免疫組織化学のための合成抗原コントロール

サマリー

この研究は、免疫組織化学のための合成抗原コントロールを作成する簡単な方法を文書化しています。この技術は、広範囲の濃度で様々な抗原に適応可能である。サンプルは、アッセイ内およびアッセイ間の性能と再現性を評価するための基準を提供します。

要約

免疫組織化学(IHC)アッセイは、タンパク質発現パターンに関する貴重な洞察を提供し、その信頼性の高い解釈には、十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルが必要です。適切な組織または細胞株コントロールが常に利用できるとは限らないため、合成IHCコントロールを作成する簡単な方法が有益であり得る。このような方法をここで説明する。これは、タンパク質、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを含む様々な抗原タイプに、広範囲の濃度で適応可能である。このプロトコルは、様々な診断的に関連する抗体によって認識されるヒト赤芽球性癌遺伝子B2(ERBB2/HER2)細胞内ドメイン(ICD)からのペプチドを例として用いて、合成抗原コントロールを作成するために必要なステップを説明する。ウシ血清アルブミン(BSA)溶液中のHER2 ICDペプチドの段階希釈物をホルムアルデヒドと混合し、85°Cで10分間加熱してペプチド/BSA混合物を固化および架橋する。得られたゲルは、組織のように処理、切片化、および染色することができ、広範囲の染色強度にまたがる既知の抗原濃度の一連のサンプルを生じる。

この単純なプロトコルは、日常的な組織学ラボ手順と一致しています。この方法は、ユーザが所望の抗原の十分な量を有することのみを必要とする。関連するエピトープをコードする組換えタンパク質、タンパク質ドメイン、または直鎖状ペプチドは、局所的または商業的に合成され得る。社内抗体を生成するラボは、免疫抗原のアリコートを合成制御標的として予約することができます。幅広い濃度にわたって明確に定義されたポジティブコントロールを作成する機会により、ユーザーは実験室内および実験室間のアッセイ性能を評価し、アッセイのダイナミックレンジと直線性に関する洞察を得て、特定の実験目標に合わせてアッセイ条件を最適化することができます。

概要

免疫組織化学(IHC)は、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片における標的抗原の高感度かつ特異的で空間的に正確な検出を可能にします。しかし、IHC染色結果は、温冷虚血時間、組織固定、組織前処理、抗体反応性および濃度、アッセイ検出化学、および反応時間¹を含む複数の変数によって影響を受ける可能性がある。したがって、IHC反応の再現性のある性能および解釈には、これらの変数の厳密な制御、および十分に特徴付けられた陽性および陰性対照サンプルの使用が必要である。頻繁に使用される対照には、目的抗原を発現するために独立した分析から知られているパラフィン包埋組織または培養細胞株が含まれるが、そのようなサンプルは必ずしも利用可能ではない¹。さらに、組織および細胞株対照における標的抗原の発現レベルは、一般に定性的にのみ理解され、可変であり得る。再現可能で正確に既知の濃度の標的抗原を含むコントロールは、IHC反応条件の最適化を支援することができます。合成IHC対照試料を作成するために生理学的に関連する濃度範囲で様々な抗原タイプに適応可能な一般的な方法が、著者^ら2によって記載されている。ここでは、このタイプの標準の作成と使用のための詳細なプロトコルを提供しています。

適切なコントロールは、IHCアッセイ¹

プロトコル

1. 原液・工具の調製

1. 50 mL の円錐形チューブ中で 5 g の BSA 粉末を 14 mL の PBS、pH 7.2 に混合して、20 mL の 25% w/v BSA 溶液を調製し、均一に分散します。必要に応じてボルテックスはBSA粉末を分散させる。
   1. 溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、25%w/vの原液を作ります。
2. 6.26 g BSA 粉末を 13 mL の PBS、pH 7.2 に 50 mL の円錐管に入れて均一に分散するまで混合して、20 mL の 31.3% w/v BSA 溶液を調製します。溶液を4°Cで一晩保ち、完全に溶解させる。PBSで最終容量を20 mLに調整し、31.3% w/v のストック溶液を作ります。
3. ヒートブロックを85°Cに予熱します。
   注:以下のプロトコルは、1.5mLの微量遠心チューブで形成された容量1.26〜1.4mLのペプチド/BSAゲルを作成します。より小さな容量を使用するには、例えば、抗原ストックが制限されている場合、PCRチューブでゲルを調製し、ヒートブロックとして85°Cに設定したサーモサイクラーを使用する。
4. BSA/ホルムアルデヒド混合物が、700 μL の 25% BSA 溶液と 700 μL の 37% ホルムアルデヒドを混合することによって、期待どおりにゲルを形成することをテストします。5〜10秒以内に....

結果

ペプチドは、光学的に透明な溶液を形成するために、室温で適切な溶媒に完全に溶解すべきである。目に見える粒状物質が30〜60分後にまだ存在する場合、 表1で計算された5倍のペプチド原液の意図された体積を超えない元の溶媒または代替溶媒の追加体積を追加することが有用であり得る。同様に、ペプチド/BSAを組み合わせた溶液は半透明のままでなければなりません(図1A)。

ペプチド/BSAゲルサンプルは、37%ホルムアルデヒドで加熱した後、不透明なゴム状の塊を形成するはずです(図1B-I)。ゲルサンプルの軽微なフラクチャリングは、微量遠心チューブからの取り出し中に起こり得る(図3A)。これらは、後続の手順を妨げてはなりません。パラフィン包埋ゲルサンプルは、裂け目やチャタリングすることなくスムーズに切断する必要があります。.......

ディスカッション

この方法により、ユーザーは、ほとんどの組織学研究所で使い慣れた材料と技術を使用して、IHC反応の標準として既知の組成と抗原濃度の均一なサンプルを作成できます。最も重要なステップは、目的の抗体が結合するエピトープを特定することです。このプロトコルは、ERBB2/HER2 ICDからの線状ペプチド抗原の使用を記載している。同じプロトコールを使用して、オリゴヌクレオチド、蛍光標識、タンパク質ドメイン、または完全長タンパク質を含むBSAゲルを形成することができる。この後者のアプローチは、単一の線状ペプチド配列によって再作成されない立体構造エピトープに結合する抗体にとって有用であり得る。例えば、マウス、ラット、ウサギの0.1 mg/mLナイーブIgGを含むBSAゲル標準物質をプロセスコントロールとして使用して、二次検出および染色ステップが期待どおりに機能したことを確認することができます。

ここで説明する抗原-BSAゲル法は、IHC反応を制御および標準化するための他の技術を補完するものです。標的抗原の発現レベルが十分に特徴付けられた細胞株および組織サンプルは、十分に制御されたIHCプロトコル<.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗HER2/neuクローン 4B5	ベンタナ	5278368001
生検ラップ	ライカ	3801090
ウシ血清アルブミン、超高純度	細胞シグナル技術	BSA #9998
50 mL コニカルチューブ	コーニング	352070
使い捨てベースモールド (15 mm x 15 mm)	フィッシャー	22-363-553
使い捨てベースモールド (24 mm x 24 mm)	Fisher	22-363-554
使い捨てスパチュラ	VWR	80081-188
Eppendorf Thermomixer	Eppendorf	22331
37% ホルムアルデヒド	電子顕微鏡 Sciences	15686
ERBB2 / HER2 ペプチド			UniProt P04626-1; a.a. 1240-55
ライカ オートステイナーXL	ライカ	ST5010
マグネティックスターバー
ナノズーマー 2.0 HT ホールスライドイメージャー	浜松
10% 中性緩衝ホルマリン	VWR	16004-128
ヌクレアーゼフリーマイクロフュージチューブ 1.5 mL
パラプラストパラフィン	ライカ	39601006
ペプチドパラメータ計算機	Pep-Calc17	https://www.pep-calc.com/
ペプチドサプライヤー	ABclonal Science		のユーザーは、質量、純度、コストの詳細についてペプチドベンダーにお問い合わせください。
	Anaspec ペプチド		のユーザーは、質量、純度、およびコストの詳細については、ペプチドベンダーにお問い合わせください。
	CPC Scientific		のユーザーは、質量、純度、およびコストの詳細についてペプチドベンダーにお問い合わせください。
	ニューイングランドのペプチド		ユーザーは、質量、純度、およびコストの詳細についてペプチドベンダーに連絡する必要があります。
リン酸塩緩衝生理食塩水 pH 7.2
試薬 アルコール	Thermo Scientific	9111
片刃カミソリ	VWR	55411-050
スーパーフロスト プラス 正に帯電した顕微鏡スライド	Thermo Scientific	6776214
TMA Tissue Grand Master	3DHISTECH
Xylenes	VWR	89370-088