光気化したパーフルオロカーボンナノ液滴の定式化と音響変調

Summary

光学的に活性化されたパーフルオロカーボンナノ液滴は、血管系外のイメージングアプリケーションで有望です。この記事では、これらの粒子を合成し、ポリアクリルアミドファントムを架橋し、液滴を音響的に変調して信号を強化する方法を示します。

Abstract

マイクロバブルは、超音波で最も一般的に使用されるイメージング造影剤です。しかしながら、それらのサイズのために、それらは血管区画に限定される。これらのマイクロバブルは、凝縮またはパーフルオロカーボンナノ液滴(PFCnD)として製剤化することができ、それらは浸出するのに十分小さく、次いで標的部位で音響的に誘発される。これらのナノ粒子は、近赤外有機色素またはナノ粒子(例えば、硫化銅ナノ粒子または金ナノ粒子/ナノロッド)などの光学吸収剤を含むことによってさらに強化することができる。光学的にタグ付けされたPFCnDは、光液滴気化(ODV)として知られるプロセスでレーザー照射によって気化することができます。この活性化プロセスにより、画像診断用の最大機械的指数閾値未満では音響的に気化できない高沸点パーフルオロカーボンコアの使用が可能になります。高沸点コアは、気化後に再凝縮する液滴をもたらし、その結果、気化後に一時的にコントラストを生成する「点滅」PFCnDがナノ液滴形態に凝縮します。このプロセスを繰り返してオンデマンドでコントラストを生成できるため、光学変調と音響変調の両方を通じて、バックグラウンドフリーのイメージング、多重化、超解像、コントラスト強調が可能になります。この記事では、プローブ超音波処理を利用して光学的にトリガー可能な脂質シェルPFCnDを合成し、ナノ液滴を特徴付けるためにポリアクリルアミドファントムを作成し、ODV後にPFCnDを音響的に変調してコントラストを改善する方法を示します。

Introduction

マイクロバブルは、軟部組織と比較して生体適合性と優れたエコー源性により、最もユビキタスな超音波造影剤です。これにより、血流、臓器の描写、およびその他のアプリケーションを視覚化するための貴重なツールになります¹。ただし、そのサイズ(1〜10μm)は、共振周波数に基づくイメージングには例外的であり、血管系²への適用を制限します。

この制限により、液体パーフルオロカーボンコアの周りに包まれた界面活性剤で構成されるナノエマルジョンであるPFCnDが開発されました。これらのナノ粒子は、200nmという小さなサイズで合成することができ、腫瘍血管系に見られる「漏れやすい」血管系または細孔および開いた開窓を利用するように設計されています。これらの破壊は腫瘍依存性であるが、この透過性は、腫瘍に応じて~200nm〜1.2μmのナノ粒子の溢出を可能にする^3,4。それらの初期形態では、これらの粒子は超音波コントラストをほとんどまたはまったく生成しない。音響的または光学的に誘導される気化により、コア相は液体から気体に変化し、直径^5,6,7の2.5倍から⁵倍の増加を誘発し、光音響および超音波コントラストを生成します。音響気化は最も一般的な活性化方法ですが、このアプローチでは、気化のイメージングを制限する音響アーチファクトが作成されます。さらに、ほとんどのパーフルオロカーボンは、⁸を気化させるために安全閾値を超える機械的指数を有する集束超音波を必要とする。これにより、マイクロバブルをナノ液滴に凝縮することによって合成できる低沸点PFCnDsが開発されました⁹。しかしながら、これらの液滴はより揮発性であり、自然気化を受けやすい¹⁰。

一方、光液滴気化(ODV)は、ナノ粒子11,12,13や色素6,14,15などの光学トリガーの添加を必要とし、ANSI安全限界¹¹内のフルエンスを使用して高沸点のパーフルオロカーボンを気化させることができる。高沸点コアで合成されたPFCnDはより安定であり、気化後に再凝縮するため、バックグラウンドフリーイメージング¹⁶、マルチプレックス17、および超解像¹⁸が可能になります。これらの技術の主な制限の1つは、高沸点PFCnDが気化後のエコー源性であり、ミリ秒¹⁹のスケールの短い時間枠であり、比較的暗いという事実です。この問題は、気化と平均化を繰り返すことで軽減できますが、液滴信号の検出と分離は依然として課題です。

パルス反転からインスピレーションを得て、持続時間およびコントラストは、超音波画像化パルス¹⁹の位相を変更することによって増強することができる。希薄化相(nパルス)で超音波イメージングパルスを開始することにより、気化したPFCnDの持続時間とコントラストの両方が増加します。対照的に、超音波イメージングパルスを圧縮位相(pパルス)で開始すると、コントラストが低下し、持続時間が短くなります。この記事では、イメージングで一般的に使用される光学的にトリガー可能なパーフルオロカーボンナノ液滴、ポリアクリルアミドファントムを合成する方法について説明し、音響変調によるコントラストの向上と信号寿命の向上を実証します。

Protocol

1.パーフルオロカーボンナノ液滴製剤

1. 10 mLの丸底フラスコをクロロホルムで洗い流し、10 μLと1 mLの気密ガラスシリンジをクロロホルムで洗い流します。
   注意: クロロホルムは揮発性であり、吸入すると有毒になる可能性があります。この溶剤を使ったすべての作業は、ドラフト内で行う必要があります。
2. シリンジを使用して、200 μLのDSPE-mPEG2000(25 mg/mL)、6.3 μLの1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC、25 mg/mL)、および1 mLのIR 1048(1 mg/mLのクロロホルム溶液)を丸底フラスコに加えます。ストックの汚染を防ぐために、脂質/染料の間のシリンジをきれいにすることを忘れないでください。
   注意: 赤外線染料は光に敏感であり、作業は薄暗い状態で行うか、フラスコをアルミホイルで覆う必要があります。
3. ロータリーエバポレーターを利用して溶媒を除去します。衝突を防ぐために、真空がゆっくりと332mbarに調整されていることを確認してください。5分後、圧力を42 mbarに下げて、溶液に入った可能性のある水を取り除きます。
   注:脂質ケーキは、パラフィルムで覆われた丸底フラスコに4°Cで一晩保存できます。
4. 脂質ケーキをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の1mLに懸濁し、室温で5分間、または脂質ケーキのすべてが懸濁して溶液に溶解するまで超音波処理またはボルテックスする。溶液を均質化するためにさらに2分間超音波処理する。
5. 溶液を7 mLのガラスバイアルに移し、バイアルを氷で満たされたガラス皿に入れて溶液を5分間冷ましてから、気密ガラスシリンジを使用して50 μLのペルフルオロヘキサンを加えます。シリンジをバイアルに分注する前に、ペルフルオロヘキサンでシリンジをすすぐことを忘れないでください。
6. 脂質と氷浴を含むガラスバイアルをプローブ超音波処理器の筐体に置き、プローブの先端をミニスカスの下に沈めます。超音波処理器プローブの側面がガラスバイアルの唇に触れないようにしてください。
7. プローブは、次の設定で混合物を超音波処理します:振幅1、処理時間:20秒、パルスオン:1秒、パルスオフ:5秒。次に、次の設定で超音波処理します:振幅:50、処理時間:5秒、パルスオン:1秒、パルスオフ:10秒。
8. ナノ液滴溶液を1.5 mLの遠沈管に移し、300 x g で3分間遠心分離して、大きな液滴(>1 μm)を小さな液滴から分離します。
9. ペレットを廃棄し、上清を別の1.5 mL遠沈管に移します。3000 x g で5分間遠心分離して上清を洗浄し、溶液中のすべての液滴をペレット化します。ペレットを上下にピペッティングして1mLのPBSにPFCnDを再懸濁し、バス超音波処理器で1分間超音波処理します。
10. 動的光散乱(DLS)を使用して液滴のサイズを測定します。ストックPFCnDを100倍(990μLのPBSに10μLのPFCnDストック)で希釈し、測定前にPFCnDを分散させるために浴超音波処理する。代表的な結果を 図1に示す。
11. ナノ粒子追跡分析装置を使用してPFCnDの濃度を決定します( 材料の表を参照)。PFCnDを100〜1000倍希釈して、濃度を正確に測定できるようにします。このプロトコルでは、通常、10¹⁰ 粒子/mL程度の濃度で液滴を生成します。
12. 50 mLの遠心チューブに10 mLの超音波カップリングゲルを調製し、1%(v / v)または100 μLのPFCnDを加えて、~10⁸ 粒子/ mLの溶液を作ります。混合する溶液を渦巻きます。混合物を4000 x g で3分間遠心分離して気泡を除去します。

2.ポリアクリルアミドファントム製剤

1. 500 mLの真空フラスコに400 mLの脱イオン水を満たして水を脱気し、ゴム製のコルクで密封し、フラスコを真空ラインに接続します。真空ラインを開き、フラスコの底をバス超音波処理器に沈めます。5分間、または気泡の形成が見られなくなるまで超音波処理します。
2. 500 mgを5 mLの脱気水に溶解して、10%過硫酸アンモニウム(APS)溶液を調製します。過硫酸アンモニウムが完全に溶解しない場合は、溶液を静かに回転させます。
3. 攪拌プレート上に攪拌子を付けた400 mLビーカーに、150 mLの脱気水と50 mLの40%(w / v)アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を加えて、200 mLの10%アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液を形成します。混合物を200rpmで攪拌して、気泡を導入せずに適切に混合できるようにします。
   注意: アクリルアミドは発がん性物質であり、特に粉末状のアクリルアミドを使用する場合は、すべての作業は手袋付きのドラフトフードで行う必要があります。
4. 400 mgのシリカを計量し、ステップ2.3の10%アクリルアミド-ビスアクリルアミド溶液に加えて、0.2%(w / v)のシリカとアクリルアミド溶液を形成します。
   注意: シリカを吸入すると発がん性物質になる可能性があります。計量を含むすべての作業は、ドラフト内で行う必要があります。
5. プラスチック製トランスファーピペットから先端を切り取り、ラボテープで金型に支えて、円筒形の介在物を備えた58 mm x 58 mm x 78 mmの正方形の金型を準備します。 図2を参照してください。
6. ビーカーに2 mLの10 % APS溶液を加えて最終濃度を0.1% APSにし、250 μLのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)をファントム溶液に加えます。溶液を短時間(1分未満)攪拌します。
7. 溶液に気泡を入れないように注意しながら、溶液を型にすばやく流し込みます。溶液は10分以内に重合するはずです。ラボスパチュラの平らな端を金型の端に巻き付け、金型を反転させて、ファントムを取り外します。
   注意: これらのファントムは複数回再利用できるため、水に浸して4°Cで保管する必要があります。

3. パーフルオロカーボンナノ液滴イメージング

1. メーカーの指示に従って、パルスレーザーシステムの電源を入れ、~20分間ウォームアップします。光ファイバーバンドルがレーザー出力に正しく接続され、2本の脚がファイバーバンドルホルダー内に正しく配置されていることを確認します。
2. 超音波イメージングシステムの電源を入れ、アレイイメージングトランスデューサ(L11-4v)をシステムに接続し、トランスデューサをホルダー内に固定して、イメージング面をレーザー断面に合わせます。
3. レーザーシステムのパルス繰り返し周波数を10Hzに設定し、ファイバーバンドルの端にパワーメーターを配置してエネルギーを測定します。推定フルエンスが70 mJ/cm²になるまでqスイッチ遅延を調整します。
   注意: レーザーを発射するときは適切な眼鏡を着用し、レーザーカーテンがスペースを囲む必要があります。
4. 1 mLのプラスチックスリップチップシリンジを使用して、ポリアクリルアミドファントムのチャネルの1つを超音波ゲル/ PFCnD混合物で埋め戻します。チャネルの上部を超音波ゲルで自由に覆い、1 mLのプラスチックスリップチップシリンジで気泡を取り除きます。 図3に示すように、ポリアクリルアミドファントムをトランスデューサとファイバーバンドルの下に配置します。
5. ソフトウェア²⁰ に基づく複合レーザ超音波および弾性(CLUE)イメージングプラットフォームを使用して、光学活性化と同期したPFCnDを画像化する。イメージング用の Param 構造体の一般的なユーザー定義パラメータを変更します:開始/終了深度を0 / 40mmに、中心周波数を6.9MHzに、探触子名を「L11-4v」に設定します。
6. 新しい RunCase を定義し、PFHnDの繰り返し光学活性化/再凝縮およびUSイメージングのためのモジュールシーケンスを設計します。これは、超高速イメージング(mUF)、外部レーザー(mExtLaser)、アイドル(mIdle)などの事前定義されたモジュールをリストすることによって行われます。
   1. シーケンスセット mExtLaser-mIdle-mUF-mExtLaser-mUF を2回繰り返して、nパルスとpパルスの両方のイメージングデータを取得します。
      注意: 各シーケンスの最初のmExtLaserモジュールは、ExtLaser.Enableを0に設定することにより偽レーザーとして設定され、レーザーアクティベーション後の背景US画像とn/pパルスUS画像の間の時間を最小限に抑えるために「mIdle」が含まれています。
7. 現在の実行ケースのモジュールシーケンスに配置された各モジュールのモジュールパラメータを設定します。各モジュール パラメーターには、モジュール シーケンスの順序に対応するインデックスでアクセスします。モジュールは、ユーザーがここで設定したモジュールパラメータを使用して事前定義された操作を実行します。
   1. 外部レーザーモジュールの ExtLaser.QSdelayを、手順3.3 で調整したレーザーQスイッチ遅延の値をマイクロ秒単位で設定します。このモジュールは、レーザーシステムのフラッシュランプトリガーが出力されるのを待ち、 QSdelayで指定された遅延の後にQスイッチトリガーを生成します。
   2. 超高速イメージングモジュールでは、 Resource.numFrame を100に設定し、 SeqControl.PRI を200(μs)に設定し、 TW.polarity をPパルスの場合は1、Nパルスの場合は-1に設定します(対応するパルス形状については 図4 を参照してください)。このモジュールは、 TW.polarityで指定されたパルスタイプの超高速0度平面波を送信します。
      1. Resource.numFrameのフレーム数、SeqControl.PRIのパルス繰り返し間隔に対して38.8mm幅のフルアパーチャイメージングウィンドウを取得し、オフライン処理用のデータを保存します。
   3. アイドル・モジュールの SeqControl.lastPRI_Module を、レーザー・パルスからQスイッチ遅延を差し引いた時間(100ms)、画像データ・アクイジション時間(20ms)、および信号が伝わる20μsのマージンに設定します。このモジュールは、イメージングデータ取得の終了から次のレーザーパルス励起までの時間ギャップを埋めるために 、システムをSeqControl.lastPRI_Module 時間「動作なし」状態に保ちます。

Results

PFCnDの製剤化と遠心分離が成功すると、直径200〜300 nmのサイズの液滴が得られるはずです(図1A)。不適切に分離された液滴は、1μm付近に小さなピークを示すことがあります。これらの溶液は、より大きな液滴を分解するためにさらに浴超音波処理することができる。液滴のサイズは、オストワルド熟成^21,22として知られるプロセスでの合体および/または拡散により、時間とともに増加します(図1B)。

イメージングパルスを操作することによる液滴の音響変調は、気化したPFCnDのコントラストを改善した。これは、ビーム形成画像の隣接するフレームを差し引いて再構成されたPFCnD画像で実証され、気化したPFCnDから返された信号のみが可視され、静止したバックグラウンド信号が抑制されます。コントラストは、平均バックグラウンド信号に対する円形包接領域の平均信号と平均...

Discussion

プローブ超音波処理は、PFCnDを作製するための比較的簡単で習得しやすい方法です。注意が必要ないくつかのステップがあります。クロロホルムを取り扱う際には、揮発性であり、標準的な空気置換ピペットから「漏れる」ため、容積式ピペットまたはガラスシリンジを使用することが不可欠です。さらに、正の変位を使用する場合は、クロロホルムがほとんどのプラスチックチップを溶解し、溶液に汚染物質を導入する可能性があるため、適切なチップが使用されていることを確認してください。ペルフルオロヘキサンには、揮発性で水よりも密度が高いため、容積式ピペットまたはガラスシリンジも推奨されます。通常、揮発性と高密度の個々の影響は、空気置換ピペットで事前に湿潤し、スケールを使用してピペットに設定された容量をそれぞれ調整することで低減できます。しかし、両方の特性を持つパーフルオロヘキサンの場合、揮発性により正確な重量測定値を得ることが困難になるため、容積式ピペット/ガラスシリンジが最も実行可能な選択肢になります。

プローブ溶液を超音波処理する前に、超音波処理中にパーフルオロカーボンを沸騰させないように冷却するために、氷浴中で...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
過硫酸アンモニウム(APS)	VWR	97064-592
1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)	Avanti Polar Lipids	850365C	脂質、これらはクロロホルムまたは粉末の形で懸濁して購入できます。長期保存には粉末状が最適ですが、クロロホルムの方が実用的です。
1,2-ジステアロイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (DSPE-PEG)	Avanti Polar Lipids	880120C	脂質、これらはクロロホルムまたは粉末の形で懸濁して購入できます。長期保存には粉末状が最適ですが、クロロホルムの方が実用的です。
アクリルアミド:ビサアクリルアミド溶液(19:1)40%(w / v)、OmniPur®	VWR	EM-1300	アクリルアミド溶液、低濃度/粉末
IR-1048	グマ	405175	赤外線染料
L11-4v	Verasonics	-	超音波リニアアレイトランスデューサ
チップ1/8 "	Qsonica LLC	4418	超音波発生器用マイクロチップ
N、N、N′、N′-テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)	VWR	97064-902	硫酸アンモニウムの存在下でフリーラジカルを形成することによりポリアクリルアミドを重合するために使用されます
Nova II	Ophir-Spiricon	7Z01550	レーザーパワーメーター
パーフルオロヘキサン	フルオロメッド	APF-60M	パーフルオロカーボン液体
リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)錠	VWR	97062-732	PBS
Q500	Qsonica LLC	の製造に使用される錠剤Q500-110	プローブ超音波処理装置
シリカゲル	Sigma-Aldrich	288500	2-25 μm粒径
Tempest 30	New wave research	-	パルスレーザーシステム
Vantage 128	Verasonics	-	研究用超音波イメージングシステム
Zetasizer Nano ZS	Malvern Instruments Ltd	-	動的光散乱に基づいてサイズ測定を行います