Method Article

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

DOI:

10.3791/62818

⸱

August 19th, 2021

 , 
1Department of Molecular Cell Biology, University of California

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

光遺伝学は、幅広いアプリケーションを備えた強力なツールです。このプロトコルは、青色の光応答性TAEL/C120系を用いてゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成する方法を示している。

Abstract

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誘導可能な遺伝子発現系は、生物学的プロセスを研究するための非常に貴重なツールです。光遺伝学的発現系は、誘導剤として光を用いた遺伝子発現タイミング、位置、振幅を精密に制御できる。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚における光誘導性遺伝子発現を達成するために光遺伝学的発現系が用いられる。このシステムは、細菌 E.リトオラリスからの自然発生する光活性化転写因子に基づいてTAELと呼ばれる設計された転写因子に依存する。青色光で照らされると、TAELは二量体化し、C120と呼ばれるその同結合調節要素に結合し、転写を活性化する。このプロトコルは、ユビキタス ubb プロモーターの制御下でTAEL転写因子を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を使用する。同時に、C120調節エレメントは、蛍光レポーター遺伝子(GFP)の発現を駆動します。青色光を活性化するシンプルなLEDパネルを使用して、GFP発現の誘導は、最初に30分後の照明の後に検出することができ、3時間の光処理後に130倍以上の誘導のピークに達します。発現誘導は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)および蛍光顕微鏡法により評価することができます。この方法は、光遺伝学的遺伝子発現のための多目的かつ使いやすいアプローチです。

Introduction

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誘導可能な遺伝子発現システムは、遺伝子発現量、タイミング、位置を制御するのに役立ちます。しかし、多細胞生物の空間的・時間的制御を正確に行うのも困難でした。時間制御は、最も一般的には、低分子化合物1 またはヒートショックプロモーター2の活性化を加えることによって達成される。それでも、どちらのアプローチもタイミング、誘導強度、およびオフターゲットのストレス応答の問題に対して脆弱です。空間制御は、主に組織特異的プロモーター3の使用によって達成されるが、このアプローチは、常に利用可能ではない適切なプロモーターまたは調節要素を必要とし、サブ組織レベルの誘導を助長しない。

このような従来のアプローチとは対照的に、光活性化光遺伝学的転写活性化剤は、遺伝子発現の空間的および時間的制御を細かくする可能性を有する。青色の光応答性TAEL/C120システムは、ゼブラフィッシュ胚5,6での使用に最適化された。このシステムは、細菌由来の細菌E.リソラリス7,8から....

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Protocol

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この研究は、カリフォルニア大学マーセド校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)の承認を得て行われました。

1. ゼブラフィッシュの交差と胚のコレクション

  1. TAEL転写活性化剤またはC120制御レポーター遺伝子のいずれかを含む別々のトランスジェニックゼブラフィッシュラインを維持し、スプリアス活性化を最小限に抑えます。
  2. TAELとC120成分の両方を含む二重トランスジェニック胚を生成するために、標準的な方法9を使用して各ラインから6〜8個の成体ゼブラフィッシュを渡る(図1B)。
    注:あるいは、両方の成分は、標準的な方法10を用いてmRNAまたはプラスミドDNAのマイクロインジェクションを通じて一過性に発現することができる。
  3. 卵水(蒸留水に溶解した60μg/mLインスタントオーシャン海塩)を含むペトリ皿に胚を収集し、テストする条件ごとに約30個の胚をテストします。
  4. 防光ボックスに皿を置くか、アルミホイルで覆い、周囲光による意図しない活性化を最小限に抑えます( 表1参照)。

2. グローバルな光誘導

  1. 青色光(465 nm)....

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Results

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このデモンストレーションでは、C120応答性GFPレポーターライン(Tg(C120F:GFP)ucm107)がユビキチンb(ubb)プロモーター(Tg(ubb:TAEL-N)ucm113)からTAEL-Nをユビキタスに表現するトランスジェニックラインと交差し、両方の要素を含む二重トランスジェニック胚を生成しました。24時間受精後、胚を青色光を活性化させることに曝され、1時間オン/1時間オフの頻度でパルスした。GFP発現の誘導は、30分、1時間、3時間、および6時間の後活性化時のqRT-PCRにより定量した(図2Bおよび表1)。暗い状態に保たれた対照兄弟胚と比較して、青色光暴露後30分でGFP発現の誘導が検出された。GFP発現のレベルは、その後、着実に6時間の後の活性化まで増加し続けた。

GFP誘導はまた、活性化後のポイントと同時に蛍光強度を調べることによって定性的に評価した(.......

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Discussion

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このプロトコルは、光遺伝学的TAEL/C120系を用い、青色光誘導性遺伝子発現を達成することを説明する。このシステムは、青色光で照明時に二量体化し、C120調節要素の下流の対象遺伝子の転写を活性化する転写活性化剤TAELで構成されています。GFPレポーターの誘導発現は、わずか30分の光暴露後に検出することができ、このアプローチは比較的速く応答性の高い動態を有することを示唆している。

いくつかの要因は、誘導レベルに影響を与えることができます。最も重要なのは、光を活性化する波長とパワーです。このプロトコルでは、1.5 W/cm2で配信される 465 nm の LED ライトが使用されました。短波長と長波長(それぞれ紫と緑の光)と低光パワーは、効果的に発現を活性化しません(データは示されていません)。一方、より多くの光パワーは、胚を光損なうリスクを高める。したがって、TAELシステムの使用を成功させるためには、活性化光は(1)可視光スペクトルの青色範囲で、(2)TAELの有効活性化と光損傷リスクの軽減のバランスを取るのに十分な電力でなければなりません。有効光パワーは.......

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Disclosures

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利益相反は宣言されませんでした。

Acknowledgements

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ステファン・マテルナとウーとマテルナの研究室のメンバーに、このプロトコルに関する有益な提案とコメントに感謝します。アンナ・リード、ケビン・ガードナー、ローラ・モッタ・メナに感謝し、このプロトコルを開発しながら貴重な議論と洞察を得た。この研究は、国立衛生研究所(NIH)からの助成金によって支えられた。R03 DK106358)とカリフォルニア大学がん研究調整委員会(CRN-20-636896)からS.W.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
BioRender ウェブベースの科学イラストレーションツールBioRender
https://biorender.com/ カラー CCD デジタルカメラLumenara755-107
コンパクトパワーおよびエネルギーメーターコンソール、デジタル 4 インチ LCDThorlabsPM100D
励起フィルター、545 nmオリンパスET545/25x
illustra RNAspin Mini キットGEヘルスケア95017-491
インスタント オーシャン シー ソルトインスタント オーシャンSS15-10
MARS AQUA 調光可能 165 W LED アクアリウム ライト (青と白)アマゾンB017GWDF7E
メチルセルロースSigma-AldrichM7140
NEARPOW プログラマブル デジタル タイマー スイッチアマゾンB01G6O28NA
PerfeCTa SYBR グリーン ファスト ミックスQuantabio101414-286
Photoshop画像処理ソフトウェアAdobe
Prismグラフ作成および統計ソフトウェアGraphPad
qScript XLT cDNA SuperMixQuantabio10142-786
QuantStudio 3 リアルタイムPCRシステムApplied BiosystemsA28137
StereomicroscopeOlympusSZX16
トリカイン(3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸)Sigma-AldrichE10521
X-Cite 120 蛍光LED光源エクセリタス010-00326R販売終了X-Cite mini+に置き換えられました

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
  2. Halloran, M. C., et al.

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Optogenetic Gene ExpressionLight Induced ExpressionZebrafish EmbryosTAEL C120 SystemGFP ExpressionBlue Light ActivationFluorescence MicroscopyQuantitative PCRInducible Expression SystemTransgenic Zebrafish

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