フローサイトメトリーを用いたmTORC1-Hyperactive Cellsにおけるマクロピノサイトーシスの定量的評価

サマリー

このプロトコルは、mTORC1-hyperactive cellsによる栄養素(炭水化物およびタンパク質)のマクロピノサイト摂取を評価するための実験ツールを提供します。蛍光標識されたデキストランおよびウシ血清アルブミン(BSA)の取り込みを定量化するための詳細な手順について説明します。

要約

マクロピノサイトーシスは、タンパク質や脂質などの細胞外物質の取り込みを可能にする、高度に保存されたアクチン依存性のエンドサイトーシスプロセスです。増殖細胞では、マクロピノサイトーシスは細胞外栄養素をリソソームに送達し、重要な高分子ビルディングブロックに加工することができます。最近の研究では、乳がん、結腸直腸がん、膵臓がんなど、複数のがんがマクロピノサイトーシスに依存していることが強調されています。Ras変異は、マクロピノサイトーシスの開始の背後にあるドライバーイベントであると考えられており、mTORC1シグナル伝達経路を介して細胞同化プロセスの活性化につながります。興味深いことに、mTORC1はRasとは無関係にマクロピノサイトーシスによっても活性化されます。したがって、マクロピノサイトーシスは、治療上の栄養素へのアクセスを制限することにより、マクロピノサイトーシス腫瘍を標的にするために活用できる代謝の脆弱性を表しています。

結節性硬化症複合体(TSC)およびリンパ管平滑筋腫症(LAM)では、mTORC1の過剰活性化により、マクロピノサイトーシスと代謝リプログラミングが促進されます。ここでは、哺乳類細胞のマクロピノサイトーシスを定量的に評価するためのフローサイトメトリーベースのプロトコルについて説明します。 TSC2欠損MEFが採用されており、mTORC1の異常な活性化を示し、 TSC2発現細胞と比較してマクロピノサイトーシスが増加することが示されています。マクロピノサイトーシスの薬理学的阻害剤で処理した細胞を、蛍光標識、リジン固定可能な70 kDaデキストラン、または蛍光標識したウシ血清アルブミン(BSA)をフローサイトメトリーでアッセイしてインキュベートします。今日まで、 in vitro および in vivoで腫瘍細胞のマクロピノサイトーシスを定量的に評価するための堅牢な画像ベースの技術が開発されてきました。この分析は、複数の実験条件でのマクロピノサイトーシスの定量的評価を提供し、既存の画像ベースの手法を補完します。

概要

マクロピノサイトーシスは、細胞外物質の大量取り込みとそれに続くマクロピノソームの形成に特化したエンドサイトーシスプロセスであり、原形質膜にリサイクルされるか、リソソームと融合して内在化されたカーゴ^1,2を分解します。カーゴの取り込みは非選択的ですが、マクロピノサイトーシスは多段階のプロセスであり、Rab GTPaseと膜リン脂質によって厳密に制御されています^3,4。特に、がん細胞はマクロピノサイトーシスを利用して、タンパク質、多糖類、脂質などの細胞外栄養素を内在化します。がん細胞におけるマクロピノサイトーシスは、特に栄養^{ストレス条件下で、}Rasまたはv-Srcの下流のがん遺伝子によって活性化され、その増殖を支えるメカニズムとして^5,6。したがって、マクロピノサイトーシスは、栄養素の取り込み経路を阻害することにより、がん細胞を標的とするための新しい治療アプローチを表しています^7,8。

結節性硬化症複合体(TSC)お....

プロトコル

1. 細胞治療

1日目

1. TSC2欠損マウスおよびTSC2発現マウス胚性線維芽細胞(MEFs)を、DMEMを用いて6ウェル組織培養プレートの各ウェルに三重に播種し、10%FBSを添加する。細胞は3日目までに60〜70%がコンフルエントになるはずです。
   1. FITC-DextranまたはTMR-BSAで染色されない各薬物状態のための追加のコントロールウェルを播種します。

2日目

2. 培地を慎重に吸引し、室温でPBSで細胞を2回すすぎます。
   1. ビヒクル(DMSO)、100 μMのホスファチジン酸(PA)、25 μMのEIPA、10 μMのリタンセリン、またはPAとリタンセリンの組み合わせで細胞を治療します。1% FBSを添加したDMEMを使用してください。
      注:DMSOの容量は、処理条件で使用される溶媒の最大容量と等しくなければなりません。たとえば、10 μL の EIPA を使用する場合、車両条件での DMSO の容量も 10 μL である必要があります。

3日目

結果

リタンセリンはTSC2欠損細胞のマクロピノサイトーシスを阻害します
我々は以前に、TSC2欠損細胞では、TSC2発現細胞と比較して、栄養素のマクロピノサイト摂取が3倍に増加することを示しました¹⁶。TSCおよびLAMでは、マクロピノサイトーシスはジアシルグリセロールキナーゼα(DGKA)を介して媒介されます。DGKAの代謝産物は、細胞膜の重要な成分であるホスファチジン酸(PA)です。したがって、リタンセリンによるDGKAの阻害は、TSC2欠損細胞のマクロピノサイト小胞輸送に影響を与える可能性があるという仮説を立てました。外因性栄養素のマクロピノサイトート取り込みに対するリタンセリンの役割を決定するために、FITC-デキストラン(0.5 mg/mL、70 kDa)または TMR-BSA(0.5 mg/mL)を使用した取り込みアッセイを実施しました。70 kDaのデキストランが選ばれたのは、このサイズの炭水化物分子.......

ディスカッション

ここでは、フローサイトメトリーを使用してマクロピノサイトーシスを評価するための定量的アプローチについて説明します。この方法により、蛍光標識されたマクロピノサイトカーゴデキストランとアルブミンを正確かつ迅速に測定できます。以前の研究では、共焦点顕微鏡法を用いて癌細胞のマクロピノサイト指数を慎重に特徴付けてきた^15,20。これらの方法は、マクロピノソームの内在化、サイズ、および空間分布を正確に定量化しますが、実験条件ごとに複数の画像を分析する必要があります。対照的に、ここで説明する手法では、複数の実験条件と時点を同時に評価できます。さらに、フローサイトメトリーのアプローチは、内在化されたデキストランの絶対定量を提供し、これは現在の顕微鏡技術に有利です。

マクロピノサイトーシスは動的なプロセスであるため、蛍光標識されたデキストランまたはBSAとのインキュベーション期間は、目的の細胞株ごとに最適化する必要が.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Gibco	11965-092	増殖培地
EIPA (アミロライド)	Sigma Aldrich	A3085	マクロピノサイトーシス阻害剤
FBS	R&Dシステム	ズ S11150	ウシ胎児血清
FITC-Dextran	Invitrogen	D1822	蛍光多糖類 (70kDa)
パラフォルマデヒド	ピアス	28906	固定剤
PBS	Gibco	10010-023	リン酸緩衝液 生理食塩水
ペニシリン/ストレプトマイシン	Sigma Aldrich	P4458-100ML	細胞培養用抗生物質
ホスファチジン酸	Avanti	840101P	卵由来リン脂質
リタンセリン	トクリス	1955	DGKA阻害剤
TMR-BSA	インビトロゲン	A23016	蛍光アルブミン
トリプシン	シグマ アルドリッチ	25300-054	解離剤