方法論記事

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

DOI：

10.3791/62818

⸱

2021年8月19日

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

この記事について

サマリー

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光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。

要約

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誘導可能な遺伝子発現系は、生物学的プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。光遺伝学的発現系は、誘導剤として光を用いた遺伝子発現タイミング、位置、振幅を精密に制御できる。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成するために光遺伝学的発現系が用いられる。このシステムは、細菌 E.リトオラリスからの自然発生する光活性化転写因子に基づいてTAELと呼ばれる設計された転写因子に依存する。青色光で照らされると、TAELは二量体化し、C120と呼ばれるその同結合調節要素に結合し、転写を活性化する。このプロトコルは、ユビキタス ubb プロモーターの制御下でTAEL転写因子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用する。同時に、C120調節エレメントは、蛍光レポーター遺伝子(GFP)の発現を駆動します。青色光を活性化するシンプルなLEDパネルを使用して、GFP発現の誘導は、最初に30分後の照明の後に検出することができ、3時間の光処理後に130倍以上の誘導のピークに達します。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)および蛍光顕微鏡法により評価することができます。この方法は、光遺伝学的遺伝子発現のための多目的かつ使いやすいアプローチです。

概要

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誘導可能な遺伝子発現システムは、遺伝子発現量、タイミング、位置を制御するのに役立ちます。しかし、多細胞生物の空間的・時間的制御を正確に行うのも困難でした。時間制御は、最も一般的には、低分子化合物1 またはヒートショックプロモーター2の活性化を加えることによって達成される。それでも、どちらのアプローチもタイミング、誘導強度、およびオフターゲットのストレス応答の問題に対して脆弱です。空間制御は、主に組織特異的プロモーター3の使用によって達成されるが、このアプローチは、常に利用可能ではない適切なプロモーターまたは調節要素を必要とし、サブ組織レベルの誘導を助長しない。

このような従来のアプローチとは対照的に、光活性化光遺伝学的転写活性化剤は、遺伝子発現の空間的および時間的制御を細かくする可能性を有する。青色の光応答性TAEL/C120システムは、ゼブラフィッシュ胚5,6での使用に最適化された。このシステムは、細菌由来の細菌E.リソラリス7,8からの内因性光活性化転写因子に基づいている。TAEL/C120システムは、TAELと呼ばれる転写活性化剤で構成されており、これは、カル-TA4トランスアクティベートドメイン、青色光応答性LOV(光-酸素電圧センシング)ドメイン、およびらせん旋回らせん(HTH)DNA結合ドメイン5を含む。照射されると、LOVドメインは、2つのTAEL分子が二量体化し、TAEL応答性C120プロモーターに結合し、対象となる下流遺伝子の転写を開始することを可能にする立体構造変化を受ける5,8。TAEL/C120システムは、毒性を最小限に抑えた迅速かつ強い誘導を示し、いくつかの異なる光送達モダリティによって活性化することができます。最近、TAEL/C120系の改良は、核局在化シグナルをTAEL(TAEL-N)に加え、C120調節要素をcFos基底プロモーター(C120F)に結合させることによって行われた(図1A)。これらの改変は、誘導レベルを15倍以上6倍に改善した。

このプロトコルでは、TAEL/C120システムを活性化し、レポーター遺伝子GFPのユビキタス発現を誘導するために、シンプルなLEDパネルが使用されます。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)を用いて転写レベルを測定することにより、蛍光強度を観察するか定量的に観察することにより、定性的にモニタリングすることができる。このプロトコルは 、In vivoでの遺伝子発現の堅牢な調節を可能にする、多目的で使いやすいツールとしてTAEL/C120システムを実証する。

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プロトコル

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この研究は、カリフォルニア大学マーセド校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。

1. ゼブラフィッシュの交差と胚のコレクション

  1. TAEL転写活性化剤またはC120制御レポーター遺伝子のいずれかを含む別々のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを維持し、スプリアス活性化を最小限に抑えます。
  2. TAELとC120成分の両方を含む二重トランスジェニック胚を生成するために、標準的な方法9を使用して各ラインから6〜8個の成体ゼブラフィッシュを渡る(図1B)。
    注:あるいは、両方の成分は、標準的な方法10を用いてmRNAまたはプラスミドDNAのマイクロインジェクションを通じて一過性に発現することができる。
  3. 卵水(蒸留水に溶解した60μg/mLインスタントオーシャン海塩)を含むペトリ皿に胚を収集し、テストする条件ごとに約30個の胚をテストします。
  4. 防光ボックスに皿を置くか、アルミホイルで覆い、周囲光による意図しない活性化を最小限に抑えます( 表1参照)。

2. グローバルな光誘導

  1. 青色光(465 nm)のLEDパネルを使用して、一度に複数の胚に青色光を活性化します。
  2. 胚を含むペトリ皿に対してLEDパネルを配置して、胚が受け取る光の実際の電力が光パワーとエネルギーメーターで測定される約1.5mW/cm2になるように配置する(図2A)。
  3. TAEL転写活性化剤5,8への光損傷のリスクを低減するために3時間以上照らす場合は、タイマーリレーを使用して1時間/1時間の間隔で光をパルスする。
    注: イルミネーションの正確な持続時間は、特定のアプリケーションに合わせて最適化する必要があります。このプロトコルでは、30分、1時間、3時間、および6時間の照射持続時間の例が提供される。
  4. ペトリ皿の蓋を取り外して、結露による光の散乱を最小限に抑えます。
  5. コントロール胚を含むペトリ皿を防明箱に入れるか、暗いコントロールのためにアルミホイルで覆います。

qRT-PCRによる誘導の定量的評価

  1. 目的の活性化持続時間の後に、胚を照明から除去します。
  2. キットの指示に従ってRNA分離キットを使用して、30-50光活性化および30〜50個の暗い胚から総RNAを抽出します。
    1. 胚を1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移し、余分な卵水を取り除きます。リシスバッファーを追加し、プラスチックの害虫で胚を均質化します。
    2. ライセートをキット提供のコラムに移し、キットの指示に従います。直ちにステップ3.3に進むか、-20°C〜-80°Cで精製されたRNAを保存する。
  3. キットの指示に従って、cDNA合成キットを使用してcDNA合成に1 μgの総RNAを使用します。
    1. 薄肉の0.2 mL PCRチューブを取り、5x cDNA反応マスターミックス(最適化されたバッファ、オリゴdTおよびランダムプライマー、およびdTPsを含む)の4μLにRNAの1μgを加え、20倍逆転写酵素溶液の1μL、およびヌクレアーゼを含まない水を20μLの総体積に加えます。
    2. チューブをプログラムしたサーモサイクラーに、22°Cで10分間、42°Cで30分間、85°Cで5分間、4°Cで保持します。 直ちにステップ3.4に進むか、-20°CでcDNAを保存します。
  4. SYBRグリーン酵素マスターミックス、5倍希釈cDNA(ステップ3.3)、およびGFP用各プライマーの325 nMを含むqPCR反応を調製する。
    注: このプロトコルで使用するプライマーは次のとおりです。GFPフォワード:5'-ACGACGGCAACTACAAGCACC-3';GFP逆: 5'-GTCCTTTTGAAGTCGATGC-3';ef1aフォワード5'-カッグガカカキャットGCTGag-3';ef1a逆: 5'-CAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCAT-3')。
  5. リアルタイム PCR マシンで qPCR 反応を実行します。
    注:PCRプログラム:最初の活性化は95°Cで10分、95°Cで30s、60°Cで30s、72°Cで1分の40サイクルが続きます。
  6. PCRが完了したら、溶融曲線解析を行い、反応特異性を決定します。各サンプルに対して 3 つの技術的な複製を実行します。
  7. 光活性化誘導を、2-ΔΔCt 法11を用いて、暗に保たれた胚に対するフォールド変化として計算する。統計的有意性は、統計ソフトウェアパッケージで決定することができます。

4. 蛍光顕微鏡による誘導の定性的評価

  1. 活性化の所望の持続時間の後に、照明から胚を除去する。
  2. ガラスうつ病スライドで0.01%トリカインを含む3%メチルセルロースでイメージング用の胚を固定化する。
  3. 標準GFPフィルタ設定を使用して、デジタルカメラに接続された蛍光体顕微鏡で蛍光画像と明視野画像を取得します。すべてのサンプルに同一の画像取得設定を使用します。
  4. 取得後の明視野画像と蛍光画像を画像処理ソフトウェアとマージします。

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結果

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このデモンストレーションでは、C120応答性GFPレポーターライン(Tg(C120F:GFP)ucm107)がユビキチンb(ubb)プロモーター(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)からTAEL-Nをユビキタスに表現するトランスジェニックラインと交差し、両方の要素を含む二重トランスジェニック胚を生成しました。24時間受精後、胚を青色光を活性化させることに曝され、1時間オン/1時間オフの頻度でパルスした。GFP発現の誘導は、30分、1時間、3時間、および6時間の後活性化時のqRT-PCRにより定量した(図2Bおよび表1)。暗い状態に保たれた対照兄弟胚と比較して、青色光暴露後30分でGFP発現の誘導が検出された。GFP発現のレベルは、その後、着実に6時間の後の活性化まで増加し続けた。

GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した(...

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ディスカッション

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このプロトコルは、光遺伝学的TAEL/C120系を用い、青色光誘導性遺伝子発現を達成することを説明する。このシステムは、青色光で照明時に二量体化し、C120調節要素の下流の対象遺伝子の転写を活性化する転写活性化剤TAELで構成されています。GFPレポーターの誘導発現は、わずか30分の光暴露後に検出することができ、このアプローチは比較的速く応答性の高い動態を有することを示唆している。

いくつかの要因は、誘導レベルに影響を与えることができます。最も重要なのは、光を活性化する波長とパワーです。このプロトコルでは、1.5 W/cm2で配信される 465 nm の LED ライトが使用されました。短波長と長波長(それぞれ紫と緑の光)と低光パワーは、効果的に発現を活性化しません(データは示されていません)。一方、より多くの光パワーは、胚を光損なうリスクを高める。したがって、TAELシステムの使用を成功させるためには、活性化光は(1)可視光スペクトルの青色範囲で、(2)TAELの有効活性化と光損傷リスクの軽減のバランスを取るのに十分な電力でなければなりません。有効光パワーは...

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開示事項

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利益相反は宣言されませんでした。

謝辞

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ステファン・マテルナとウーとマテルナの研究室のメンバーに、このプロトコルに関する有益な提案とコメントに感謝します。アンナ・リード、ケビン・ガードナー、ローラ・モッタ・メナに感謝し、このプロトコルを開発しながら貴重な議論と洞察を得た。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金によって支えられた。R03 DK106358)とカリフォルニア大学がん研究調整委員会(CRN-20-636896)からS.W.

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
BioRender ウェブベースの科学イラストレーションツールBioRender
https://biorender.com/ カラー CCD デジタルカメラLumenara755-107
コンパクトパワーおよびエネルギーメーターコンソール、デジタル 4 インチ LCDThorlabsPM100D
励起フィルター、545 nmオリンパスET545/25x
illustra RNAspin Mini キットGEヘルスケア95017-491
インスタント オーシャン シー ソルトインスタント オーシャンSS15-10
MARS AQUA 調光可能 165 W LED アクアリウム ライト (青と白)アマゾンB017GWDF7E
メチルセルロースSigma-AldrichM7140
NEARPOW プログラマブル デジタル タイマー スイッチアマゾンB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR グリーン ファスト ミックスQuantabio101414-286
Photoshop画像処理ソフトウェアAdobe
Prismグラフ作成および統計ソフトウェアGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステムApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 蛍光LED光源エクセリタス010-00326R販売終了X-Cite mini+に置き換えられました

参考文献

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  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), Cambridge, England. 1953-1960 (2000).
  3. Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
  4. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
  5. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), Cambridge, England. 345-355 (2017).
  6. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  7. Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry. 51 (50), 10024-10034 (2012).
  8. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  9. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  10. Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
  11. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), San Diego, Calif. 402-408 (2001).
  12. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  13. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), Cambridge, England. (2020).
  14. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738(2012).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), Cambridge, England. (2019).

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