、寄生虫生物学の分子基盤に関する不十分な知識は、包虫症の診断、管理、予防に大きな限界をもたらす3,4,5,6。

近年、ゲノムシーケンシングおよびトランスクリプトーム法の開発により、いくつかの研究グループ7、8、9によって扁平虫に関する幅広い分子研究が行われている。しかしながら、寄生虫の世界では、寄生性扁平虫における遺伝子導入技術の進歩は、一部の原生動物に対して開発された再現性の高い一過性形質導入法と比較して依然として限られている

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Protocol

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本研究は、国立研究開発法人医薬研究開発機構および研究倫理審査委員会第958680号により承認されました。レンチウイルスはBSL-2生物として分類される。したがって、このプロトコルのすべての実験室培養手順は、滅菌実験室の実践を使用して実施され、NIHガイドラインに従って層流フードの下で実施された。 図1は 、異なる 顆粒菌 ステージに対する研究プロトコールの概略的提示を示す。

1.包虫嚢胞の収集

  1. 食肉処理場で日常的に屠殺された自然に感染した羊から肝臓の胞子嚢胞を集める。
  2. プロトスコレーシス(PSC)を吸引する前に、滅菌ガーゼと70%アルコールを使用して嚢胞表面を完全に滅菌する。
  3. 20〜50mLの包眠液を吸引して、滅菌された50mLの円錐形チューブに入れる。
  4. 排液後、鋭い刃で嚢胞を拭き取り、胚層を滅菌した50mL円錐形チューブに移し、短時間(〜2分間)振ってPSCの収集を増やす。
  5. PSCをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3~5倍洗浄します。
  6. 0.1%エオジン中のPSCを5分間観察し、光学顕微鏡下でPSCの生存率を決定した。培養に少なくとも95%の生存率を有するPSCを使用する。
  7. PSC沈殿物を2mLのペプシン(2mg/mL、pH2)....

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Results

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ここでは、第3世代レンチウイルスベクターを用いた顆粒菌における迅速かつ効率的な一過性形質導入技術について説明する。我々は、以前に25、26に記載されるように、ストロビレーションされたワームを得るために、二相性培養培地中でPSCsを培養した。プロトスコレックは、インビトロで6週間後にストロビレーテッドワームに発達する。二相性培養培地では、浸潤性PSC(図2A)、浮浪性PSC(図2B)、および第1および第3のプログロチッド形成を伴うストロビレートワーム(図2C-E)を含む、異なる段階のE. granulosusが観察された。プロトスコレックおよび単相性および二相性培養物から得られたストロビレートワームを、それぞれ、GFP発現レン.......

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Discussion

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線虫とプラチヘルミンテス生物学の分子基盤を理解することは、人獣共通感染症の寄生虫の病原性を理解するために不可欠です27。効果的な遺伝子評価システムの欠如は、エキノコッカス種12,27を含むセストード寄生虫の機能遺伝学の直接的な解釈に対する大きな障害である。本研究は、E. Granulousの一過性形質導入におけるレンチウイルスの優れた可能性を実証する。

レンチウイルス形質導入は、一過性形質導入の使用の単純さと速度を安定な細胞株の強い発現と組み合わせ、哺乳動物細胞に導入遺伝子を送達する28。この研究の主な目的は、将来のエキノコックス症研究において重要となるレンチウイルスベクター形質導入のプロセスを説明することでした。
このプロトコルでは、特定の重要な点に注意する必要があります。培養培地中の抗生物質の欠落のために厳格な滅菌ワークフロー.......

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Disclosures

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著者らは、開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgements

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この出版物で報告された研究は、イランのテヘランにある国立医療研究開発研究所(NIMAD)の賞番号958680の下でエリート研究者助成金委員会によって支援されました。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12ウェル培養プレートSPL Life Sciences30012
25 cm2 培養フラスコSPL Life Sciences70325
6ウェル培養プレートSPL Life Sciences30006
塩化カルシウムSigma-AldrichC4901-500G使用濃度: 2.5 mM
CMRL 1066 中サーモフィッシャーサイエンティフィック11530037
CO2 インキュベーターmemmertICO150
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
DMEMLife Technology12100046
犬の胆汁安楽死させた犬から分離され、0.2 μmシリンジ
フィルターEosin YSigma-AldrichE4009-5Gは、作業除外試験のためにEosinの0.1%を準備し
ウシ胎児血清(FBS)DNAbiotechDB9723-100ml熱不活性化 の FBS(40°Cで30分;C)
子牛胎児血清(FCS)DNAbiotechDB9724-100ml熱不活性化 の FCS(40°Cで30分;C)
HEK293T細胞BONbiotechBN_0012.1.14ヒト胚性腎臓 293T
HEPES 緩衝生理食塩水 (HBS)Sigma-Aldrich51558-50ML2x 濃縮物
倒立蛍光顕微鏡OLYMPUSIX51
ペニシリンSigma-AldrichP3032-10MU使用濃度: 100 IU/mL
ペプシンロシュ10108057001使用濃度:2 mg/mL、pH 2
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)DNAbiotechDB0011この試薬は、D.W
ポリブレン(トランスフェクション試薬)Sigma-AldrichTR-1003-G
RPMI mediumBioIdeaBI-1006-05
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)Sigma-Aldrichで 1 分未満で解決します。S5761-1KG
ストレプトマイシンSigma-AldrichS9137-25G作業濃度:100&μ;g/mL
第 3 世代レンチウイルスプラスミド (pCDH513b)SBI System Biosciences (BioCat GmbH)CD513B-1-SBIトランスファーベクター (イラン、マシュハドのイラン学術教育文化研究センター (ACECR) の分子医学研究部門から市販)
3 世代レンチウイルスプラスミド (pLPI および pLPII)Invitrogen (Life Technologies)K4975-00ヘルパーベクター(イラン、マシュハドのイラン学術教育文化研究センター(ACECR)の分子医学研究部門から市販品
第3世代レンチウイルスプラスミド(pMD2G)AddgenePlasmid 12259ベクター(イラン、マシュハドのイラン学術教育文化研究センター(ACECR)の分子医学研究部門から市販品を入手)
Tris/EDTAバッファー(TE)DNAbiotechDB9713-100ml
トリプシンSigma-AldrichT9935-50MG1xワーキングソリューション(pH 7.4–7.6)
ます 第 を入手)ヘルパー

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Deplazes, P., et al. Global distribution of alveolar and cystic echinococcosis. Advances in Parasitology. 95, 315(2017).
  2. Borhani, M., et al. Echinococcoses in Iran, Turkey, and Pakistan: Old diseases in the new millennium. ....

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